同所性ラット前肢移植

サマリー

ここでは、ラット前肢移植の顕微手術の実現可能性を実証するためのプロトコルを紹介します。このモデルは、VCA研究の重要なトランスレーショナルプラットフォームとして機能する可能性があります。

要約

血管新生複合同種移植(VCA)は、皮膚、筋肉、骨、神経など、複数の組織タイプの移植を伴い、重度の外傷性損傷や外観障害のある患者に有望な再建オプションを提供します。VCAは、その変革の可能性にもかかわらず、移植片の拒絶反応、慢性的な免疫抑制合併症、神経筋の回復の複雑さなど、大きな課題に直面しています。

私たちは、これらの課題に対処するための費用対効果が高く、解剖学的に関連性のあるプラットフォームとしてラット前肢モデルを利用しています。ラットの前肢は、人間の四肢の解剖学的構造を密接に反映しており、今回の知見の並進的影響を高めている。以前の研究では、このモデルが機能回復を確実かつ再現性よく測定できることが検証されており、それにより、前肢移植片の拒絶反応を評価するための重要なツールとして確立されています。

さらに、このモデルは、革新的な治療アプローチを探求し、新しい保存技術の優れたトランスレーショナルプラットフォームとして機能する貴重な機会を提供します。このモデルのさらなる研究を通じて、移植片拒絶反応と神経筋回復の背後にあるメカニズムの理解を深めることを目指しています。最終的に、この研究は、移植医療における現在の制限と将来の課題の両方に対処し、VCAの臨床転帰を改善するための道を開くことを目指しています。

概要

血管新生複合同種移植術(VCA)は、重度の組織欠損を再建するための人生を変える手術です。VCAとは、皮膚、筋肉、骨、結合組織、血管、神経からなる複合組織の移植を指します。VCA技術のさらなる改良と探求は、外傷や外観の損傷に苦しむ患者に深く利益をもたらすでしょう¹。しかし、その広範な適用は、移植片拒絶反応、長期免疫抑制による合併症、神経筋の回復、移植周囲のロジスティクスなど、進行中のハードルによって課題となっています。

ラット前肢モデルは、その費用対効果と、ヒトの解剖学的および神経^筋的特性によく似ていることから、VCA研究の好ましい選択肢として浮上しています^2,3。私たちの以前の研究では、このモデルが行動機能回復を評価するための信頼性が高く再現性のある手段を提供することが実証されました⁴。この研究では、このモデルに必要な基本的な顕微手術技術について、詳細で段階的なガイドを提供します。

VCA研究が進化し続けるにつれて、ラット前肢モデルは、拒絶反応、神経再生、および神経筋機能回復の機構的調査を可能にします。研究者は、新しい保存技術を探求し、機械灌流法の有効性を評価し、新たな免疫調節療法をテストすることができ、これにより現在の長期免疫抑制への依存を減らすのに役立つ可能性があります。

プロトコル

外科的処置は、国立衛生研究所と米国実験動物ケア認定協会によって確立されたガイドラインに従って、ジョンズホプキンス大学動物管理および使用委員会(RA18M74)によって承認されたプロトコルの下で実施されました。

1. ドナーの手続き(図1)

1. イソフルランを5%の濃度で吸入することにより麻酔の導入を行い、手順全体で1%に維持します。.つま先をつまんで正確な麻酔レベルを確認した後、施術を開始します。
2. 肘から約1cm上に円周方向に切開します。皮膚を分割し、損傷を与えることなく、下にある表在性皮下組織を露出させます(図1A)。
3. 皮下組織/筋膜を解剖し、すべての表在血管を焼灼し、切開します。その後、大胸筋の一部である三角筋と上腕三頭筋が露出します。
4. 大胸筋の下を鈍く解剖し、上腕血管、正中神経、尺骨神経を明らかにします(図1B)。
5. 三角筋の表在静脈を焼灼し、近位に横断してから、筋線維の向きに垂直に三角筋を横断します。その後、大胸筋と小胸筋を解剖して横断し、腋窩動脈、静脈、神経を明らかにします。(図1C)。
6. 正中神経、尺骨神経、橈骨神経を近位端(分裂直後)で横断し、できるだけ長さを保ちます。
7. 上腕動脈と静脈を解剖して解放します。
8. 上腕二頭筋、上腕三頭筋、広背筋を横断します。解剖が完了したら、上腕骨が適切に露出していることを確認してください。
9. ロンジャー鉗子を使用して、上腕骨の三角筋結節の遠位の骨を横断します。
10. 上腕動脈と静脈の内腔を静かにチェックします(図1C)。移植片を6mLのヘパリン化生理食塩水で洗い流します。
11. ポリイミドカフを上腕動脈と静脈の両方にそれぞれ取り付けます(図1D)。
12. グラフトを濡れた綿ガーゼで包み、4°Cで保管します。
13. 吸入麻酔薬(イソフルラン)の過剰摂取により、ドナーラットを安楽死させます。つま先のつま先をつまんでも完全に反応しなくなったら、開胸術を行い、心臓を切除します。

2. 受取人手続き(図2)

1. イソフルランを5%の濃度で吸入することにより麻酔の導入を行い、手順全体で1%に維持します。.つま先をつまんで麻酔の状態を確認します。
2. 肘の約1〜2cm上に円周方向に切開します。
3. 皮下血管を解剖し、より大きな血管を焼灼して、三角筋、大胸筋の一部、および上腕三頭筋を露出させます。
4. 大胸筋の下の鈍的解剖を行い、上腕血管、正中神経、尺骨神経を明らかにします。
5. 三角筋と大胸筋と小胸筋の一部を遠位端で横断し、上腕血管、正中神経、尺骨神経を露出させます(図2A)。
6. 正中神経と尺骨神経をその遠位端で解剖し、横断します。すべての血管枝を結紮します(図2B)。
7. 上腕二頭筋、上腕三頭筋、広背筋を横断して上腕骨を露出させます。切除した筋肉からの出血を慎重に焼灼します。
8. 三角筋結節で上腕骨を横断します。骨髄の空洞をシールするために骨ワックスを使用してください。
9. 髄内ロッドを使用してドナーとレシピエントの骨髄腔を再接続し、次に骨ワックスを使用して接続をシールします。上腕三頭筋を6-0の吸収性縫合糸で縫合し、血管吻合のプラットフォームを作成します。
10. 橈骨神経の中断された10-0縫合糸で神経上神経掩傷術を行います。
11. 非縫合カフ技術を使用して血管吻合を行います(図2C)。
12. 10-0縫合糸を中断して心膜神経掩出術を行い、正中神経と尺骨神経を再接続します(図2D)。
13. 三角筋と大胸筋を、中断された縫合糸を使用して再接続します。
14. 4-0の非吸収性縫合糸で傷口を閉じます。
15. 手術終了時に、体重の2%の温かく滅菌生理食塩水を皮下投与します。
16. 回復のために、加温ランプの下で少なくとも4時間動物を観察します。警戒し、直立し、協調的な動きを示し、水と餌を自分で手に入れることができるようになったら、動物飼育施設に戻します。

3. 移植後の長期管理

1. 以下に定義するように、痛みや苦痛の兆候がないか毎日動物を監視します。
   1. ケージ内に糞便がないことによって示される食欲不振がないか確認してください。
   2. 動物が水を飲まず、皮膚のテントによって証明される脱水症状につながるかどうかを確認します。
   3. 動物が猫背になっているか、動きたくないか、手足を好むか、切開部位を守っているかを確認してください。
   4. 動物が毛づくろいに失敗し、フリルや汚れたコートに反映されていないか確認してください。
   5. 動物が過度に舐めたり引っ掻いたりしていないか確認してください。切開部位の赤みや腫れ、自傷行為がないか確認します。
   6. 特に動物を抱き上げようとするときは、攻撃的な行動がないか確認してください。
   7. 動物が息を切らしている、呼吸が苦しい、赤褐色の鼻/眼の分泌物があるかどうかを確認します。
   8. 敗血症がないか確認してください。
2. 術後14日で縫合糸を抜去します。
3. 術後2日目(POD2;初回投与から48時間後)にブプレノルフィンSR(ラット用量:1.0 mg / kg SC)の2回目の投与を投与します。.
4. 移植後4週目に毎週の機能評価を開始します。
   1. 簡単に言えば、全身麻酔下で、動物の前肢を90°の外転で固定します。上腕骨への大胸筋の挿入近くの腋窩に、2つの針電極を1mm離して配置します。
   2. 近位正中神経を10Vで経皮的に刺激し、屈筋の最大の破傷風収縮を誘発します。
   3. フルデジタル屈曲がつかみを形成したら、力計に接続された金属ループを手のひらに置き、屈曲した指内に固定します。次に、握りが失われるまでフォースメーターを引き、最大力(ニュートン)を記録します。

結果

移植片の生存率は、巨視的観察によって監視および決定できます。短期追跡調査(POD7)と長期追跡調査(POD120)の代表的な写真を 図3に示します。移植片は、明らかな壊死の兆候なしに回復することができました。生存データを 図 4 に示します。皮膚と筋肉の両方のサンプルは、指定されたエンドポイントで採取されます。代表的な組織像を 図5 と 図6に示します。どちらの図も、皮膚と筋肉の正常な組織学的特徴を示しています。握力試験は、機能回復を評価するために適用されました(主に中膜神経、 図7 および 図8)。回復は移植後約15週間で停滞に達します。この手法については、以前の出版物⁵で詳しく説明されています。

ディスカッション

ラットにおける同所性前肢移植は、血管新生された複合組織を含むだけでなく、機能回復の評価も可能にするため、実験的再建移植で一般的に使用されるモデルです。従来の血管吻合用縫合技術は非常に複雑で、高度な顕微手術技術が必要であり、これには長年の顕微手術のトレーニングが必要です。時間とコストを大幅に削減するために、この修正ラット前肢モデルに血管非縫合カフ吻合技術が適用されました。これにより、マウス心臓移植モデル⁶ とマウス後肢モデル⁷で実証されたように、顕微手術のトレーニングプロセスが大幅に迅速化され、トレーニング曲線が短縮されます。非縫合カフ技術は、すべての前肢移植関連プロジェクトで90%以上の成功を収めています。技術的な観点からは、血管壁の内膜は外科的操作を受けていないため、静的な冷蔵関連実験における交絡因子を減らすのに役立ちます。

このモデル⁴の確立により、術後の機能回復を測定...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
10-0 非滅菌マイクロ縫合糸	AROSurgical	TK-107038
4-0 シャーポイント ナイロン ブラック	エスティフィア	A1667N
4-0 シャーポイント ポリシン テーパー	エスティ	G214N
5 mL シリンジ	MDC	2045
6-0 シルク	フィッシャーサイエンティフィ	NC9742105
ABB-22 V ダブルマイクロベッセル	S&T	00480
B-1 V シングルマイクロベッセルクランプ	S&T	00462
BD Quincke 脊椎針	縫合糸	405073
Castroviejo マイクロニードルホルダー	FST	12061-02
Chatilon DFE II フォースメーター	Ametek	DFE IIシリーズ
コットンチップJH	サプライストア	100252
ファインハサミ - タングステンカーバイド	FST	14569-09
子	S&。T	FRS-15 RM-8
ガーゼ スポンジ	フィッシャー サイエンティフィ	22-362178
ハルステッド モスキート止血器	FST	13009-12
ヘパリン	JHH 薬局	NDC 63323-540-05
IV カテーテル 放射線不透過性 24 G	縫合糸	SMTH5053
宝石商 バイポーラ凝固鉗子、ステンレス鋼	ASSI	103000BPS03
ハンドルバンナスプリングはさみ	FST	15400-12
鉗子	S&。T	FRAS-15 RM-8
血管拡張器 - バランス機器	FST	18602-15