選択した組織領域を用いた質量分析ベースのプロテオミクスのための合理化されたアプローチ

Summary

ここでは、ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片の単離関心領域を用いた質量分析法に基づくプロテオミクス法を確立します。このプロトコールは、アーカイブされたホルマリン固定パラフィン包埋組織切片の特定の組織領域からのプロテオームを解析するために使用されます。

Abstract

質量分析(MS)ベースのプロテオミクスは、細胞、組織、体液など、幅広い生体サンプルにわたる包括的なプロテオーム分析を可能にします。ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織切片は、長期保存に一般的に使用され、プロテオミクス研究のための貴重なリソースとして浮上しています。研究者は、その保存上の利点に加えて、病理医との共同作業を通じて、正常組織領域から関心領域(ROI)を分離することができます。このような可能性にもかかわらず、ROIの分離、プロテオミクスサンプル調製、MS分析を含むプロテオミクス実験の合理的なアプローチは依然として不足しています。このプロトコルでは、ROIのマクロダイセクション、懸濁液トラップベースのサンプル調製、およびハイスループットMS分析を組み合わせた統合ワークフローを示します。このアプローチにより、病理医によって診断された良性漿液性嚢胞性腫瘍(SCN)と前がん性乳頭状粘液性腫瘍(IPMN)からなる患者のFFPE組織のROIをマクロ解剖、収集、分析し、高いプロテオームカバレッジを実現しました。さらに、2つの異なる膵臓嚢胞性腫瘍間の分子差が見事に同定され、FFPE組織を用いたプロテオミクス研究の進展にこのアプローチが適用可能であることが実証されました。

Introduction

何十年もの間、外科的に切除されたヒト組織は、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)ブロックとしてアーカイブされてきました。これらの組織ブロックは、最初にパラフィンに埋め込まれた3次元(3D)構造を保持します。その後、組織をミクロトームを用いてスライスし、スライドにマウントし、一般的にはヘマトキシリンとエオシン(HE)または免疫組織化学(IHC)で染色して、経験豊富な病理医による病理組織学的診断を容易にします^1,2。FFPE組織は、ホルマリンによって誘導されるタンパク質架橋により、酵素活性とタンパク質分解活性が停止するため、長期保存に明確な利点があります³。FFPE組織は、大規模で十分にアーカイブされたサンプルセットの構築をサポートするため、ゲノミクス^{4、5、6、7}など、さまざまな分野でバイオマーカー発見の基礎と見なされてきました。

しかし、液体クロマトグラフィー-質量分析(LC-MS)ベースのプロテオミクスへの応用は、歴史的に課題をもたらしてきました。主な制限は、ホルマリン誘導性タンパク質架橋であり、これはトリプシン消化を妨害します。これは、グローバルプロテオーム解析における重要なステップです⁸。さらに、組織スライドから少量のタンパク質を回収できるため、従来のサンプル調製法はしばしば不適切です。これらの課題にもかかわらず、進歩は、タンパク質架橋が長期にわたる高温処理によって逆転できることを実証している^9,10,11。同時に、少量のタンパク質サンプルに最適化されたサンプル調製法により、プロテオミクス研究におけるFFPE組織の使用が拡大しています12,13,14,15。

プロテオミクスでFFPE組織スライドを使用する大きな利点の1つは、領域特異的な分析を可能にする能力にあります。FFPEスライドには通常、病変と隣接する正常組織(ANT)の両方が含まれています。組織全体を無差別に分析すると、分子シグネチャーが混在するため、結果を混乱させるリスクがあります。対照的に、関心領域(ROI)の単離と解析(病変とANTの比較)により、病理領域に特異的な分子的特徴をより正確に評価することができます。その結果、FFPEベースのアプローチは、プロテオミクス研究16,17,18,19,20においてますます人気が高まっています。その用途が拡大しているにもかかわらず、プロテオミクス実験全体を段階的に記述する合理化されたワークフローはまだ不足しています。特に、ビデオベースのプロトコルは公開されていません。

この研究では、病変特異的領域内の分子変化の正確なプロファイリングに合わせて調整された、頑健な LC-MS ベースのプロテオミクスワークフローが確立されました。2人の病理医によって診断されたFFPE組織を使用して、良性漿液性嚢胞性腫瘍(SCN)および前癌性乳管内乳頭粘液性腫瘍(IPMN)からのROIをマクロに解剖、収集、および分析しました。このプロトコールには、ROIのマクロダイセクション、最小限のタンパク質インプットに最適化された懸濁液トラップベースのサンプル調製、およびナローレンジデータに依存しない取得(DIA)-MS分析が組み込まれています。この方法により、約1cm²の組織領域から9,000を超えるタンパク質を同定し、SCNおよびIPMNに関連する明確なプロテオミクスシグネチャを解読することができました。

Protocol

この研究は、ソウル大学病院の治験審査委員会によって審査され、承認されました(IRB No. 1904-114-1028)。すべての参加者は、研究に参加するための書面によるインフォームド コンセントを提供しました。この議定書で使用されるすべての材料に関する詳細情報は、 材料の表に記載されています。

1. プロテオミクスサンプル調製のためのFFPE組織抗原賦活化

注意: メスと使用するチューブなどのすべての材料が無菌であり、相互汚染を避けてください。この研究のプロトコルは、実験室のセットアップに基づいてわずかな変更を加えるだけで、任意のFFPE組織に適合させることができます。

1. ホールマウントFFPE組織ブロックから10μmのFFPE組織切片を切り取り、スライドガラス上に置きます。
   注:この研究では、ヒト膵臓嚢胞FFPE組織(嚢胞組織の2つの異なるタイプ-SCNとIPMN)がプロテオミクスサンプル調製に使用されました。
2. FFPE組織のパラフィンワックスをキシレンで2回洗浄し、注意して除去します:1回は5分間、もう1回は2分間。
3. 等級付けされたエタノール混合物による連続洗浄を通じて組織を再水和します:100%、85%、70%、および50%のエタノールでそれぞれ3分間、続いて脱イオン水ですすいでください。
   注:キシレンとエタノールが化学薬品のヒュームフードで取り扱われていることを確認してください。

2. FFPE組織タンパク質抽出

1. 病理医がROIを示すHEまたはIHC染色の組織スライドを調製します。
2. 未染色のティッシュスライドと染色したティッシュスライドの裏面を向き合わせて置き、整列させます。ROIがスライドガラスを通して観察されるようにします。
3. メスを使用して興味のない組織領域を取り除きます。
   注:隣接する正常組織を分析する必要がある場合は、他のチューブに収集します。
4. メスを使用して組織のROIをスライドの中心まで掻き取り、きれいな1.5 mLの低タンパク質結合チューブに移します。
5. 180 μL のドデシル硫酸ナトリウム (SDS) 溶解バッファー (5 % SDS、2 mM トリス (2-カルボキシエチル) ホスフィン) [TCEP]、300 mM pH 8.5 Tris-HCl in deionized water) を各チューブに加えます。
   注:溶解バッファーの量が、超音波処理中に組織を可溶化し、抽出されたタンパク質を懸濁するのに十分であることを確認してください。バッファーが不十分な場合、組織の溶解が不完全になる可能性があり、バッファーが過剰になるとタンパク質溶解物が希釈される可能性があります。
6. 20%の振幅でプローブの超音波処理を行い、5秒のオンと5秒のオフの10サイクルを適用します。
7. サンプルを100°Cで3.5時間、1,000 x gでインキュベートします。
   注:効率的なタンパク質抽出のために、インキュベーション中に1時間ごとにサンプルの水超音波処理を行います。
8. インキュベーション後、サンプルを室温(RT)で10分間冷却します。サンプルを16,000 x g でRTで10分間遠心分離し、上清から組織破片を分離します。
9. 上清を清潔なラベル付きチューブに集め、さらに使用するまで-80°Cで保存します。

3. FFPE組織ライセートのタンパク質定量

注:タンパク質定量のためのほとんどのビシンコニン酸アッセイステップは、わずかな変更を加えた製造元の指示に基づいています。試薬はメーカーのガイドラインに従って調製することをお勧めします。

1. ストック溶液(2 mg/mL の BSA)を段階希釈することにより、さまざまな濃度のウシ血清アルブミン(BSA)標準試料を調製します。必要に応じて、希釈係数20または40でサンプルを希釈します。
2. ブランクとして脱イオン水を準備し、サンプルコントロールとしてSDS溶解バッファーを準備します。
3. 標準液9μL、ブランク、サンプルコントロール、サンプルをマイクロプレートウェルの中心にピペットで移します。
4. 各ウェルのサンプルに4 μLの適合性試薬溶液を加えます。
5. プレートに蓋をし、プレートシェーカーで中速で1分間混合します。その後、プレートを37°Cで15分間インキュベートします。
6. 260 μLのBCA作動試薬を各ウェルに加え、プレートを37°Cで30分間インキュベートします。
7. プレートをRTで3分間冷却します。
8. プレートリーダーで562nmでのウェルの吸光度を測定します。
9. ブランクの562nmの吸光度値を、すべてのサンプルとサンプルコントロールの吸光度から減算します。
10. さらに、ブランク減算サンプルコントロールの562nm吸光度値を、すべてのサンプルの吸光度値から減算します。
11. 標準曲線をプロットして使用し、各サンプルのタンパク質濃度を決定します。
    注:推定200〜250μgのタンパク質が、それぞれが約^1cm2の面積を持つFFPE組織の3つのスライドガラスから抽出されていることを確認してください。

4. タンパク質のアセトン沈殿

注:アセトン沈殿および懸濁液トラップベースのタンパク質消化には、合計100〜300μgのタンパク質が使用されていることを確認してください。

1. タンパク質サンプル(100〜300μgに相当)をアセトン適合チューブに入れます。
2. サンプル容量の5倍の容量で-20°Cのアセトンをチューブに加えます。
3. 混合物を-20°Cで18時間インキュベートします。
4. チューブを16,000 x g で15分間遠心分離します。
5. 上清は、タンパク質ペレットを乱さずに慎重に廃棄してください。
6. -20°Cのアセトン500μLを加え、手順4.4〜4.5を繰り返します。
7. サンプルを風乾します。

5. 懸濁液捕捉によるタンパク質消化

注:懸濁液トラップフィルターベースのタンパク質消化手順は、製造元の指示書から若干の変更を加えて適応されました。

1. 懸濁液トラッピング溶解バッファー(脱イオン水中の5 % SDS、5 mM TCEP、50 mM pH 8.5 TEAB)を調製します。
2. サンプルチューブに40μLのバッファーを加え、十分にボルテックスして風乾したタンパク質ペレットを溶解します。
3. サンプルを100°Cでインキュベートし、1,000 x g で35分間振とうします。
4. 10 μLのアルキル化試薬(100 mM pH 8.5 Tetraethylammonium bromide [TEAB]に100 mMクロロアセトアミド[CAA])をサンプルに加えます。
5. RTで300 x g で1時間振とうしながらインキュベートします。
6. 酸性化剤(脱イオン水中の10%トリフルオロ酢酸[TFA])を慎重に調製します。.強酸であるTFAが化学薬品ドラフトで取り扱われていることを確認してください。
7. サンプルに5 μLの酸性化剤を添加して、最終濃度1% TFAを達成します(最終サンプル容量:55 μL)。
8. pHペーパーを使用してサンプルのpHを確認します。pHが1未満であることを確認してください。
9. 350 μLのBinding/Wash Buffer-1 (0.1 M pH 8.5 TEAB in 90% MeOH) をサンプルに添加して、タンパク質をトラップします。
   注:サンプルの損失を防ぐために、タンパク質のトラップ(ステップ5.9)中のボルテックスと遠心分離は避けてください。十分な量のタンパク質は、半透明の外観を持つ目に見えるコロイド状タンパク質粒子の形成を確実にします。
10. 懸濁液トラップカラムを2 mLチューブに入れ、不溶性物質を含むサンプル全体を懸濁液トラップカラムに移します。
11. カラムを4,000 x g で50秒間遠心分離し、タンパク質をトラップします。
    注:すべてのサンプルがカラムを通過することを確認してください。そうでない場合は、完全にろ過されるまで遠心分離を繰り返します。
12. 400 μL の洗浄バッファー-2 (50 % CHCl3/50 % MeOH) をカラムに加え、4000 x g で 50 秒間遠心分離し、フロースルーを廃棄します。
13. 手順5.12を3回繰り返します。
14. 400 μL のバッファー 1 を加え、4000 x g で 50 秒間遠心分離し、フロースルーを廃棄します。
15. 手順5.14を3回繰り返します。
16. 4000 x g で1.25分間遠心分離し、buffer-1の全通過を確認します。
17. 懸濁液トラッピングカラムを新しいサンプルチューブに移し、酵素分解を行います。
18. 125 μLの消化バッファー(0.16 μg/μLのトリプシン/Lys-C、50 mM pH 8.5 TEAB)を懸濁液トラップカラムに加え、蒸発を防ぐためにキャップします。
    注:トリプシン/Lys-C比は1:10(重量/重量)である必要があります。効果的な消化のためには、最低10 μgのトリプシン/Lys-Cを確保してください。
19. 振とうせずに37°Cで18時間インキュベートします。
20. 以下の溶出バッファーを調製します:バッファー-1(脱イオン水中の50 mM pH 8.5 TEAB)、バッファー-2(脱イオン水中の0.2 % FA)、およびバッファー-3(脱イオン水中の50 % アセトニトリル[ACN])。
21. 80 μL の溶出バッファー-1 を懸濁液トラッピングカラムに加え、4000 x g で 1.25 分間遠心分離します。
22. 80 μLの溶出バッファー-2およびバッファー-3でステップ5.20を繰り返します。
23. 溶出したペプチドをプールし、清潔な新しいチューブに移します。

6. ペプチド定量

注:定量的比色ペプチドアッセイのほとんどのステップは、製造元の指示からわずかな変更を加えて適応されています。試薬はメーカーのガイドラインに従って調製することをお勧めします。

1. スタンダードの原液を連続希釈(1 mg/mL)して、一連のスタンダードを調製します。必要に応じて、希釈係数4または5を使用してサンプルを希釈します。
2. 脱イオン水をブランクとして調製し、溶出バッファー-1、バッファー-2、およびバッファー-3の混合物をサンプルコントロールとして同じ割合で調製します。
3. 20 μLのスタンダード、ブランク、サンプルコントロール、およびサンプルを各マイクロプレートウェルの中央に置きます。
4. 各ウェルに180 μLの作業試薬を加え、プレートシェーカーでプレートを1分間十分に混合します。
5. プレートを覆い、プレートを37°Cで20分間インキュベートします。
6. プレートを室温で3分間冷まします。
7. プレートリーダーを使用して、480 nmでのウェルの吸光度を測定します。
8. ブランクの480nmの吸光度値を、すべてのサンプルとサンプルコントロールの値から減算します。
9. さらに、ブランク減算サンプルコントロールの480nm吸光度値を、すべてのサンプルの吸光度値から減算します。
10. 標準曲線をプロットして使用し、各サンプルのペプチド濃度を計算します。

7. 液体クロマトグラフィー-質量分析

1. ペプチド定量後、20 μgのペプチドを凍結乾燥します。
2. ペプチドを40 μLの水性緩衝液 (0.1 % ギ酸 [FA] 水に 3 % ACN) を入れ、超音波処理槽で 10 分間再溶解します。得られるペプチド濃度は0.5μg/μLとなります。
3. サンプルを16,000 x g で60分間遠心分離し、サンプルをバイアルに移してMS分析を行います。
4. nano LC-MS/MS システムのオートサンプラーを使用して、各サンプルの 2 μL を注入します。
5. 逆相カラム(内径0.075 mm x 150 mmカラム、3 μm C18材料充填、5%-35%アセトニトリル、100 nL/minの127分間グラジエントを使用)でペプチドを分離します。ナノスプレーイオン源を介してペプチドをイオン化し、Orbitrapベースの質量分析計に移します。
6. 狭範囲データ非依存取得法²¹を用いてペプチドを分析する。
7. MS m/z 範囲: 495-745、分解能ターゲット: 15000、AGC ターゲット: 3 x 10E6、最大注入時間: 自動、MS/MS ウィンドウ: ユーザー定義 (補足ファイル 1)、分解能ターゲット: 45000、AGC ターゲット 3 x 10E6、最大注入時間: 自動、HCD 衝突エネルギー: 22%、26%、30%
   注:分析前に標準サンプルを分析して、装置の初期品質チェックを実行することをお勧めします。MSデータ集録ソフトウェアを使用してパラメータを設定します( 材料表を参照)。

8. プロテオミクス探索のためのデータ解析

注:MS 生データのプロテオミクス検索には、オープンソースツールを使用して LC-MS データフォーマットを変換し、プロテオーム検索を実行しました( 材料表を参照)。データ分析に使用するパラメータについては、 補足ファイル2に詳しく記載されています。オープンソースツールの基本的な使用方法については、 資料の表に含まれているリンクを参照してください。

1. オープンソースソフトウェアを使用して、LC-MSから取得した生のMS/MSスペクトルファイル(*.raw)を*.mzML形式に変換します。
2. フォーマット変換された生ファイル(*.mzML)をオープンソースの検索エンジンの入力として使用して、プロテオーム検索を実行します。
3. 補足ファイル2で指定されたパラメータに基づいてプロテオミクス検索を開始します。

9. 統計分析

注:差次的に発現するタンパク質を同定するための統計解析のために、オープンソースのツールを使用して単変量解析を行いました(例:スチューデントのt検定; 資料表を参照)。オープンソースツールの基本的な使用方法については、 資料の表に記載されているリンクを参照することをお勧めします。

1. 同定されたタンパク質(*.txt)のリストをオープンソースツールにインポートします。
2. サンプルをグループに分類します。この研究では、SCNとIPMNの2つのグループが指定されました。
3. 存在量の値のLog₂ 変換を実行して、データ分布を近似正規分布に調整します。
4. フィルタリングステップを適用して、欠損値のあるタンパク質を除去します。この研究では、含めるために、各グループに少なくとも 2 つの有効な値が必要でした。
5. 正規分布ベースのアプローチを使用して欠損値を代入し、その後の単変量解析のために定量化されたタンパク質の包括的なリストを生成します。
6. スチューデントのt検定を実行して、2つのグループ間で発現差のあるタンパク質を特定します。本研究では、Benjamini-Hochbergの誤発見率(FDR)補正を適用した。
7. 次の基準を満たす差次的に発現するタンパク質を抽出します:Benjamini-Hochberg FDR < 0.05および|fold-change|≥ 2.

10. バイオインフォマティクス解析

注:過剰表現解析には、市販のバイオインフォマティクスツールを使用しました(例:Ingenuity経路解析、 資料表を参照)。このツールを使用する前に、製造元の指示を参照することをお勧めします。

1. DEP (*.txt) のリストを商用ツールにインポートします。
2. コア解析を開始して、過剰表現解析を実施します。
3. フィッシャーの正確確率検定を使用して、DEPから濃縮された有意な正規経路をエクスポートします(調整されたp値<0.05)。研究に関連する関心のある経路を特定します。

Results

確立された懸濁液トラップフィルターベースのプロテオミクスサンプル調製と、シングルショットデータに依存しない取得によるラベルフリー定量を組み合わせて、膵臓嚢胞性FFPE組織に適用しました(図1)。FFPE 組織プロセッシング中の正確な ROI 単離は、異なる膵臓嚢胞性 FFPE 組織間で達成され(図 2A)、その結果、膵臓嚢胞性腫瘍のタイプごとに生物学的 3 replicate 間で再現性のある全イオンクロマトグラムを取得することができました(図 2B)。LC-MS 分析では、SCN と IPMN についてそれぞれ 9,703 のタンパク質を同定し、平均 7,886 と 8,273 のタンパク質を定量しました(図 2C)。さらに、6つのサンプルすべてで合計80,245の前駆体と75,412のペプチドが同定され、SCNとIPMNにはそれぞれ平均55,729/51,488と63,573/59,519の前駆体...

Discussion

このプロトコルは、スライドガラスに取り付けられたFFPE組織切片から分離されたROIを病理学的診断に利用する、迅速かつ効率的なプロテオミクス法の概要を示しています。外科的介入が有利な場合、がんや嚢胞などの固形新生物を外科的に切除し、病理学的評価のために保存します。長期保存のために、組織をホルマリンに固定し、パラフィン(FFPE)に包埋します。次に、FFPE組織ブロックを4〜10μmの厚さに切片化し、スライドガラスにマウントし、抗原賦活化を行い、HEまたはIHCで染色します。病理学者は、細胞の形態と分子診断マーカー(HER2、ER、PRなど)の発現を評価して、診断の意思決定を支援します。

最新のプロテオミクスは、さまざまな組織におけるヒトプロテオームの包括的な定性的および定量的プロファイリングと、さらにシステム全体の分子分析を可能にします。これらの開発には、超高分解能、超高速質量分析計、再現性の高い液体クロマトグラフィーの進歩が重要な役割を果たしています。さらに、このプロトコルは、懸濁液トラッピングセットアップに基づ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1% FA in ACN (LC-MS グレード)	Fisher Chemical	LS120-212
0.1% FA in Water (LC-MS grade)	Fisher Chemical	LS118-4
0.5M TCEP	Thermo Scientific	77720
10% SDS	Invitrogen	2679093
1M TEAB (pH 8.5)	Sigma-Aldrich	102545001
1M Tris-cl (pH 8.5)	BIOSOLUTION	BTO21
A-14C 遠心分離機	Satorious	167709
アセトン (HPLC グレード)	Fisher Scientific	A949-4
ACN (HPLC グレード)	J.T.Baker	9017-88
CHCl3 (HPLC グレード)	Thermo Scientific	022920.k2
CR paper	ADVANTEC	70406001
DIA-NNバージョン1.9	オープンソース	https://github.com/vdemichev/DiaNN	プロテオミクス検索エンジン
EPOCH2マイクロプレートリーダー	Agilent
エタノール	MERCK	K50505283 836
FA (LC-MS グレード)	Fisher Chemical	A117-50
Ingenuity Pathway Analysis (IPA)	QIAGEN	830018	Bioinformatics Tool
凍結乾燥機 (SRF110R+ベイパートラップ)	Thermo Scientific	SRF-110-115
MeOH (HPLC グレード)	MERCK	UN1230
マイクロプレート BCA タンパク質アッセイキット-還元剤対応	Thermo Scientific	23252
MSConvert	オープンソース	http://proteowizard.sourceforge.net/tools.shtml	MS データ変換ソフトウェア
Orbitrap Exploris 480	Thermo Scientific	MA10813C	MS
PepMAP RSLC C18 分離カラム	Thermo Scientific	ES903
Perseus	オープンソース	https://cox-labs.github.io/coxdocs/perseus_instructions.html	統計ツール
PIERCE クロロアセトアミド No-Weigh Format	Thermo Scientific	A39270
PIERCE 定量的比色ペプチド アッセイ	Thermo Scientific	23275
プレートシェーカー	グリーン SSeriker	VS-202D
プローブ超音波処理機	VibraCellTM	VCX750
タンパク質 LoBind チューブ 1.5 mL	エッペンドルフ	22431081
QSP 10 & マイクロ;Lピペットチップ	Thermo Scientific	TLR102RS-Q
QSP 300 µL ピペットチップ	Thermo Scientific	TLR106RS-Q
Scalpel	Bard-Parker	372615
S-Trap: Rapid Universal MS sample Prep	PROTIFI	CO2-mini-40
SureSTART Vial 0.2 mL	Thermo Scientific	6pk1655
TFA	Sigma-Aldrich	102614284
ThermoMixer C	Eppendorf	5382
トリプシン/Lys-C(LC-MS グレード)	Promega	V5073
Vanquish NEO	Thermo Scientific	8348249	LC
Water (HPLC グレード)	Honeywell	AH365-4
Xcalibur ver 4.7	Thermo Scientific	30966	MS データ収集ソフトウェア
Xylene	Sigma-Aldrich	102033629