化学療法誘発性末梢神経障害のラットモデルにおけるカンナビジオールによる異痛症および痛覚過敏の予防

サマリー

CBDとパクリタキセルの同時投与は、ラットの化学療法誘発性末梢神経障害の発症を防ぎます。このプロトコルでは、カンナビノイドの取り扱い 、化学療法による ラットのアロディニック表現型の誘導、機械的および熱的アロディニアの評価、およびアロディニアと痛覚過敏を区別するための高速ビデオ撮影の使用について説明します。

要約

この研究は、化学療法誘発性末梢神経障害 (CIPN) のラット モデルが、非精神活性カンナビノイド カンナビジオール (CBD) がこの症候群の発症を調節する能力を評価するための有用性を示しています in vivo.この方法では、化学療法剤のパクリタキセルを利用して、動物にアロディニック表現型を生成します。この研究では、CBDの取り扱いと可溶化、化学療法剤の投与方法、機械的感受性および寒冷感受性の評価方法、および動物の侵害行動を測定するための高速ビデオ撮影の適用方法について説明します。概説した手順を使用すると、CBDが治療された動物で異種表現型が発生するのを防ぐことがデータによって裏付けられています。CBDを投与した動物では、0日目(パクリタキセルをベースライン化)から7日目(感作後)まで、機械的または熱的な感受性に差は認められませんでしたが、ビヒクルで処理した動物は有意に感度が高くなりました。この治療に対する反応は、データが収集された最新の時点 (7 週間) まで持続します。高速ビデオ撮影の追加により、この行動表現型のより詳細で偏りのない評価が可能になります(例:鎮痛剤と抗異痛症の分類)。これは、カンナビノイド薬物の特性評価におけるこのモデルの有用性と、神経障害性疼痛の緩和におけるCBDの潜在的な役割の両方を実証しています。

概要

化学療法誘発性末梢神経障害(CIPN)は、感覚神経障害の一種です。これは化学療法治療の一般的な副作用であり、特にタキサン系およびプラチナ系薬剤に多く見られます^1,2。CIPNの症状には、慢性的な痛み、しびれ、うずき、触覚や温度に対する極端な過敏症などがあります^1,2。これらの痛みを伴う症状は、患者の日常生活だけでなく、がん治療にも支障をきたします。一部のがん患者は、この症候群に関連する生活の質の低下を管理できるようにするために、化学療法の投与量の削減または完全な終了を求めています³。現在、CIPNの一般的な臨床的に使用されている治療法は、症状の緩和に不完全であり、オピオイドが含まれており、これは重大な乱用の可能性をもたらします⁴。CIPNの治療法はこれまでないため、安全で効果的な代替手段を見つけることが不可欠です^5,6。

カンナビジオール(CBD)は、マウスでモデル化されているように、CIPNの発症を予防する効果があることが以前に示されています^7,8。これは、CIPNの潜在的に長期的な異種症状を患者が回避するための有望な経路を示しています 曖昧に効果的な薬や潜在的に有害なオピオイドによる緩和を必要とせずに。CBDを使用している人の大多数は、特に発作の管理などの治療目的で、軽度の副作用を経験しており、この薬は一般的に忍容性が高い⁹。ほとんどの副作用は用量依存的であり、体が適応するにつれて改善することがよくあります。.

この広く使用されているCIPN¹⁰モデルでは、ラットにパクリタキセルを投与して神経障害を誘発し、これは以前に報告されたように、化学療法介入後に一部の患者で観察された異種表現型を再現します¹¹。この誘導の目標は、このタイプの感覚神経障害をin vivoで評価するための翻訳的に関連性のあるプラットフォームを持つことであり、これはこの症候群のメカニズムまたは介入を調査する研究者に適しています。機械的感度はフォンフレイ試験を使用して測定され、低温チャレンジは熱感度^10,11を測定するために使用されます。これにより、患者にとって最も臨床的に重要な2つのQOLエンドポイントにおけるCIPNの緩和におけるCBDの予防的可能性を定量化することができます。さらなる評価には、夜間防御行動の高速ビデオ撮影支援分析が含まれていました^12,13。無害な刺激と有害な刺激に対する行動反応のこの拡張分析により、化学療法投与のアロディニック効果と痛覚過敏効果の区別、およびこれらの効果を調節するCBDの能力が可能になります。

このプロトコルでは、CIPN 表現型を誘導する方法、ラットの機械的および熱的過敏症を評価および定量化する方法、および異痛症と痛覚過敏の偏りのないより詳細な評価のためのビデオ撮影を適用する方法について説明します。

プロトコル

このプロトコルは承認され、テンプル大学の動物管理および使用委員会のガイドラインに従っており、承認された動物研究のプロトコルに基づいています。この研究では、成体の雄Sprague-Dawleyラット(250-300 g)を使用しました。使用した試薬や機器の詳細については、 資料表に記載しています。

1. CIPN導入のためのカンナビノイドと化学療法剤の調製

注: 図1 は、カンナビジオールの可溶化プロセスを示しています。

1. CBDの可溶化とパクリタキセルの希釈のために、以下の材料を組み立てます。
   1. 100%エタノール(EtOH)、クレモフォア(エトキシル化ヒマシ油)、生理食塩水、琥珀色のガラスバイアル(x2)、50 mlコニカルチューブ(x2)、CBDパウダーストック、パクリタキセル臨床ストック(6 mg / mL)。
2. 50 mLの各コニカルチューブに適切な量のEtOHを添加して、1:1:18 EtOH:エトキシル化ヒマシ油:生理食塩水の最終溶媒調製を行います。
3. 適切な量のCBDを量り、試験する動物の数に対して5mg/kgの濃度にします。
4. 調製した2本の50mLコニカルチューブのうちの1本でCBDをEtOHに溶解します。
5. CBDが完全に溶解するまで、CBD-EtOH混合物を高速で渦巻きます。
6. 等量のエトキシル化ヒマシ油を各50 mLコニカルチューブに加えます。
7. エトキシル化ヒマシ油がEtOHと溶液中になるまで、各チューブを高速でボルテックスします。
8. 各 50 mL コニカルチューブに適切な量の生理食塩水を加えて、最終的な比率を 1:1:18 にします。
9. 生理食塩水が溶液中になるまでボルテックスします。
10. 車両制御溶液とCBD溶液を琥珀色のガラスバイアルに移します。
11. パクリタキセル原液を生理食塩水で1:6に希釈し、試験する動物の数に適した容量で、琥珀色のバイアルの最終濃度を1 mg / mLにします。
12. 琥珀色のバイアルをアルミカラーのゴム製バイアルキャップで密封します。
    注:実験開始前に調製した場合、ビヒクル、ビヒクル+ CBD、およびパクリタキセルのバイアルは、4〜8°Cで最大7日間保存できます。注射する前に、冷蔵バイアルを室温まで平衡化させます。また、調製したカンナビノイド試薬は、容器への付着や溶液からの沈殿を防ぐために、すぐに使用しない場合でもガラスに保管することが非常に重要です。

2. ラットにおける異種表現型の誘導

1. パクリタキセル注射に必要な材料を以下のように組み立てます。
   1. 1 mg/mL パクリタキセル原液、1 mL 使い捨て注射器(x n ラット)、25 G 注射針 (x n ラット)、化学療法廃棄物鋭利物容器、および動物の体重を収集するためのスケールを調製しました。
2. ラットに一意の識別子を番号付けするか、タグを付けます。
   注:動物は、実験開始の少なくとも1週間前に彼らの住居に順応している必要があります。
3. 各動物の体重を集めます。
4. 適切な量のパクリタキセル(すべての動物)とビヒクルまたはCBD(治療グループ別)で注射器を準備します。この場合、注入量は動物の1μL/g体重に相当します。
5. パクリタキセルとビヒクル、またはパクリタキセルとCBDを腹腔間注射します。
   1. ラットを注射のために拘束するには、人差し指を首の周りの親指に合わせ、中指を肩の下の親指に合わせ、薬指と小指を使用して体をつかむように、非利き手でラットを後ろからつかみます。.
   2. ラットの後肢を体に対して安定させます。
   3. 怪我をしないように、動物に不快なレベルの圧力をかけないように注意してください。
      注:ネズミを取り扱う際には、常に噛んだり引っかいたりする危険性があります。このリスクを軽減するために、実験者は噛みにくい手袋の形で追加のPPEを着用する場合があります。
   4. 手動で拘束して安定させながら、腹部が注射器に容易にアクセスできるように動物を傾けます。
   5. 1 mg / mLパクリタキセルを動物の右下象限に注入し、注射器を化学療法廃棄物鋭利容器に廃棄します。.
   6. ビヒクルまたはCBDを1μL / gの重量で動物の左下象限に注入し、注射器を通常の鋭利な容器に廃棄します。
      注:注射部位を交互に並べると、動物の苦痛と注射部位の潜在的な刺激が軽減されます。
   7. これが実験の1日目です。このプロセスを2〜4日目に繰り返して、アロディニック表現型を誘導します。この期間中は、化学療法で汚染されたケージの施設での取り扱いプロトコルに従ってください。
   8. ステップ 3 で説明したように、0 日目にベースラインの機械的および熱的異痛症測定を行います。ステップ4で説明したように、ベースライン生成に追加の刺激を含めます。これらの刺激の 0 日目の値の分析は、痛みのスコアを生成するために必要になります。
   9. 動物が安定した反復可能なベースラインを示すまで、手順2.5.8を繰り返して、不十分な取り扱いによって引き起こされる応答の不均一性を回避します。
      注:アロディニック表現型を誘導するプロセスを中断しないでください。実験者が 4 日間連続して注射を行うことができない場合は、代替の投与スケジュールで表現型の同様の誘導を達成できます。また、パクリタキセルとビヒクルまたはCBDの注射を2回ではなく1回の注射に組み合わせることも可能であり、おそらく推奨されるのは、最初のビヒクルまたはCBD溶液の量を適切に調整して、これらの混合物のパクリタキセルの希釈に対応しながら、CBDの最終濃度を5 mg/mL、パクリタキセルの濃度を1 mg/mLに維持することです。.化学療法用鋭利物の取り扱いには、実験者に誤ってさらされないように、適切な注意を払ってください。

3. 感作後の機械的および熱的感度の評価

注: 図2 は、この調査で使用した概略装置を示しています。

1. 機械的および寒冷感受性アッセイのために、以下の材料を組み立てます。
   1. フォン・フレイ・フィラメント(4-100g)、ドライアイス、15mLコニカルチューブ、アイソレーションチャンバー、ワイヤーフロアグリッド、1/4インチガラスパネル、ストップウォッチ。
2. 実験 7 日目 (例: 最終化学療法/治療条件注射の 3 日後) から評価を開始します。
3. フォン・フレイと断熱チャンバーを組み立てます。
   1. 機械的感度用のアイソレーションチャンバー(プラスチックパーティションで区切られた6つのチャンバー)を、ベンチトップから20cm上のワイヤーフロアグリッドに配置します。
   2. 熱感度試験用のアイソレーションチャンバー(シングルチャンバー)を、ベンチトップから20cm上の1/4インチのガラス面に置きます。
4. 動物を機械的異痛症のための隔離チャンバーに個別に配置してください。
5. 試験開始の15分前に、アイソレーションチャンバーに順応させます。
6. 機械的感度について手動のフォン・フレイ試験を実施します。この方法では、手動フォン・フレイ試験について説明していますが、手動試験¹⁴の代わりに電子フォン・フレイ試験を使用することもできます。
   1. 最も低い力のグラム数(例:4 g)に対応するフィラメントから始めて、フィラメントがC字型に6秒間保持されるように、右後足の中央足底面に圧力をかけます。
      注:研究者は右足と左後足の間にほとんど違いがないと報告していますが、実験者は動物間で一貫性を保つ必要があります)。刺激ごとに5回の試行を繰り返します。
   2. 試験する動物ごとに繰り返します。
   3. フィラメントのサイズを順番に大きくし、5回の試行のうち少なくとも2回で痛みの反応(例:足の離脱)が観察されるまで、手順3.5.1〜3.5.2を繰り返します。
   4. 観察された足の反応を呼び起こした力のフィラメントグラムを記録します。
   5. 次に低いフィラメントを再テストして、足の引き抜きが観察されるかどうかを確認します。応答が観察されない場合、記録された力のグラム数は最終的なものです。
   6. 動物がこのステップで反応した場合は、新しいフィラメントグラムの力を記録し、次に低いフィラメントを再テストします。下のフィラメントが反応を引き出さなくなるまで繰り返します。代表的なデータを図3A,Cに示します。
7. 寒冷感症テストを実施します。
   1. 動物を機械的感受性隔離チャンバーから取り出し、熱感受性隔離チャンバーに入れます。
   2. 15 mLの円錐形チューブにドライアイスを詰めて、最終的なペレットがチューブの上部から伸びるようにします。
   3. ドライアイスを動物の右後足の近位にあるガラスの上に置きます。
   4. ストップウォッチを使用して、動物が温度に反応して足の引き抜きを示すまでの時間を記録します。代表的なデータを 図3Bに示します。
   5. ネズミをホームケージに再度収容します。
   6. すべての動物がテストされ、自宅のケージに戻るまで、3.7のすべての手順を繰り返します。
      注:この段階では、動物の行動と体重に苦痛の兆候がないか監視する必要があることに注意することも重要です。動物がベースラインの痛みの行動を発達させるか、長時間の経過中に体重が減少している場合は、研究を終了し、適切な動物の取り扱い技術に従って動物を安楽死させる必要があります。実験の過程で動物が苦痛を示さなかった場合、動物は最終試験日の後に安楽死させるべきです。

4. 高速ビデオ撮影 による 機械的感度評価

1. 機械的感度アッセイとビデオ撮影のために、以下で説明するように次の材料を組み立てます。
   1. アイソレーションチャンバー、ワイヤーフロアグリッド、綿棒、化粧ブラシ、ピン、高速度カメラ、赤外線ライト、互換性のある分析ソフトウェアを備えたラップトップ。
2. 前述した機械的感度試験¹¹と併せて、または以下に説明するようにスタンドアロンのアッセイとして評価する。
3. 機械的感度用のアイソレーションチャンバー(シングルチャンバー)を、ベンチトップから20cm上のワイヤーフロアグリッドに配置して組み立てます。
4. カメラを三脚に置き、アイソレーションチャンバーから約45〜1フィートの角度で2回置きます。
5. 赤外線ライトを三脚に配置して、実験とその後のスコアリングのためにチャンバーを照らします。
6. 動物を単離チャンバーに個別に配置して、機械的刺激評価を行います。
7. 試験開始前に、アイソレーションチャンバーに15m順応させてください。
8. さまざまな刺激による機械的感受性について体性感覚試験を実施します(図4)。
   1. Photron FastCAM解析ソフトウェアを搭載したラップトップを使用して、各刺激に対してアイソレーションチャンバーを2000フレーム/秒で記録します(対応するボタンを押して記録を開始します)。
   2. 録音中は綿棒を使用して、綿の先端とラットの後足を優しく接触させ、録音が完了したら停止します。
   3. 化粧ブラシを使用して、後足を後ろから前に拭き取り、完了したら停止します。
   4. ピンを使用して、ラットの後肢に低圧および高圧のピン刺しを行います。低圧の刺し傷の場合は、ピンを後足にそっと触れ、録音中に接触した後は引き抜き、完了後に停止します。
   5. 高圧ピン刺しの場合は、ピンを後足に鋭く押し込み、録音中に接触した後は引き抜き、完了後に停止します。
   6. 動物をホームケージに戻します。
   7. 試験する動物ごとに繰り返します。
9. 記録された侵害行為を手動で評価する via FastCAMソフトウェアで処理された動画による高速動画撮影¹⁵に示すように、 図5A、B.
   1. メッシュの床から足の刺激後の最高点までの足の高さ(cm)を測定します。ソフトウェアでこれを行うには、[ 寸法]>[測定] に移動し、[ 2点]を選択します。
      1. 前足の動き全体を通してビデオを再生し、最初の上向きの動きで前足がピークに達する瞬間を判断します。足の明確に識別可能な領域(足底面の中心、指と足の交点、かかとなど)を選択し、それを初期点として設定します。
      2. ビデオを巻き戻して、刺激前のその領域の位置を特定し、y 軸に沿ってその位置に 2 番目のポイントをマークします。測定線がY軸と平行で、角度がついていないことを確認してください。高さは画面の左上隅に表示されます15。
   2. 最初のリフトから最高点までの距離(cm単位)をこれら2つの点間の時間(秒単位)で割って計算して、足の速度を決定します。この測定は、ソフトウェアで「寸法」>「測定」を選択し、「2点」を選択することで実行できます。
   3. 前足の動き全体を通してビデオを再生し、前足が最初に上向きの動きを開始するフレームを特定します。この動き内の異なるフレームで2つの点を選択し、距離をフレーム数または開始フレーム15と終了フレーム¹⁵の間の経過時間で割った値を計算することにより、足の速度を測定する。
   4. 軌道の引き締め、足の揺れ、足のガード、ジャンプの動作についてビデオを評価します。例えば、動物が刺激の適用中にこれらの行動のいずれかを示した場合、その夜行性行動スコアは1になります。
      注:眼窩の引き締めは、刺激の適用中に目が完全に開いた状態から部分的または完全に閉じたときに採点されました。足の震えは、刺激の適用中に高周波の足のひるみが観察されたときに採点されました。跳躍は、刺激の適用中に3つ以上の足がワイヤーグリッドの床から離れたときに採点されました。
   5. 刺激からのベースラインデータを使用して、前に説明したように、この動物のコホートの分布と誤差の推定値を生成します¹⁵。簡単に言うと、治療前のベースラインで静的なタッチ、ダイナミックなタッチ、軽いピンチック、および重いピンチングに反応して、研究で使用されている各動物のビデオを録画して、考えられる行動特徴の全範囲をキャプチャします。
      1. すべての刺激(静的な触覚、綿棒、軽いピン刺し、重い刺し傷)にわたるグループの各行動特徴(速度、高さ、痛みスコア)の平均と標準偏差を計算します。
   6. 各ビデオで観察された生データから、ステップ 4.9.4 で生成された変数と前述の手順^{を使用して z スコアを生成します 16}。
   7. 統計解析ソフトウェア¹⁷を使用した主成分分析を使用して、すべてのzスコアを1次元固有値に結合します。これにより、3 次元データセットから変換された Z スコアの組み合わせを 1 つの加重合計値¹⁶ として計算できます。
   8. 統計分析ソフトウェアを使用して、これらの複数の行動次元を包含するPCA生成の疼痛スコアをプロットし、有害刺激と無害刺激に関連する行動を分離します(図5C)。
      注:ビデオ撮影支援の機械的試験は、次元の増加を組み込むことにより、フォンフレイ試験を反復します。CIPNの文脈では、抗アロディニアと鎮痛の説明と区別を可能にします。ビデオスコアリングは、官能検査を実施した実験者とは独立した関係者が実施することもできます。これは、実験者のバイアスを減らし、収集される情報の深さを増やすことができる強力なツールです。この方法は、特殊なハードウェア、ソフトウェア、および統計手法に依存していることに注意することが重要です。これは、前のセクションで説明したよりアクセスしやすい方法を補完する役割を果たします。さらに、カメラによって生成されるファイルのサイズにより、データ収集には時間がかかり、ファイルのストレージスペースが制限要因になる可能性があることに注意してください。これらの要因は、実験の開始時に考慮する必要があります。

結果

ラットのこのCIPNモデルによって誘発された行動結果は、非常に再現性があり、一貫性があります。 図 3A は、対照動物と CBD 治療動物におけるベースラインおよびパクリタキセル感作後の機械的感度の結果を示しています。ベースラインでは、Sprague-Dawleyラットは一般に、フォンフレイフィラメントによって加えられる力の26-60gで足の離脱を示し始めます。これは、ゼロ日目に両方の治療群で観察できます。パクリタキセルを投与した後、ビヒクルで処理された動物は、適用されるフォースフィラメントの最低グラム数(例:.、4-6g)に感受性を持つようになります。これは、この研究だけでなく、以前に発表された¹¹でも観察されています。この研究は、CBDをパクリタキセルと併用すると、この感作を緩和するのに非常に効果的であることを示しています。CBD処理された動物はベースラインのままで、7日目と0日目の間に統計的に有意な差は見られませんでした。さらに、この効果は耐久性があります。 図3C...

ディスカッション

化学療法誘発性末梢神経障害のラットモデルは、特定の種類の化学療法を受けている患者に対して最も報告された生活の質の問題のうちの2つを、機械的感受性および熱感受性で再現しています。このモデルでは、比較的安価で効率的な方法で、フォン・フレイ・フィラメント試験 による これらの感度とドライアイス曝露による熱感度の定量化が可能です。この方法は、高速ビデオ撮影 による より専門的なテストのための追加の方法も提供し、上記のより容易に適応可能な方法よりも詳細で偏りのない分析に使用できます。このモデルは、新しい治療オプションが緊急に必要とされている症候群であるCIPNの実験的治療法を調査するための重要なツールです。

ここで紹介する研究は、非精神活性カンナビノイドCBDに焦点を当てています。この方法は、CBDを効果的に取り扱い、保存する方法を説明しています - カンナビノイドは非常に非極性の分子であり、実験の準備をする際には特別な考慮が必要です。CBD(およびその他のカンナビノイド)を沈殿させずに溶...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
カンナビジオール	ケイメン ケミカル	90080	ミシガン州アナーバー
クレモフォア	ミリポアシグマ	238470	ミズーリ州セントロース
エタノール	ミリポアシグマ	E7023	ミズーリ州セントロース
FastCAM 分析ソフトウェア			Photon https://photron.com、オープンソース
高速カメラ	Photron	AXの50
赤外線	CMVision	IP65
通常の生理食塩水	ミリポアシグマ	S0817	ロース、ミズーリ
パクリタキセル	テンプル大学病院薬局	N / A	フィラデルフィア、ペンシルバニア
スプレイグ-ドーリーラット(250–300 g)	タコニックラボラトリーズ、ニュージャージー州

のセント州州クランベリー