刺激ラマン組織学と人工知能を使用した前立腺生検における癌の検出と分離

前立腺がんは、依然として世界中の男性に影響を与える主要な悪性腫瘍の1つであり、早期発見は介入と治療を成功させるために極めて重要です¹。歴史的に、前立腺がんの診断は、前立腺生検サンプルの組織病理学的評価に大きく依存しており、最も一般的にはヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色による評価^2。前立腺生検分析の従来の方法は効果的ですが、手続き上および物流上の要因により、都市や国によっては、通常、数日から数週間の待機期間が発生します。これらの遅延は、ホルマリン固定、パラフィン包埋、切片化、H&E染色など、複数の労働集約的なステップから生じます。したがって、累積処理時間と大量の生検サンプルが相まって、診断と治療計画が遅れる可能性があります。

近年のイメージング技術の進歩、特に刺激ラマン散乱(SRS)顕微鏡法は、バックグラウンドがなく、容易に^{解釈できる堅牢な}イメージング法を提供することで、診断手法を変革することができます^3,4。SRSは、ポンプビーム(ωp)とストークスビーム(ωs)の2つのレーザービームを利用し、サンプルと相互作用します。周波数差(Δω=ωp-ωs)が特定の分子振動周波数(Ω)と一致すると、誘導されたラマンゲインまたはラマン損失により信号が増幅されます。このプロセスにより、分子振動のコントラストが向上し、組織^3,4の高感度イメージングが可能になります。SRSは、脂質と相関するCH2伸縮振動(2,845 ^cm-1)と、タンパク質や^DNA4に関連する_CH3伸縮振動(2,930 ^cm-1)に関連する分子振動の検出を可能にします。 SRS信号の検出には、通常、高周波変調転送方式が含まれ、微弱な振動信号をバックグラウンドノイズから正確に分離できます。

SRS顕微鏡は、物理的な組織切片を必要とせずに正確な3次元イメージングを可能にする光学切片作成機能を備えています。これは、ポンプとストークスレーザービームを、特定の分子振動が励起されるサンプル内の回折限界スポットに整列させ、集束させることによって達成されます。レーザーの強度に対する二次的な依存性に由来するSRSの共焦点の性質は、信号が焦点面に限定されることを保証し、焦点が合っていない寄与を排除し、高度にローカライズされた化学情報を提供します^5,6。この深度分解イメージングは、機械的なスライスを排除し、処理時間を短縮し、サンプルの生物学的および分子的状況を維持することにより、組織の完全性を維持します。

SRSの原理に基づいて、刺激ラマン組織学(SRH)は、この分子振動データを利用して、新鮮で未染色の組織の疑似H&E画像をリアルタイムで作成し、臨床医により迅速で効率的な診断ツールを提供します^7,8。この高品質な画像を生成する能力により、SRHは研究や臨床応用に不可欠なツールとなっています⁹。最近、SRHを使用した術中マージン評価により、部分的な腺アブレーションおよび根治的前立腺全摘除術中にほぼリアルタイムの病理学的フィードバックが提供され、即時の治療調整が可能になりました^10,11。

SRHイメージャーは、固有の分子振動を活用して、組織組成に関する洞察を提供します。SRHは、CH₂およびCH₃の^{振動特性を分析する}ことにより、癌性前立腺組織と良性前立腺組織を効果的に区別するために使用できる^7,12。SRHイメージャーは、これらの振動を捕捉し、核のコントラストを高める疑似H&E画像を生成し、従来の組織病理学の迅速な代替手段として機能し、組織サイズ^7,8に応じて2〜8分で高品質の画像を提供します。

未処理の前立腺生検の迅速な病理学的検査に対するSRHの有効性が評価されました。病理学者は、前立腺切除標本から ex vivo で得られた前立腺生検コアからのSRH画像を解釈するように訓練されました⁸。SRHスキャン法は、数分以内に高解像度の画像を取得できるように最適化されており、従来の病理組織と比較して必要な時間を大幅に短縮しました。良性組織型と悪性組織型が混在する生検サンプルは、病理医のトレーニングセットとして機能し、病理医はSRHによって画像化され、H&E染色によって処理された別の生検セットの盲検評価を行い、グラウンドトゥルースとして機能しました。その結果、病理医が前立腺がんを同定するための平均精度は95.7%であり、臨床的に重要ながんの検出において良好な一致を示しており、SRHがほぼリアルタイムの診断を効果的にサポートできることが示され^ました8。

その後の研究では、人工知能(AI)が統合され、診断の精度、効率、実装の容易さがさらに向上しました。このAIモデルは、深層学習技術を用いてSRHが捉えた振動および形態学的特徴を解析し、前立腺生検サンプルを良性、がん性、非診断領域に自動的に分類することを可能にし、病理学的評価プロセスを大幅に効率化します⁹。SRH-AIの統合は、前立腺がんの検出で96.5%を達成し、感度と特異度はそれぞれ96.3%と96.6%という優れた精度を示しました⁹。AIとSRHの統合により、経験豊富な病理医に匹敵する診断性能を達成しました。

病理医によるSRHの広範な評価と、SRHイメージャーに統合されたAIモデルの開発を通じて、このテクノロジーの能力は大幅に向上しました。このプロトコルでは、前立腺生検サンプルの調製、SRHイメージャーを使用したイメージング、およびAI支援ツールによるデータの分析の詳細な手順を概説しています。これらの手順に従うことで、研究者や臨床医はこの新しい技術を活用して、前立腺がんの検出、研究、治療を強化することができます。

このプロトコルには、人間の標本の使用が含まれ、ブリティッシュコロンビア大学のヒューマンケアガイドラインに準拠しています。本研究は、SRH:H23-00459、AI:H24-00585、Biobank:H21-03722の倫理承認番号で、治験審査委員会(IRB)によって承認されています。書面によるインフォームドコンセントは、標本の収集前にすべてのヒト被験者から得られました。すべての手続きは、参加者の保護と機密性を確保するために、制度的および規制上の倫理基準に準拠して実施されました。

1. SRHイメージャーの電源を入れます

1. SRHイメージャーの電源を入れます(図1A)。システムを30分間ウォームアップして、レーザーが正確なイメージングに最適な動作温度に達することを確認します。

2.流体チャンバーを準備します

1. 滅菌水で満たされた50 mLシリンジを、SRHイメージャーインターフェースの左側にあるシリンジバルブに取り付けます(図1B)。適切な液体循環を維持するために、シリンジがしっかりと取り付けられていることを確認してください。

3. システムにログインします。

1. システムがロードされたら、タッチスクリーンモニターを使用してユーザー名とパスワードを入力します。
2. 適切なユーザー名を選択し、パスワードを入力します。 「ログイン」をタップします。
3. 免責事項に同意して、研究が米国または欧州連合以外で使用される場合、研究目的であることを認めます。

4. 新しいスタディを作成する

1. 表示オプションから「新規スタディを作成」、「既存のスタディを続行」、および「既存のスタディを表示」を選択します。

5. ケース情報の入力

1. 姓、名、医療記録番号、生年月日、アクセッション番号、試験ID、医師名、部屋番号、主要な解剖学的位置、分析モジュールなどの関連する症例情報を入力します。
2. サンプルを John Doe という名前で保存します (例)。
3. [Primary Anatomical Location] で、[Prostate (Research Use Only)] を選択します。
4. [分析モード] で [前立腺がん (研究用途のみ)] を選択し、統合された AI を前立腺がんの検出に使用します。

6. スタディ作成を完了し、流体チャンバーを充填します

1. ケース情報を入力したら、「 スタディを作成 」をタップします。
2. システムからプロンプトが表示されたら、[ 承認] をタップして、データが研究目的でのみ使用されることを確認します。
3. 指示に従って、液体チャンバーに滅菌水を入れます。
4. プロンプトが表示されたら「 次へ 」をタップし、表示されたオプションから 「取得」 を選択します。
5. Load New Specimenをタップすると、Prepare Specimen & Load NIO Slideが表示されます。

7. 試料とスライドの調製

1. 前立腺生検スライドを取り出します。歯付きのティッシュ鉗子を使用して、付属のカバースリップを慎重に開きます。スライドとカバースリップを開いたまま、組織鉗子を使用して、RPMI培地からの前立腺生検をスライドの溝にしっかりと配置します。カバースリップをそっと閉じて、サンプルを固定します。
2. SRHイメージャーインターフェースでスライドホルダーを開き、準備したスライドをスライドホルダーに挿入して、適切な位置合わせを確認します。SRHイメージャーの蓋を閉じます。システムが蓋が閉じていることを検出したら、[ 次へ ]をタップして続行します。

8. イメージング取得パラメータの設定

1. 次のイメージングパラメータを設定します。
   1. [Specimen Name] (検体名): 最初の生検には [Biopsy 1 A] を選択します。
   2. スキャン領域の場合:0.4 mm x 6.1 mm、3つの領域(研究用途のみ)を選択して、生検全体をスキャンします。
   3. スキャン位置の場合:画面上の画像を使用して、スキャン位置を手動で調整します。
2. 「画像を取得」をタップして続行します。
3. 画面に表示されるサンプルの詳細を確認し、[ 続行] を選択して確定します。

9. SRHイメージを取得する

1. SRHイメージャーがオートフォーカスして画像を取得し、最終的なSRH画像を生成するようにします。
2. 図2Aに示すように、イメージャーで3つのセクション(スキャン1、スキャン2、スキャン3)で生検をスキャンさせます。
3. イメージャでセクションを組み合わせて完全なSRHイメージ(図2B)を形成し、評価用の擬似H&Eイメージを生成します。

10. SRH画像の表示

1. 新鮮で染色されていない前立腺生検の SRH画像 をご覧ください。この画像は、CH₂ 分子振動(脂質に関連する)とCH₃ 分子振動(タンパク質およびDNAに関連する)を強調するピンク/紫の配色を使用してH&E染色を模倣しています。

11. 研究用途のみのSRH画像のAI解釈

1. 画面上の (>>)アイコンをクリックして 、AIオーバーレイを適用します。AIオーバーレイは、赤でがん領域、緑で非がん領域、紫で非診断領域を識別します(図3A)。
2. がん組織、非がん組織、および非診断組織の割合を定量化した棒グラフを確認します(図3B)。
3. (<<)アイコンをクリックして、AIオーバーレイのない元のSRH画像に戻ります。

12. SRH画像のズームとナビゲーション

1. タッチスクリーンの ズームイン および ズームアウト 機能を使用して、生検のさまざまな領域を詳細に探索します。
2. ナビゲーションアイコンを使用して画像内を移動し、生検サンプルを包括的に検査します。

13. 選択した組織の単離

1. 最初のスキャン後、スライドから生検を慎重に取り出します。歯付きの組織鉗子を使用して、付属のカバースリップを持ち上げ、生検を静かに解放します。
2. 生理食塩水に浸した湿らせたTelfaに生検を施し、トリミングプロセス中に組織の完全性を維持します。
3. AIが生成したSRH画像のオーバーレイで特定されたがん以外の領域を手術用ブレードでトリミングし、オーバーレイを視覚的に評価して除去に最適な領域を決定します。がんと組織の比率を高めるために、通常は生検の末端に位置する領域の切除に焦点を当てます。再スキャンのために十分な組織が残っていることを確認してください。

14.生検を再スキャンします

1. 手順9〜11で概説したのと同じ手順に従って、生検を再スキャンします。
2. スキャン領域と位置を調整して、がんと組織の比率が増加していることを確認します(図3C-Eを参照)。更新された SRH 画像と AI オーバーレイを確認して、がん領域と非がん領域の割合を確認します。
3. トリミングと再スキャンを繰り返して、目的の比率になるまで繰り返します。

15. バイオバンキングと凍結保存

1. 歯付きの組織鉗子を使用してスライドから生検を取り出します。生検をクライオチューブに入れます。
2. クライオチューブを液体窒素で凍結して、サンプルを迅速に保存します。
3. 液体窒素中のクライオチューブを-80°Cの冷凍庫または液体窒素貯蔵施設に移して、長期保存します。

16.画像データのエクスポート

1. 紙飛行機のアイコンをタップして、保存およびさらに分析するために画像データをエクスポートします。
2. エクスポート場所を選択するには、「エクスポート場所を選択」オプションをタップし、USB(非識別)、USB(完全)、iPhone(完全)から選択します。[USB(完全)]を選択し、データエクスポート用の外付けハードディスクを選択します。
3. エクスポートする画像シリーズを選択するには、「 スタディ全体 」を選択して、特定のシリーズではなく、患者のすべてのSRH画像シリーズをエクスポートします。
4. システムに 「エクスポートが進行中」 と表示されるのを待ち、エクスポートが完了したら「 確認 」をタップします。

17. SRH顕微鏡の電源を切ります

1. [終了]をタップし、画面に表示されるシャットダウンの指示に従います。
2. 画像データのアーカイブを求められたら 、[続行しない ]を選択します(すでにエクスポートされている場合)。
3. サンプルは、適切な実験室のプロトコルに従って廃棄してください。
4. [次へ]をタップし、指示に従って付属のシリンジを使用して液体チャンバーを空にします。
5. プロンプトが表示されたら「 次へ 」をタップし、表示されたオプションから 「はい 」を選択します。
6. シリンジを取り外して廃棄します。.
7. 「シャットダウン」をタップして、SRH顕微鏡の電源を完全にオフにします。

AIと統合されたSRHの適用により、生検サンプル内の前立腺がんの迅速な検出と特性評価が数分で実証されました。 図2A は、生検サンプル全体で3つの異なるスキャン(スキャン1、スキャン2、スキャン3)が実行されたSRHイメージャーのマルチステップスキャン手順の概要を示しています。各スキャンは、包括的なSRH画像を生成するために不可欠な、脂質、タンパク質、およびDNA含有量に対応する独自の分子振動シグネチャを捕捉しました。 図 2B に示されている最終的な合成画像は、H&E 染色を模倣しており、病理医にがん領域と良性領域を区別するための視覚的なツールを提供します。このアプローチにより、ほぼリアルタイムのラベルフリー診断が可能になり、生検取得から病理学的評価までの時間が大幅に短縮されます。

イメージングプロセスに続いて、図3Aに示すAI分析により、SRH画像に予測が自動的に重ね合わされることで、SRHの診断機能が強化されました。このオーバーレイは、図 3B の棒グラフで定量化されているように、腫瘍 (赤)、非腫瘍 (緑)、および非診断領域 (紫) で区別されました。このAI支援ワークフローにより、診断精度が向上し、関連性のない組織領域の選択的なトリミングが可能になりました。図3C-Eに示すように、トリミング後に生検を再スキャンしたため、がんと組織の比率が増加し、さらに分析のために最も関連性の高い領域のみが保存されるようになりました。

がんと組織比を検証するために、46の生検標本の収集、調製、スキャン、および評価を含む包括的な分析が行われました。各標本は、SRHを使用して最初のスキャンを受け、その後、AIが生成したオーバーレイに基づいて選択的なトリミングを行い、非がん性組織領域を特定して除去することで、バイオバンキングのためのがん組織を濃縮しました。次に、トリミングしたサンプルを再スキャンして、がんと組織の比率の改善を確認しました(図4A)。切除前と切除後のすべての標本におけるがんの割合の分布は、がん組織の割合の有意な増加を示し、平均して切除前の45%から切断後の78%に上昇しました(p < 0.0001、 図4B)。このアプローチにより、がん領域が確実に保存され、バイオバンキングアプリケーションに必要のない周囲の非がん性組織が除去されます。平均差は23%で、95%信頼区間(CI)は18.68〜27.40で、トリミングプロセスの有効性が確認されています。また、R2 値0.72は、トリミングプロセスとがんと組織比の改善との間に相関関係があることを示しており、検出とバイオバンキングを強化するためのこの反復スキャンおよびトリミングワークフローの信頼性をさらに検証しています。

逆に、 図5 は、組織スキャンの深さが不適切である、組織インクなど、最適でないスキャン条件で発生する制限を示しています。これらの場合、インクの汚染によりアーチファクトが発生し、組織がぼやけて精度が低下していました。これは、診断の信頼性を確保するために、細心の注意を払ったサンプルの取り扱いとプロトコルの順守の重要性を強調しています。具体的には、イメージング深度はSRH画質に重要な役割を果たします。SRH前立腺組織用イメージャーのデフォルトの自動設定は、イメージング深度20μmに最適化されています。 図5Aに示すように、10μmで取得した画像は、浅い深さのパラメータキャリブレーションが最適ではないため、鮮明に見えない場合があります。特定の関心深度に合わせてイメージングパラメータを調整することは、振動信号の検出と全体的な画像の鮮明さを向上させるために必要です。これらの考慮事項は、信頼性の高いSRHイメージング結果を達成し、臨床および研究ワークフロー中のアーティファクトを減らすために重要です。

さらに、標準的な組織病理学的実践であるティッシュインクは、腫瘍境界の正確な局在化のために外科的断端をマークするために使用されます。しかし、インクを塗った組織をSRHでイメージングすると、インクがレーザーベースの信号取得に干渉し、アーチファクトが生じる可能性があります。これらのアーティファクトは、 図5Bに示すように、通常、SRH画像で非特異的に暗くなった領域または信号ドロップアウトの領域として現れます。このようなアーチファクトを減らし、イメージングの精度を維持するためには、最小限の塗布と適切な乾燥時間を含む適切なインク技術が不可欠です。

図1:SRHイメージャと操作インターフェースの画像 (A)ログイン画面と操作インターフェースを表示しているSRHイメージャーの正面図。(B)SRHスキャナーの上面図、液体チャンバーのシリンジアタッチメントと、イメージングのために生検スライドが配置されるSRHイメージャーの蓋を強調しています。略語:SRH =刺激ラマン組織型。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:SRHを使用した前立腺生検イメージング (A)SRHイメージャーによる3つの長方形セクション(スキャン1、スキャン2、スキャン3)でシーケンシャルスキャンを受けた前立腺生検サンプルの概略図。破線は、スキャンされる生検領域を示しています。(B)スキャンされた前立腺生検サンプルの対応するSRH画像、セクション1、2、および3が組み合わされて完全なSRH画像が生成されます。破線は、スキャンされた各セクションを示しています。SRHイメージングプロセスは、生検組織の組織病理学的評価のための疑似H&E画像を作成します。スキャン3には気泡が見え、SRH画像には対応するアーティファクトとして表示されます。スケールバー = 500 μm (B)。略語:SRH =刺激ラマン組織型。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:SRHとAIを使用した前立腺生検における腫瘍検出の強化、および腫瘍と組織の比率を最適化するための生検の切断と再スキャン 。 (A) 図2の生検のSRH画像(左)と対応するSRH-AIオーバーレイ(右)。AI オーバーレイは、腫瘍領域を赤、非腫瘍領域を緑、非診断領域を紫で強調表示します。(B)初期SRH画像でAIによって特定された腫瘍および非腫瘍領域の割合を定量化した棒グラフ。非診断薬の0%は、腫瘍/非腫瘍の割合の計算から除外されていることを示します。(C)腫瘍と組織の比率を高めるために生検を切開し、再スキャンします。SRH画像は3つの異なるセクションでスキャンされるため(図2)、AIオーバーレイ画像を使用して、除去に最適な領域を視覚的に評価および特定できます。生検定規を使用して、トリミングを行う場所をガイドすることもできます。(D)生検が再スキャンされた後の更新されたSRH画像(左)と対応するSRH-AIオーバーレイ(右)。(E)AIによって特定された、再スキャンされた生検における腫瘍、非腫瘍、および非診断領域の割合を定量化した棒グラフ。スケールバー = 500 μm (A,D)。略語:SRH =刺激されたラマン組織学;AI = 人工知能。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:トリミングががん組織比に及ぼす影響 (A)46標本のがん組織プレカット(青)とポストカット(赤)の割合を示すペアデータプロット。各線は、個々の標本のプレカット値とポストカット値を接続しており、トリミング後のがん検出の増加を強調しています。(B)カット前とカット後のがんの割合の箱ひげ図で、中央値と四分位範囲を示しています。統計解析により、切除前と切除後のがんの割合に有意差(p < 0.0001)が認められ、平均差は23%(95%信頼区間:18.68-27.40)、R2 値は0.72であった。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:SRHイメージャーからの望ましくない結果の例(A)深さ10μmのインクマージンのないex vivoラジカル前立腺切除術標本から得られた前立腺生検のSRH画像で、組織の視覚化が不十分であることを示しています。(B)ex vivo根治的前立腺全摘除術標本から得られた前立腺生検のSRH画像で、深さ10μmのインク縁があり、組織分化不良と癌の境界が不明瞭であることを示しています。スケールバー = 500 μm (A,B)。略語:SRH =刺激ラマン組織型。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

C. Freudierは、Invenio Imagingの従業員、株主、取締役であり、独立してライセンス供与された刺激ラマン分光顕微鏡の特許を保有しています。A. Ion-MargineanuはInvenio Imagingの株主です。