方法論記事

プラスミドDNAトランスフェクションとmRNAヌクレオフェクションデリバリーを用いたヒト細胞におけるCRISPRエピゲノム編集

DOI：

10.3791/68089

⸱

2025年5月30日

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1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Berkeley, 2Chan Zuckerberg Biohub - San Francisco

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

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このプロトコールは、プラスミドDNAトランスフェクションおよびmRNAヌクレオフェクションを使用したヒト細胞株におけるClustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats(CRISPR)ベースのエピゲノム編集の方法を説明しています。

要約

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エピジェネティクスとは、遺伝子の発現を調節できるヒストンタンパク質とDNAの化学修飾を指します。ヒトエピゲノムは、細胞の分化や老化の際に動的に変化し、多くの疾患がエピゲノムパターンの異常化と関連しています。近年のCRISPRの進歩により、標的ゲノム遺伝子座のエピジェネティックな修飾を編集するためのプログラム可能なツールが開発され、ヒト細胞のエピジェネティックな修飾の正確な書き換えが可能になりました。CRISPRベースのエピゲノムエディターは、触媒的に死んだCas9とエピジェネティックな修飾因子の組み合わせに依存しており、最終的には哺乳類のゲノムにおける標的遺伝子のプログラムされた抑制または活性化をもたらします。従来のゲノム編集法とは異なり、エピゲノム編集はDNAの切断やヒトゲノム配列の変更を必要としないため、遺伝子発現を制御するためのより安全な代替手段として機能します。このプロトコールでは、プラスミドDNAトランスフェクションとCRISPRエピゲノムエディターをコードするmRNAのヌクレオフェクションを使用して、ヒト細胞株でdCas9を介したエピゲノム編集を行う2つの異なる方法に焦点を当てています。私たちは、CRISPR干渉(CRISPRi)を使用して遺伝子を一過性に抑制するプログラム可能なエピゲノム編集と、dCas9のKRABドメインと de novo DNAメチルトランスフェラーゼ複合体の融合であるCRISPRoffを使用して遺伝子を数週間永続的にサイレンシングするプログラム可能なエピゲノム編集を実証しています。また、標的遺伝子のエピゲノム編集の成功を測定するための定量的手法や、実験基準に応じてどのエピゲノム編集ツールを使用するかについての重要な考慮事項に関するガイダンスも提供しています。

概要

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私たちの体内のすべての細胞のゲノム含有量はほぼ同じですが、各細胞タイプの転写プロファイルは大きく異なります。DNAおよびヒストンタンパク質のエピジェネティックな修飾は、転写発現の重要な調節因子です。転写活性ユークロマチンは、コンパクトで転写活性のないヘテロクロマチンと比較して、明確なエピジェネティックマークによって特徴付けられます。例えば、ヘテロクロマティック領域は、ヒストン3のリジン9(H3K9me3)上のトリメチル化、ヒストンH3のリジン27(H3K27me3)上のトリメチル化、および遺伝子プロモーター1のグアニンの隣のシトシン(CpG)上のDNAメチル化を含む、抑制的なヒストン修飾によって定義されます。活性遺伝子発現のゲノム領域は、典型的には、ヒストン3(H3K4me3)1のリジン4上のヒストンアセチル化およびトリメチル化によって定義されます。

CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)革命は、ゲノム配列のプログラムによる改変を可能にする豊富なツールを生み出しました。CRISPR技術は、プログラム可能な標的配列で核酸を切断できる原核生物の防御メカニズムに基づいています。CRISPRヌクレアーゼ2,3,4

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プロトコル

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注: 補足ファイル1 には、代表的なデータのsgRNAデザイン、クローニング、および細胞株の生成に関する詳細が含まれています。代表的な結果セクションでは、コントロールの提案についても詳しく説明します。

1. エピゲノムエディター発現プラスミドのHEK293T細胞へのトランスフェクション

注:このプロトコルは、CRISPRをコードするプラスミドのHEK293T細胞への導入について説明しています。私たちは、GFPを内因的にタグ付けした非必須遺伝子である CLTAのプロモーター領域を標的とするsgRNA(Addgene 217306)を発現する細胞を改変しました。CLTA-GFP HEK 293T細胞は、以前の研究50に由来しています。この例では、エピゲノムエディターが青色蛍光タンパク質(BFP)に直接融合しているため、トランスフェクション効率を定量化し、実験条件を正確に評価することができます。このアプローチの有効性は、CLTA-GFPのサイレンシングによって実証されており、フローサイトメトリーを使用して単一細胞のタンパク質レベルで定量的に測定できます。

  1. 細胞培養
    1. 10% FBS と ....

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結果

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すべてのエピゲノム編集実験において、エピゲノム編集の効率を評価するためには、適切な制御が重要です。ヒトゲノムのどの配列も標的としないコントロールsgRNAの使用をお勧めします。ノンターゲティングガイドコントロールを使用すると、標的遺伝子座の変化が、エピゲノムエディターの過剰発現や非特異的結合だけでなく、その部位に誘導されるエピゲノムエディターによってもたらされることを確信できます。さらに、レポーター遺伝子ベースの実験では、レポーター発現の変化が、dCas9が標的遺伝子座に結合して一時的に転写を妨げる立体障害ではなく、エピゲノムエディターの融合によるものであることを確認するために、dCas9のみのコントロールを使用することをお勧めします(図2F)。

トランスフェクション実験では、エピゲノムエディターとBFPなどの蛍光タンパク質融合遺伝子を追加で使用することをお勧めします。この融合により、エピゲノムエディターでうまくトランスフェクションされた細胞を顕微鏡法とフローサイトメトリーで可視化することができます。トランスフェクションに.......

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ディスカッション

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このプロトコールでは、CRISPRエピゲノムエディター向けの2つの異なるトランジェントデリバリー方法、プラスミドDNAトランスフェクションとmRNAヌクレオフェクションについて詳しく説明します。どちらの手法にも、独自の長所、短所、および一般的な考慮事項があります(図 1F)。

プラスミドDNAトランスフェクションは、強力なエピゲノムエディターの発現につながり、エピゲノムエディターコンストラクト内にBFP融合を組み込んでおり、フローサイトメトリーを用いたトランスフェクション効果の検出と定量を可能にします。さらに、BFP発現は、エピゲノムエディタを発現する細胞をソートするために使用することも、このプロトコルで詳述されているように、後の時点でサイレンシングデータを正規化するために定量化することもできます。ただし、トランスフェクション効率は通常100%ではないため、細胞を選別しない限り、エディターを受け取った人と受けなかった人で集団が不均一になることに注意すること.......

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開示事項

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J.K.N.は、カリフォルニア大学のリージェンツが出願したCRISPRoff/on技術に関連する特許の発明者です。

謝辞

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Nuñez研究室のメンバー、特にRithu Pattali氏とIzaiah Ornelas氏には、この原稿に記載されているプロトコルの開発と最適化について感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
4D-NucleofectorLonzaAAF-1003
96-well tissue culture platesCorning3596
96-well U-bottom PlateCorning351177
APC anti-human CD55 AntibodyBioLegend311312
BD FACSymphony A1 Flow CytometerBD Biosciences
BleachWaxie
遠心分離機Eppendorf5425
Countess Automated Cell CounterThermo ScientificCountess 3
CRISPRoff transfection plasmidAddgene 
剤 2 フローサイトメトリー用血液学試薬(シース液)Thermo Scientific23-029-361
DMEM, High GlucoseThermo Scientific
DPBSGibco14-190-250
Eppendorf tubesThomas scientific1159M35
FBSAvantor Seradigm89510-186
ロンザ・ウォーカーズビル SF細胞株 4D-Nucleofector X Kit LFisher ScientificNC0281111
mMESSAGE mMACHINE™T7 ULTRA 転写キットThermo FisherAM1345
Opti-MEMGibco31985070
PCR strip tubesUSA Scientific 1402-4700
ペニシリン-ストレプトマイシン-グルタミンGibco10378016
pLG1 sgRNA発現プラスミドAddgene 
RPMI 1640Gibco22-400-105
SF Cell Line 96-well Nucleofector® キットロンザV4SC-2096
組織培養インキュベーターPHCbiMCO-170AICUVDL-PA
TransIT-LTI トランスフェクション試薬MirusMIR 2306
トリプシン-EDTA (0.25%)Gibco25200114
11003428432167981希釈 11965118 217306

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kimura, H. Histone modifications for human epigenome analysis. Journal of Human Genetics. 58 (7), 439-445 (2013).
  2. Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  3. Esvelt, K. M., Mali, P., Braff, J....

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dCas9CRISPRoffCRISPRi

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