げっ歯類における大麻製品の投与の代替方法としてのオロムコサール

サマリー

げっ歯類の強制経口投与は、拘束に伴う苦痛を引き起こす可能性があります。CBDが豊富な大麻抽出物の口腔粘膜/頬側投与を検討し、ラットを3mg/kg/日の抽出物で15日間治療しました。治療はマイクロピペットで経口投与され、愛情のこもったタッチ技術を使用して動物を扱いました。

要約

ラットなどの実験用げっ歯類への薬物の経口投与は、従来、強制経口法を使用して行われていました。効果があるにもかかわらず、強制経口投与は、特に動物を繰り返し扱った後、拘束に伴う苦痛を引き起こす可能性があります。これらの副作用を軽減し、従来の方法に関連する罹患率を減らすために、カンナビジオール(CBD)が豊富な大麻抽出物の口腔粘膜/口腔投与を検討しました。この方法では、雄のラットをココナッツオイルまたはCBDが豊富な大麻抽出物に由来する中鎖トリグリセリド(TCM)で15日間毎日治療しました。各治療は個別に投与され、動物は愛情のこもったタッチ技術を使用して優しく固定されました。投与には、マイクロピペットを使用して油性製剤を口腔粘膜に直接塗布することが含まれていました。投与量は、大麻抽出物中のCBD濃度に基づいて計算され、3mg/kg/日に標準化されました。精度を確保するために、動物の体重を毎日測定し、治療期間中の体重変化に応じて用量を調整できるようにしました。この方法は非侵襲的でストレス軽減の治療を提供し、実験環境における動物福祉を改善する可能性があります。CBDが豊富な大麻抽出物による治療は安全であり、これらの動物の海馬の分析では、グルタミン酸作動性受容体の機能と神経炎症に直接関連するGluA1タンパク質とGFAPタンパク質の発現レベルの変化が示されました。これは、大麻抽出物がグルタミン酸作動性興奮毒性およびアストログリオーシスが観察される病理学的状態に適用できることを示唆しています。

概要

実験動物における治療の可能性を秘めた医薬品や物質の投与は、前臨床研究の実験計画において依然として重要な要素です。一般的な方法には腹腔内、皮下注射、または経口強制経口療法が含まれますが、動物のストレス誘発性福祉の問題により、翻訳能力に制限があることがよくあります^1,2。さらに、これらの投与経路は、ヒトでの使用が推奨される経路を必ずしも反映しているわけではなく、臨床現場への所見の適用性に影響を与える可能性があります。特にげっ歯類はこれらの調査において重要な役割を果たし、人間の臨床シナリオをシミュレートするモデル生物として機能します。これらの研究の妥当性と信頼性を確保するには、研究動物へのストレスを最小限に抑え、そのような物質の人間の使用を模倣する実験条件を作成することが不可欠です。さらに、いくつかの薬物投与プロトコルがあり、この選択には、手順による潜在的な有害経験を最小限に抑えながら、動物への物質の送達を最適化するための慎重な検討と計画が必要です³。

これに関連して、目標は、現在の^{臨床診療6,7,8,9}と同様に、大麻抽出物の口腔粘膜投与^4,5を模倣し、ラット¹⁰の長期治療を促進するプロトコルを作成することでした。感情的な接触による固定化は、動物の首の後ろの皮膚をそっと後ろに引っ張り、ダムが子犬を運ぶ方法をシミュレートするために、尾が寝具に触れなくなるまでケージの上に持ち上げられるように行われます。マイクロピペットを使用して、油性溶液である大麻抽出物を口腔内に正確に沈着させ、頬の内層に触れ、続いてラットをケージに戻します。このアプローチは、ストレスを回避し、関係する動物の福祉を向上させる可能性があるだけでなく、前臨床方法を臨床実践とより密接に連携させることも目的としています。この調査により、この口腔粘膜投与プロトコルを受け、大麻抽出物で処理された健康なラットは、有意な神経化学的修飾を示したことが実証されました¹⁰。これらの変化は、治療の潜在的な神経保護効果を示唆しています。具体的には、CBDが豊富な大麻抽出物は、グルタミン酸作動性シナプスの分子構造を調節し、アストロサイトにおけるGFAP発現を調節し、ミクログリア細胞の形態を変化させることが判明しました。驚くべきことに、これらの神経化学的および細胞的適応は、観察可能な行動変化がない状態で発生し、治療の微妙な生化学的影響を強調しています¹⁰。

大麻植物は、古くから研究されてきた薬効があることで広く知られていますが¹¹、その生化学的組成と薬理学的可能性がより広く調査されたのはここ数十年だけです12,13,14。主な植物カンナビノイドであるカンナビジオール(CBD)と^Δ9-テトラヒドロカンナビノール(Δ 9-THC)、ならびにマイナーな植物カンナビノイドとテルペンは、いくつかの病状について説明されている無数の治療効果の原因です^15、16、17。この意味で、臨床現場での大麻ベースの製品の使用は、いくつかの^{臨床状態に対して}承認され、推奨されています6,7,8,18。これらの臨床の進歩に加えて、大麻ベースの製品を利用した前臨床研究が急増しています 9,19,20,21。このような研究は、生理学的反応、潜在的な副作用、および行動の変化を評価するのに役立ちます²²。薬物投与の経路は研究の重要な要素であり、文献では、吸入^23,24(または煙)、腹腔内注射²⁵、ミニポンプ26,27,28、強制経口投与²⁹など、植物カンナビノイドまたは大麻ベースの製品を投与するためにいくつかの治療アプローチが使用されています.これらの技術は、複雑さ、治療期間、完了時間が異なり、生理学的反応時間も異なり、動物の行動に影響を与えます。さらに、これらの技術の適用における誤りは、効果のない治療、研究のばらつきが高く、さらに^は個人の死につながる可能性があります3,30,31,32,33,34。

機械求心性の刺激がげっ歯類だけでなく人間のストレスを軽減するために標的にできることを示す証拠が増えています。したがって、身体的接触は、神経刺激への唯一の影響に加えて心理的特徴も調節し、長期的な軽度のストレスによって引き起こされる障害の改善に貢献します 35,36,37。この非侵襲的な方法は、動物の運動制限と過剰な取り扱いによるストレスの時間を短縮し、これらの動物の生活の質と生存を維持することで、長期治療を促進するために開発されました。さらに、この方法は他のげっ歯類種や経口薬にも使用できます。

プロトコル

研究は倫理基準に従って実施されました。すべての手順は、リオデジャネイロ連邦大学 (UFRJ) の健康科学センター (CCS) の研究における動物の使用に関する倫理委員会 (CEUA) によって承認されました。CEUA:079/22(プロトコルコード014/19、2019年3月27日に承認)。

1. 動物の体重に応じた投与量の計算

1. 投与プロトコルを開始する前に、生後45〜60日齢の雄のWistarラット(Rattus norvegicus)を治療群に分けます。1つのグループは、ココナッツオイル由来の中鎖トリグリセリド(MCT)を対照として投与され、もう1つのグループにはCBDが豊富なフルスペクトラム大麻抽出物が投与されました。両方の治療を毎日15日間投与します。大麻抽出物の投与量を 3 mg/kg/日に標準化し、正確な投与量を確保するために各動物の体重に基づいて毎日調整します。
2. 動物の体重を量る: 小さな容器を使用して、各ラットを個別に体重計に置きます。重量(g)が安定するまで待ちます。動物を体重計から取り除きます。
3. 投与量の計算: 動物の体重に基づいて投与する用量を計算します。次の式を使用します。
   用量(mg)=[体重(g)×CBD濃度(mg/kg)]/1,000
   注:このプロトコルでは、CBD濃度が24 mg / mLのCBDが豊富な大麻抽出物を使用しました。この場合、例えば、200gの動物に投与された溶液の総量は25μLで、頬の内側に置かれる量は少なかった。
   1. 次の標準式を使用して、投与量を計算します
      体積(μL)= [D(mg/Kg)×W(g)]/C(mg/mL)
      ここで、D = 投与される用量、W = 動物の体重、C = 溶液濃度
4. 各動物に必要な投与量を記録します。

2. 大麻抽出物の固定化と投与

1. 準備:投与時に、障害を避けるために、ケージグループから動物を個別に連れて行きます。マイクロピペットを使用して、個々の動物ごとに大麻抽出物の計算された投与量を描きます。
   注:動物は、障害を最小限に抑えるために、投与手順中にのみ短時間分離されました。ネズミは永久に隔離されませんでした。
2. 固定化: 首の後ろの皮膚をそっと後ろに引っ張って、動物をそっと固定します。尾が家庭の寝具に触れなくなるまで、ケージの床の上に持ちます。動物の動きが危害を加えることなく適切に制限されていることを確認してください。
   注: このステップでは、苦痛を避けるために、しっかりと優しく握る必要があります。
   1. 動物が動揺している場合は、高く上げた動物を柔らかくスイングして落ち着かせてください。
3. 投与: 大麻抽出物を含むピペットチップを動物の頬の内側に慎重に置きます。動物が大麻抽出物を飲み込むようにしてください。このステップには約30秒かかります。
   1. マイクロピペットは動物の口腔内に配置されており、投与量が少ないため、動物が溶液を吐き出す可能性は低いです。ただし、これが発生した場合は、過剰摂取を避けるために、再度投与しないでください。
      注:使用されたCBDが豊富な大麻抽出物のストック溶液には、その製剤に24 mg / mLのCBDが含まれており、そのビヒクルはMCT(中鎖トリグリセリド-ココナッツオイルによって提供される)でした。オイルは、CBDなどの水溶性の低い薬物、大麻由来の抽出溶媒として広く使用されています。MCTは、これらの製剤のより良いバイオアベイラビリティと安定性をもたらす効率的な媒体である38,39,40。油性溶液によるこのような濃度の上昇と高粘度により、動物の頬の内側に非常に少量の量を配置することができ、その一部がこぼれる可能性が非常に低かった。そのような損失は場合によっては発生する可能性がありますが、その体積の一部が粘膜から吸収されるのではなく直接飲み込まれることに加えて、それは^{主に子供で}臨床現場で起こることの非常に信頼できる表現です^6,7。
4. 各一連のトリートメントが同じオペレーターによって行われ、オペレーターがアロマのある化粧品を使用していないことを確認してください。

3. 投与後のケアと分析

1. 動物をそっと放し、そのグループに戻します。
2. 投与後、即時の副作用がないか動物を短時間(約5〜10分)監視します。これには、行動の変化、特にカンナビノイドテトラッドに関連する兆候(カタレプシー、自発運動活動の低下、眼瞼下垂、低体温症)の綿密な観察が含まれ、大麻抽出物に対する予期しない、または過剰な反応を示している可能性があります。さらに、呼吸困難(呼吸困難、喘鳴)および口腔刺激(炎症、過度の唾液分泌)の兆候がないか動物を監視します。
3. 嘔吐や下痢などの胃腸障害の兆候は、動物福祉を損ない、治療を妨げる可能性があるため、特に注意してください⁴¹。この研究では副作用は観察されなかったことに注意することが重要です。
4. 15 日間の治療の影響をさらに評価するには、包括的な一連の分析を実行します。これらには、自発運動活動を評価するためのオープンフィールドテストを使用した行動評価と、短期記憶を評価するための新しい物体認識テストが含まれます。
5. 動物を安楽死させ、海馬組織を採取してウェスタンブロッティングを行い、シナプス可塑性とグリア活性に関連するタンパク質レベルを定量化します。免疫組織化学を実行して海馬内のミクログリアの形態と食作用を調べ、CBDが豊富な大麻抽出物への長期曝露によって誘発される細胞および分子の変化を詳細に理解します¹⁰。

4. オープンフィールドテストプロトコル

1. 動物を正方形のアリーナの中央に個別に配置します。カメラをパソコンに接続した状態で撮影を開始します。アリーナのエリア全体を表示できるように、カメラが正方形のアリーナの上に配置されていることを確認してください。
2. ストップウォッチを5分間設定します。各ネズミはアリーナを自由に探索する必要があります。期間が経過したら、ストップウォッチと記録を一時停止します。
3. 正方形のアリーナから動物を取り除きます。

結果

この方法論は、私たちのグループで以前に使用されていました。この研究では、成長、行動、シナプスの変化に焦点を当てて、カンナビジオールが豊富な大麻抽出物の長期的な影響を調査します。CBDが豊富な大麻抽出物を3mg/kg/日の用量で口腔粘膜投与しても、思春期から成人期初期までの動物の成長に悪影響を及ぼすことはありませんでした。尿量、食物と水分の摂取量、体重増加などの主要な生理学的パラメーターが細心の注意を払って評価されました。二元配置分散分析では、体重に対する時間の有意な影響が明らかになりましたが、治療の有意な影響はありませんでした(図1)。治療期間の終わりに、対照動物は平均体重249.1 ± 5.7 gに達しましたが、抽出群の動物は258.6 ± 6.5 g¹⁰に達しました。

これらの発見に基づいて、結果は、大麻抽出物をラットに送達するための効果的で忍容性の高い方法として口腔粘膜投与プロトコルを検証しました。CB...

ディスカッション

記載されているプロトコルは、ラットにおける大麻抽出物の口腔粘膜投与に対する洗練されたアプローチを提供し、オペレーターと最も重要なことに動物の両方にとって快適であるという顕著な利点を示し、健康、安全性、および効果的な吸収のための投与用量の正確な制御を提供します。口腔粘膜経路は経済的で比較的安全であり、一部の動物は、投与される化合物^{3に応じて自発}的に協力するように訓練され4、従来の強制経口法^30,33および実験者の取り扱いに典型的に関連するストレスを軽減することができる。腹腔内注射は経口経路と同様の薬物動態挙動を持っていますが、主に口腔粘膜(経粘膜)または経口経路、特にCBDが豊富なものによって投与されるヒトにおける大麻ベースの製品の投与の優先経路を模倣していません42,43,44。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
CBD強化カンナビス抽出物	ファーマカンナビスプロジェクト - リオデジャネイロ連邦大学(UFRJ)	x	カンナビノイド濃度:CBD = 24.0 mg/mL; ?9-THC = 1.0 mg/mL;CBDA = 0.5 mg/mL;THCAとCBNは検出されませんでした。
手袋	ヌガード	カリフォルニア州41.485	合成ゴム材料(ニトリル)
マイクロピペット	Labmate pro/LabMate+	LMP-200	20-200ul
中鎖トリグリセリド(MCT)の油性溶液	MCT;ブレインTCM、プラヴィダ	7907981000102	車両としての利用
規模	123 util	1783912	最小感度と最大感度はそれぞれ1gと10kgです