Imiquimodによる乾癬マウスモデルの作製

サマリー

ここでは、イミキモドの利用により確立された、非常に有効で安定した乾癬モデルマウスを紹介します。さらに、乾癬の重症度を評価するために採用された方法論について詳しく説明します。

要約

乾癬は、皮膚の肥厚、スケール、紅斑を特徴とする、一般的な慢性の再発性炎症性の皮膚疾患です。この疾患の病因は非常に複雑で、遺伝学、免疫、環境要因などのさまざまな要因の相互作用が関与しています。乾癬の根底にあるメカニズムを調査するために、研究者は乾癬の複数の動物モデルを開発しました。しかし、方法論のばらつきは、これらのモデルを一貫して構築するための課題を提示しています。本研究では、imiquimod(IMQ)を用いて高効率で安定な乾癬マウスモデルを確立し、総合的に評価した。8週齢のSPFグレードの雌C57BL/6Jマウスを用いて、乾癬マウスモデルを確立しました。1週間の順応後、脱毛領域に皮膚が炎症または損傷したマウスを除外しました。2日目から、5%IMQクリーム(62.5mg / d)を7日間連続して脱毛した首と背中の領域に毎日塗布しました。実験では、体重の日々の測定、皮膚撮影、皮膚のスコアリング、行動観察を行いました。実験後、脾臓指数の決定、皮膚組織学的分析、血清サイトカイン検出、および皮膚mRNAレベルの検出を行いました。その結果、IMQ群のマウスは、紅斑、鱗屑、皮膚の肥厚などの典型的な乾癬様症状を発症し、引っ掻く行動の増加、体重減少、脾臓指数の上昇、皮膚の厚さの増加を伴うことが示されました。また、血清中のTNF-α、IL-23、IL-17Aのレベル、および皮膚中のIL-23、IL-17A、IL-17F、IFN-γのmRNAレベルに大幅な変化が見られました。血清サイトカインレベル(TNF-α、IL-23、IL-17A)と炎症誘発性マーカー(IL-23、IL-17A、IL-17F、IFN-γ)の皮膚mRNA発現は、著しく上昇しました。対照的に、対照群はそのような変化を示さなかった。この研究は、IMQ導入時間を最適化し、投与プロトコルを標準化することにより、皮膚の変化を動的に監視しながら、研究者が信頼性の高い乾癬モデルを構築するための標準化されたフレームワークを提供することを目的としています。

概要

乾癬は、一般的な慢性、再発性、および炎症性の全身性皮膚疾患であり、尋常性乾癬が最も主要な臨床症状^です1。その臨床的特徴には、通常、皮膚浸潤、厚さ、鱗屑、紅斑²が含まれ、乾癬性関節炎、うつ病、メタボリックシンドローム、心血管疾患¹など、さまざまな合併症を引き起こすこともあります。さらに、乾癬はしばしば慢性掻痒症を伴います³。世界的に、乾癬^は人口の2%から3%に影響を及ぼし4、その発生率は増加しています。したがって、ヒト乾癬の病理学的特徴を厳密に模倣した信頼性の高い動物モデルを確立することは、その病因を明らかにし、新しい治療戦略を開発するために重要です。

皮膚科学研究の分野では、乾癬は、遺伝的、免疫学的、環境的要因の相互作用を伴う複雑な病因により大きな注目を集めており、詳細な研究には大きな課題があります¹。現在の研究では、乾癬の発症は主にT細胞によって媒介され、活性化するとケラチノサイトが過剰増殖し、分化過程でサイトカインの分泌を変化させることが示されています⁵。このプロセスでは、インターロイキン(IL)-23/IL-17軸が極めて重要な役割を果たします。IL-23は、IL-17AやIL-17Fなどのサイトカインを産生するTh17細胞の分化と活性化を促進し、乾癬の発症に重要な役割を果たします^6,7,8。現在、乾癬の病因には多数の分子変化が含まれます。これらには、腫瘍壊死因子-α(TNF-α)、IL-23/IL-17軸、IL-37、核内因子-κB(NF-κB)などの細胞内シグナル伝達経路、ヤヌスキナーゼシグナル伝達および転写活性化因子(JAK-STAT)などのサイトカインが含まれます。さらに、糖に関連する分子、トリカルボン酸回路(TCA)、アミノ酸、脂質代謝経路、およびDNAメチル化やヒストン修飾などのエピジェネティックな調節因子と密接に関連しています。これらの標的は複雑に絡み合い、互いに相互作用し、乾癬⁹の発症と進行を共同で推進します。

現在の乾癬研究では、自然発生モデル、同種移植モデル、トランスジェニックまたは遺伝子ノックアウトモデル、化学的に誘導されたモデルなど、さまざまな動物モデルが採用されています¹⁰。これらの動物モデルは乾癬の研究において重要な役割を果たしており、科学者たちはマウス、モルモット、ゼブラフィッシュなどの複数の種を利用して乾癬モデルを構築しています11,12,13。しかし、これらのモデルはすべて、遺伝的複雑さ、種の違い、倫理的懸念、コストの考慮事項など、一定の制限がある¹⁴。

イミキモド(IMQ)は、Toll様受容体(TLR)のアゴニストとして、皮膚の炎症と免疫細胞の浸潤を引き起こすと同時に、ケラチノサイトの増殖と真皮血管の強化を促進することができます¹³。ある研究によると、IMQの局所適用はヒトで乾癬を誘発する可能性がある¹⁵。臨床観察では、IMQが患者の乾癬症状を悪化させることも明らかになっています⁷。マウス乾癬モデルでは、5%濃度のIMQを連続投与すると、紅斑や鱗屑などのヒト乾癬の皮膚症状を再現できます。さらに、他の症状は、表皮肥厚症や不全角化症、新生血管新生などの表皮の変化を含む、ヒト尋常性乾癬の症状と密接に類似しています。IMQによって誘発された乾癬マウスモデルも、慢性掻痒^症4をシミュレートすることができます。乾癬^{マウスモデル2,16}では、T細胞、好中球、樹状細胞からなる炎症細胞の浸潤もあります。IMQ誘発性皮膚病変は主にTNF-α-IL-23/IL-17軸に依存しており、IMQベースの乾癬マウスモデルを利用してヒト乾癬⁹をさらに調査できることを示しています。

本研究で用いたIMQ誘発性乾癬マウスモデルは、C57BL/6やBALB/cなど、それぞれTh1とTh2の傾向を持つマウス系統に適しています^7。このモデルは、低コスト、短い実験期間、簡単な操作、明確な症状、および高い成功率という利点があり、安定性と高効率です。実験では、乾癬の進行を監視するために採用されたいくつかの方法の詳細な説明を提供しました。これらの方法には、皮膚のスコアリングと行動テストが含まれていました。さらに、病理組織学的解析、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)を活用して、実験結果をさらに検証しました。このモデルは、乾癬の病因を探るだけでなく、新しい治療アプローチの前臨床評価にも適しており、研究における貴重なツールとなっています。

プロトコル

以下の動物使用プロトコルは、広西チワン族自治区中医薬大学の施設福祉および倫理委員会(DW20191220-153)によって審査され、承認されています。購入したマウスの動物証明書はSCXK(Xiang)2024-0009でした。本研究では、8週齢のC57BL/6J雌マウス(SPFグレード)を無作為にグループに分け、各グループに6匹のマウスを含めました。ケージは温度管理された部屋(23±2°C、明暗サイクル12時間)に置かれ、食事と水に自由にアクセスできます。実験のフローチャートを 図 1 に示します。IMQクリームで誘導されなかったことを除いて、対照群のマウスは、他のすべての点でIMQ群のマウスと同じ治療を受けました。

1.動物の調理

1. 動物を環境に1週間適応させた後、モデリングを開始します。実験を開始する前に、75%エタノール溶液を使用して実験テーブルを細心の注意を払って消毒してください。
2. マーカーペンを使用して、マウスの尾にはっきりと印を付け、個々の識別を確保します。
3. シェーバーを使用して、すべてのマウスの首と背中の毛を約4 cm x 3 cmの領域で剃ります(0日目; 図2A)。綿棒を使用して、剃った皮膚に適切な量の脱毛クリームを塗布し、均等に広げます(図2B)。
4. 脱毛クリームを塗布した後、約15秒待ちます。脱毛クリームをマウスの皮膚表面に最適に15〜20秒間放置します。やさしく素早く拭きます。
5. 新しい綿棒を使用して水に浸し、マウスの尻尾から頭の方向に繰り返し拭いて髪をきれいにします。医療用吸収紙で局所的な皮膚をやさしく乾かします。
6. 脱毛後24時間でマウスの皮膚状態を調べ、脱毛部が損傷しているマウスは除外します。

2. IMQ誘発乾癬マウスモデル

1. シェービングや脱毛によるわずかな皮膚の損傷が完全に回復していることを確認してください。
2. 2^日目 から、5%IMQクリームを62.5mg^の用量で塗布します7。これを行うには、事前に1 mLシリンジ全体にIMQクリームを充填し、フラットハンドルスプーンを使用して、マウスの脱毛した皮膚に1日あたり62.5 mgのIMQに相当する量に従ってマウスに薬物を投与します(図2C)。塗布中は、IMQクリームが脱毛領域全体にできるだけ均等に広がり、塗布領域が脱毛領域よりも小さいことを確認してください。
3. 薬物を塗抹した後、マウスを空のケージに入れて15分間待ちます。薬物が完全に吸収された後、マウスを給餌ケージに戻します。薬物塗布を7日間連続して実施します。

3. 乾癬マウスの体重解析

1. 電子天秤に清潔なビーカーを置き、風袋引きします。次に、マウスをそっと内側に置き、天びんに表示される安定した測定値を確認します。
2. 1日目(IMQの初回適用の前日)から、8日目まで毎日マウスの体重を量ります。各マウスの体重を1日目の対応する体重と比較します。

4. 乾癬マウスの皮膚特性評価

1. 定規で白い背景にマウスを置きます。マウスの体は、頭を縮めたり大きく振ったりしないようにまっすぐに保ちます(図3)。
2. 1日目から、毎日同じ照明強度でマウスの投与部位の高解像度写真を撮り、マウスの皮膚特性を記録します。
3. 各撮影セッション中は、カメラとマウスの間の距離とカメラの倍率を一定に保ち、定規をカメラに対して垂直に配置します。

5.スキンスコアリング

1. マウスの乾癬皮膚炎の重症度を、修正された乾癬面積と重症度指数 (PASI)¹⁷ を使用して、1 日目から 8 日目まで毎日採点します。二重盲検法を使用して 3 人の研究者を雇用し、紅斑、鱗屑、および皮膚の厚さを 0 から 4 のスケールで独立して採点し、3 人の算術平均を取ります。PASI スコアリング ルールについては、 表 1 を確認してください。
   PASI スコア = 紅斑 + スケール + 厚さ

6. マウスの行動観察

1. 同じ静かで常点灯の環境(ステップ4など)で、各マウスを個別のアクリルボックス(10 cm x 10 cm)に入れ、底に少量のトウモロコシの穂軸のパッドを入れます。
2. 黒いパーティションを使用して各ボックスを分離し、視線を遮ります。15分間の順応期間の後、動物の行動を1時間ビデオに記録します。
3. 1日目から8日目まで、毎日決まった時間に行動ビデオを録画します。カメラレンズをアクリルボックスに対して垂直に配置し、マウスの活動を完全にキャプチャしていることを確認します。
4. マウスが後ろ足を持ち上げて首と背中を引っ掻き、その後下げる例を 1 つのかゆみ動作として記録します。

7. ELISAによる血液の採取と血清中のサイトカイン濃度の測定

1. 鉗子でマウスの眼球をすばやく取り除き、9日目に血液を採取します。
2. 血液を4°Cで4時間放置します。3000 x g の低温遠心分離機を使用して、4°Cで30分間血液を分離します。 血清を採取し、将来の使用のために-80°Cで保存します。
3. メーカーのプロトコル¹⁸に従って、関連するELISAキットを使用して血清TNF-α、IL-17A、およびIL-23レベルを定量します。

8.皮膚と脾臓のサンプリング

1. 関係動物実験倫理委員会の規程により、マウスの頸椎を脱臼して9日目に採血後、安楽死させる。
2. 安楽死後、マウスの背中の皮膚病変を2つに切ります。1つの部分を4%パラホルムアルデヒド溶液を入れた5 mLの遠心分離チューブに浸して、固定および保存します。皮膚組織の他の部分を分離して包装し、将来の使用のために-80°Cで保管します。
3. 滅菌したハサミを使用して、マウスの腹部の正中線に沿って皮膚を切り開き、腹腔を露出させ、脾臓を見つけて完全に取り除きます。滅菌生理食塩水でサンプルを洗浄し、次にそれらを通常の生理食塩水に入れ、秤量し、データを記録します。

9. 皮膚切片の組織学的解析

1. パラホルムアルデヒドから皮膚組織を取り出し、包埋ボックスに入れます。
2. 皮膚で次の手順を実行します:75%から100%(低濃度から高濃度まで)の勾配アルコールを使用し、100%アルコールの3つのタンクを使用します。室温で各タンクに30分間放置します。キシレンのタンクを2つ使用します。室温で各タンクに30分間放置します。融点が56〜58°Cのパラフィンワックスの3つのタンクを使用します。 各タンクに室温で1時間放置します。
3. 処理した皮膚組織を埋め込む:ワックスを含浸させた皮膚組織をパラフィン型に直立させます。包埋パラフィンの温度がパラフィンの融点より5〜7°C高い場合は、溶かしたパラフィンを型に流し込みます。すばやく冷凍テーブルに移して、ワックスブロックを急速に冷却して固めます。
4. ワックスブロックを0°Cに凍結し、埋め込みボックスから取り出し、スライサーのクランプテーブルに固定し、厚さ3μmにスライスします。
5. ピンセットを使ってスライスをつまみ、45°Cの温水で湯通しします。 スライドの滑らかな部分の中央にセクションを取り付け、つや消しの領域に病理学的番号を鉛筆でマークします。スライドを45°に傾けて水分を流し、62°Cのオーブンに入れて30分間焼きます。
6. HE染色:スライスをキシレンに5分間入れ、次にキシレンの別のタンクに5分間、無水エタノールに1分間、95%エタノールに1分間、85%エタノールに1分間、75%エタノールに1分間入れます。水道水で1分間すすぎ、ヘマトキシリン溶液で5分間染色し、ヘマトキシリン溶液を流水で1分間洗い流します。
7. 1%塩酸エタノールに3秒間浸し、水で20秒間洗浄し、ブルーリターンに温水を5分間使用し、流水で2分間すすぎ、0.5%エオシンで1分間染色し、95%エタノールに2秒間浸し、次に95%エタノールに2分間浸し、無水エタノールに4分間浸します。 無水エタノールの別のタンクで4分間、キシレンで4分間、キシレンの別のタンクで4分間、キシレンの最後のタンクで4分間。風乾後、中性ガムで密封します。
8. 切片を顕微鏡で観察し、400倍率で3つの位置でランダムに写真を撮ります。各画像について、Image Jソフトウェアを使用して5つの場所で表皮の厚さをランダムに測定します。データを記録して分析します。

10. RT-qPCRによる皮膚中のIL-17A、IL-17F、IL-23、IFN-γのmRNAレベルの測定

1. -80°C、重量約100mgの冷蔵庫に保存した皮膚組織を取り出し、トリゾール法でRNAを抽出します。
2. 逆転写キット(VAZYME、中国)に従ってcDNAに逆転写します。
3. マニュアルに従ってPCR反応システムを設定し、指定された反応手順(表2)およびプライマー配列(表3)の下で蛍光定量PCR装置を使用してリアルタイムPCRを実施します。
4. リアルタイムの蛍光定量PCRデータを収集し、qPCRアルゴリズム(2-ΔΔCt法)を使用して結果を計算および分析します。

結果

IMQの連続投与後、IMQ群のマウスは乾癬を彷彿とさせる背中の皮膚の臨床症状を示し(図4)、IMQによって誘発された領域は紅斑、鱗屑、および厚さの典型的な症状を示しました(図5)。対照的に、対照群はIMQ群と同様の症状を示さなかった。対照群と比較して、3日目からIMQ群では紅斑と小鱗屑が現れ始めました(図5A、C)。5日目までに、これらのマウスは表面スケールが増加した浸潤性プラークを発症しました(図5E)。8日目までに、皮膚紅斑が激しくなり、表面に広範な鱗屑が見られ、表皮の厚さが著しく、ヒト乾癬病変に似た発疹が現れ(図5B、D、F)、合計スコアが大幅に増加しました(図5G、H)。

ディスカッション

私たちの研究では、IMQを利用して乾癬様皮膚病変を誘発し、乾癬モデルを構築しています。このモデルは、乾癬の発症の根底にあるメカニズムを研究し、乾癬の治療法の開発に関する洞察を提供するために使用できます。van der Fits⁷ による研究では、最初に IMQ 導入を実施したとき、導入時間は 5 日または 6 日に設定されました。それにもかかわらず、Jabeen らは、IMQ 誘発性乾癬モデルの重症度は、IMQ¹⁶ の適用後^{6 日目から 8 日目にかけて}最大値に達することを示唆しました。これを考慮して、IMQ誘導時間を7日間に延長することにより、実験プロトコルを最適化しました。この調整により、乾癬の症状をより包括的に明らかにすることができ、以前のプロトコルと比較して乾癬の典型的な特性を示すのにより有利になります。

以前の研究

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
5% イミキモドクリーム	四川メドシャイン製薬株式会社
40220602 75% エタノール	XUE HUAN	20240401
分析天秤	ザルトリウス	SQP
脱毛クリーム	レキット ベンキーザー	20240612 08X
電子スケール	Yingheng Technology	7915
医療用ティッシュペーパー	JD	20221208
シェーバー	HORD深セン	AUX-C6S
滅菌綿棒	北侖川	20230728