ペンチレンテトラゾール誘発性発作の行動特性評価:ラシーンスケールを超えて

サマリー

このプロトコルは、マウスのペンチレンテトラゾール誘発性発作に関連する行動を分析および視覚化するための革新的な方法を導入しています。このアプローチは、従来のRacineのスコアを超えて、発作行動の多様性と時間的ダイナミクスのより包括的な評価を提供します。

要約

てんかんの動物モデルでは、発作の詳細な行動特性評価が不可欠です。発作を誘発するためのさまざまなプロトコルが存在しますが、ラシーンスケールは依然としてその定量化に最も広く採用されている方法です。当初は、大脳辺縁系構造の電気的燃焼中の行動の漸進的な動員をスコアリングするために開発されましたが、その後、さまざまな病因を持つモデル間で発作を分類するための標準になりました。

しかし、一般的に使用される発作モデルであるペンチレンテトラゾール(PTZ)投与後の行動を注意深く検討すると、ラシーンスケールでは、このGABA作動性拮抗薬によって誘発される行動変化の全範囲を捉えることはできないことが明らかになりました。単回皮下高用量PTZ注射後、マウスは最初に筋緊張低下、歩行減少、行動停止、振戦などの非けいれん行動を示します。これらは、けいれん、ミオクローヌス痙攣、大脳辺縁系発作などの発作性行動によって引き継がれますが、ラシーンスケールで定量化されるのは後者のみです。

これらの制限を克服するために、ビデオタグ付けと動物の追跡を組み合わせて、痙攣とミオクローヌスを大脳辺縁系発作とは異なる行動表現として区別する洗練されたアプローチが採用されています。これらの初期の行動は、大脳辺縁系構造の動員を促進し、最終的には大脳辺縁系発作を引き起こす可能性があります。この方法は簡単に実施でき、PTZ誘発性急性発作のより包括的な評価が可能になります。その有用性は、PTZの低用量を繰り返すと、けいれん、ミオクローヌス、および大脳辺縁系発作の重症度の時間的変化をもたらすPTZキンドリングプロトコルでさらに明らかです。このアプローチは、てんかんおよびてんかん研究における再現性を向上させる可能性を秘めています。

概要

てんかんの行動特性評価は、てんかんの病態生理学および発作活動の研究で最も採用されている読み出しであり、新しい抗てんかん薬のスクリーニングに広く使用されています^1,2。過去50年間に発表された研究のほとんどは、ロナルド・J・ラシーンが開発したプログレッシブスコアシステムを使用して、扁桃体と海馬の焚き付け中の行動発作の重症度を記述しています³。ラシーンスケールは、ラット³およびネコ⁴における行動と電気生理学的発作活動との間に強い相関関係を示した。この研究では、発作の行動表現を「(i)口と顔の動き、(ii)頭のうなずき、(iii)前肢のクローヌス、(iv)後ずさり、(v)後ずさりと転倒」の5つの進行性段階に分類^{しています3。}そのシンプルさ、使いやすさ、解釈のしやすさ、採点の速さ、再現性により、てんかんや発作の研究におけるRacineスケールの使用は、現在でも拡大を続けています(図1)。

プロトコル

すべての実験手順は、リオグランデ・ド・ノルテ連邦大学の地元の倫理委員会によって承認されました(プロトコル番号043/2022、ライセンス番号307.043/2022)。このプロトコルでは、生後3ヶ月から4ヶ月までの雄C57BL/6マウスを使用し、確立されたPTZ誘導プロトコル¹⁶に従って6〜10匹の推奨サンプルサイズを使用しました。

1. 観測アリーナの準備

1. 表面積が10 x 10 cm以上、壁の高さが30 cm以上の正方形または円形のアリーナを使用してください。アリーナが十分に照らされていることを確認してください。必要に応じて、赤外線照明を使用して飽和画像取得を保証します(図2A)。
2. アリーナの上に少なくとも1台のビデオカメラを置き、アリーナの床全体と壁の少なくとも10 cmを上から見下ろします(マウスの頭を切り取らずに飼育行動をキャプチャするため、 図2B)。
3. 必要に応じて、アリーナの正面から見える2台目のビデオカメラを配置します。この場合、アリーナの壁の1つが透明であることを確認してください。
4. 温度(21-24°C)と湿度(50-70%)が動物施設の条件と一致していることを確認し、温湿度計....

結果

PTZ誘発性発作時の発作挙動を詳細に説明するコーディング戦略とその能力を評価するために、最初にPTZを3回投与して試験し、C57BL/6マウスへの影響を観察しました(それぞれ40、60、80 mg / kg、N = 7、5、5)。PTZの3回の投与で観察された行動転帰は、1回の注射後に明確な用量依存的な違いを明らかにしました。40 mg / kgPTZで治療された動物はけいれんを示しましたが、大脳辺縁系発作やミオクローヌスは認められませんでした。.対照的に、60 mg/kg と 80 mg/kg で治療された動物では、一貫してけいれん、ミオクローヌス、および辺縁発作が発現しました。PTZを40mg/kgまたは60mg/kg投与した動物の死亡率は0%でした。ただし、80 mg / kgの用量では、死亡率は80%に達し、通常は強直性発作後の呼吸停止が原因です。これらの結果に基づき、単回注射と週1回注射では60mg/kg、毎日注射では40mg/kgの用量を選択しました。

次に、C57Bl/6マウス(N = 15、60 mg / kg、s.c.)に単回PTZ注射を投与し、注射後1時間の行動.......

ディスカッション

この研究では、運動表現に基づく行動の分類を採用して、発作のダイナミクスを分析するためのより包括的なフレームワークを提供しました。このアプローチにより、痙攣、ミオクローヌス、大脳辺縁系発作の潜伏期間、持続時間、頻度などの主要なパラメータを定量化することができます。毎週のPTZ注射の結果は、反復曝露が大脳辺縁発作のタイミングと頻度を大きく変化させ、最初の痙攣および大脳辺縁発作の潜伏期間が著しく減少し、大脳辺縁発作の持続時間が増加することを示しました。さらに、PTZ用量を低くした毎日の注射では、痙攣の時間的変化が明らかになり、頻度の増加とイベント間の間隔と潜伏時間の減少が特徴でした。

てんかんの開始、進行、終了、および分類の理解は進んでいますが、臨床および実験的てんかんの研究は、発作前および発作後の段階を無視して、主に発作期に焦点を当てることがよくあります。新たな証拠は、発作間欠イベントが発作ネットワークダイナミクスに深く影響を与える可能性があることを示唆しています^20,21

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.9%塩化ナトリウム溶液	フレゼニウス・カビ・ブラジル株式会社	74MK3168	静脈内使用のためのクローズドシステム;注射液、250 mL。
分析スケール	島津製作所	224年頃	最大容量:220 g、最小容量:10 mg、可読性:0.1 mg。シリアル番号:1311070096
カメラ	ヨルタン	ジョータン-8816AHD	IR CCDカメラ、NTSCシステム、2.0 MP解像度、3.6 mmレンズ、DC 12 V電源。
デジタルルクスメーター	ミニパ	MLM-1011	光の強度をルクス単位で測定します。
皮下注射針	デスカーパック	353101	サイズ:26.5g。
マウス	-	-	雄のC57BL/6野生型マウス。生後2〜3ヶ月。
ペンチレンテトラゾール	シグマ・アルドリッチ(メルク)	P6500-25G	粉末、中枢神経系刺激剤。購入済み:25g。保管:-25°C。
ソフトウェア:MouseLabTracker	ジュリアーノ・ビレラ	-	オープンソースソフトウェア、参考論文: DOI: 10.1016/j.jneumeth.2006.04.005. サイト: https://neuro.ufrn.br/softwares/mouselabtracker
ソフトウェア: Solomon Coder	アンドás Péテル	-	オープンソースソフトウェア、v.19.08.02. サイト: https://solomon.andraspeter.com/
温湿度計	ひかり	HK-T240	温度と湿度を測定します。