ペンチレンテトラゾール誘発性発作の行動特性評価:ラシーンスケールを超えて

サマリー

このプロトコルは、マウスのペンチレンテトラゾール誘発性発作に関連する行動を分析および視覚化するための革新的な方法を導入しています。このアプローチは、従来のRacineのスコアを超えて、発作行動の多様性と時間的ダイナミクスのより包括的な評価を提供します。

要約

てんかんの動物モデルでは、発作の詳細な行動特性評価が不可欠です。発作を誘発するためのさまざまなプロトコルが存在しますが、ラシーンスケールは依然としてその定量化に最も広く採用されている方法です。当初は、大脳辺縁系構造の電気的燃焼中の行動の漸進的な動員をスコアリングするために開発されましたが、その後、さまざまな病因を持つモデル間で発作を分類するための標準になりました。

しかし、一般的に使用される発作モデルであるペンチレンテトラゾール(PTZ)投与後の行動を注意深く検討すると、ラシーンスケールでは、このGABA作動性拮抗薬によって誘発される行動変化の全範囲を捉えることはできないことが明らかになりました。単回皮下高用量PTZ注射後、マウスは最初に筋緊張低下、歩行減少、行動停止、振戦などの非けいれん行動を示します。これらは、けいれん、ミオクローヌス痙攣、大脳辺縁系発作などの発作性行動によって引き継がれますが、ラシーンスケールで定量化されるのは後者のみです。

これらの制限を克服するために、ビデオタグ付けと動物の追跡を組み合わせて、痙攣とミオクローヌスを大脳辺縁系発作とは異なる行動表現として区別する洗練されたアプローチが採用されています。これらの初期の行動は、大脳辺縁系構造の動員を促進し、最終的には大脳辺縁系発作を引き起こす可能性があります。この方法は簡単に実施でき、PTZ誘発性急性発作のより包括的な評価が可能になります。その有用性は、PTZの低用量を繰り返すと、けいれん、ミオクローヌス、および大脳辺縁系発作の重症度の時間的変化をもたらすPTZキンドリングプロトコルでさらに明らかです。このアプローチは、てんかんおよびてんかん研究における再現性を向上させる可能性を秘めています。

概要

てんかんの行動特性評価は、てんかんの病態生理学および発作活動の研究で最も採用されている読み出しであり、新しい抗てんかん薬のスクリーニングに広く使用されています^1,2。過去50年間に発表された研究のほとんどは、ロナルド・J・ラシーンが開発したプログレッシブスコアシステムを使用して、扁桃体と海馬の焚き付け中の行動発作の重症度を記述しています³。ラシーンスケールは、ラット³およびネコ⁴における行動と電気生理学的発作活動との間に強い相関関係を示した。この研究では、発作の行動表現を「(i)口と顔の動き、(ii)頭のうなずき、(iii)前肢のクローヌス、(iv)後ずさり、(v)後ずさりと転倒」の5つの進行性段階に分類^{しています3。}そのシンプルさ、使いやすさ、解釈のしやすさ、採点の速さ、再現性により、てんかんや発作の研究におけるRacineスケールの使用は、現在でも拡大を続けています(図1)。

図1:Racineの1972年の研究が年間引用した数。 過去50年間で引用数が着実に増加していることに注目してください。2024 年 11 月 27 日に Web of Science で検索したところ、6,040 件の引用が見つかり、91 件のレコードに「出版年」フィールドの情報が含まれていなかったことがわかりました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

その後、このスケールは、てんかんと発作を誘発する薬を使用する動物を含む、てんかんと発作の他の動物モデルに適用されました。カイニン酸誘発性発作⁵ およびてんかん重積状態(SE)⁶、ならびに局所⁷ および全身性ピロカルピン誘発性^SE8の初期の記述では、ラシーンスケールを使用して誘発発作と自然発作の両方を定量化した。興味深いことに、これらの薬物は、電気刺激を受けた動物で観察され、ラシーンによって説明されているように、大脳辺縁系の発作を誘発しただけでなく、説明が不十分または頻度が低いさまざまな一連の行動も誘発しました⁹。

発作行動の多様性を把握するためのラシーンスケールの限界は、発作の焦点が大脳辺縁系以外の脳領域にある発作モデルを使用する研究者によって早期に特定されています。例えば、Garcia-Cairascoは、聴覚発作¹⁰における行動を評価するために動物行動学ツールを最初に使用した研究者の1人であり、発作性発作^10,11の複雑さと時間的進行を明らかにした。最近、Ivan Solteszは、高度なビデオ深度分析と詳細な時間的符号化を使用して、電気的に燃え上がったラットの「隠れた行動指紋」を明らかにしました¹²。これらのアプローチに基づいて、ここでは、マウスのペンチレンテトラゾール誘発性急性発作に対する新しいコーディングシステムを紹介します。

ペンチレンテトラゾール(PTZ)は、GABA作動性神経伝達を阻害することにより発作を引き起こし¹³、ニューロンの興奮性の増加とニューロン集団の同期活性化をもたらします^14,15。全身性PTZの単回高用量(40-80 mg / kg)の後、げっ歯類は可動性の低下、非特異的なひげの動き、全身のけいれんとミオクローヌスけいれん、口腔顔面と足のクローヌス、および本格的な大脳辺縁発作を示します¹⁶。てんかん重積状態モデルとは異なり、PTZ後の異常な行動は最大1時間続き、自然に寛解します16,17,18。以前の著者は、ラット¹⁷とマウス¹⁸のラシーンスケールの改訂版を提案しています。発作行動の多様性に新たな洞察を与えようとする試みにもかかわらず、彼らの新しいスケールには、野生走行やジャンプに関連する1つまたは2つの新しいレベル(レベル6、van Erum et ^al.18)と呼吸停止につながる強直性伸展(レベル7、van Erum et ^al.18)が組み込まれています。

このプロトコルは、PTZ 誘発性発作行動を定量化および表現するための新しいアプローチを提示し、特にけいれんとミオクローヌスに焦点を当てています。これらの行動は、全身性PTZ投与後に最も多く見られますが、発作やてんかんの研究では見過ごされがちです。したがって、このアプローチは、けいれんとミオクローヌスを特定し、それらを行動的に大脳辺縁系発作と区別するための特定の基準を提供することにより、重大な方法論のギャップに対処します。これは、けいれんとミオクローヌスが、PTZの単回投与と反復投与の両方で明確な時間的ダイナミクスを示すことを示しています。このコーディングシステムは実装が容易で、異常な活動の新しいパラメータを既存の方法論に統合し、発作発生メカニズムに関する新たな洞察を提供します。最後に、この新しい戦略は、ラボ間で発作行動の定量化を標準化し、再現性を高め、発作メカニズムの視野を広げる可能性を秘めています。

プロトコル

すべての実験手順は、リオグランデ・ド・ノルテ連邦大学の地元の倫理委員会によって承認されました(プロトコル番号043/2022、ライセンス番号307.043/2022)。このプロトコルでは、生後3ヶ月から4ヶ月までの雄C57BL/6マウスを使用し、確立されたPTZ誘導プロトコル¹⁶に従って6〜10匹の推奨サンプルサイズを使用しました。

1. 観測アリーナの準備

1. 表面積が10 x 10 cm以上、壁の高さが30 cm以上の正方形または円形のアリーナを使用してください。アリーナが十分に照らされていることを確認してください。必要に応じて、赤外線照明を使用して飽和画像取得を保証します(図2A)。
2. アリーナの上に少なくとも1台のビデオカメラを置き、アリーナの床全体と壁の少なくとも10 cmを上から見下ろします(マウスの頭を切り取らずに飼育行動をキャプチャするため、 図2B)。
3. 必要に応じて、アリーナの正面から見える2台目のビデオカメラを配置します。この場合、アリーナの壁の1つが透明であることを確認してください。
4. 温度(21-24°C)と湿度(50-70%)が動物施設の条件と一致していることを確認し、温湿度計で監視し、必要に応じて調整します。
5. アリーナの底を覆うために必要な寝具を配置し、動物が背景から見えるようにします。実験の全期間中、水と食品ペレットを自由に利用できるようにします。
6. できれば光期の開始時(例えば、午前7時から10時の間)に実験を開始してください。実験室(900-1,100ルクス)で一貫した照明を維持し、12/12時間の明暗サイクルで、午前6時に照明を点灯します。ルクスメーターを使用して、録画アリーナに近い照明条件を確認し、均一なビデオ録画品質を確保します。
7. カメラをビデオ録画デバイスに接続して、少なくとも24フレーム/秒(fps)のビデオを取得します。

2. PTZ溶液の調製

注:発作性行動(すなわち、けいれん)は、40 mg / kgから始まる用量で誘発できます。.大脳辺縁系発作は、60 mg / kg以上の用量で観察されます。.呼吸停止および死亡に関連する強直性発作は、通常、80 mg / kg以上の用量で観察されます。.キンドリングプロトコルには、40 mg / kgの投与量が使用されました。

用量はマウス株によって異なる場合があります。.研究課題に最も適したPTZ線量を定義するために、パイロット実験を実施することをお勧めします。

1. マウスに全身注射により10 mL/kgを投与します。したがって、PTZ粉末を脱イオン水に溶解して、最終濃度の4または6 mg / mL(それぞれ40 mg / kgおよび60 mg / kgの用量)に到達します。
   注:ばらつきを減らすには、実験バッチ全体に対して単一のPTZ溶液を調製します。

3. PTZの運営

1. 動物をアリーナに置く前に、体重計を使用して体重を測定してください。
2. 各動物に必要なPTZ溶液の量を、その体重に基づいて計算します。
   注:60 mg / kgの用量と30 gの体重の場合、動物に0.3 mLの6 mg / mL PTZ溶液を注射します。.
3. PTZ注入の少なくとも1時間前に挙動を記録します。
   注:この慣れ期間は、新規性による歩行と不安を減少させますが、ベースライン活動を抽出するためにも使用できます。
4. PTZを腹腔内(i.p.)または皮下(s.c.)に投与します^15,16。皮下投与の場合は、片手で動物を固定し、肩甲骨の間の皮膚をそっとつまみます(図2C)。
5. 26 1/2Gの針に取り付けられた1mLの注射器を使用して、針を体の向きと平行に皮下腔内に挿入し、溶液を皮下腔にゆっくりと注入します。注入が完了したら、針をそっと取り外し、皮膚を針の出口に保持して、空洞の圧力によって溶液がこぼれ出ないようにします(図2C)。
   注:溶液が急速に蓄積すると、注射部位からこぼれたり、針を抜くときに漏れたりする可能性があるため、注射は急ぎすぎないでください。
6. 漏れは発作性の行動の発現に影響を与えるため、メモしておいてください。同じPTZ溶液を50μL追加ですぐに注入する可能性を考慮してください。
7. 動物をアリーナに戻し、1時間の連続ビデオ録画を行います。
8. PTZインジェクションの1時間後(またはそれ以上)に、録画を停止し、後処理(ビデオトラッキングとビヘイビアコーディング)のためにファイルをコピーします。

図2:実験のセットアップと注入手順(A)中央に配置された4つの透明な正方形のアリーナとトップダウンビューカメラを使用して、PTZ投与前後の行動を記録し、動物の位置を追跡しました。(B)Aに記載の設定で取得した代表的な動画1本のスナップショット。(C)PTZの皮下注射の例。針は皮下腔内の動物の肩甲骨の間に置かれます。(D)本研究で用いた行動データの取得と分析の概略図。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

4. 動物福祉

1. 発作が5分以上続く場合は、特に繰り返し注射のプロトコル中に、細胞死や脳組織の損傷を防ぐために、動物を取り出して安楽死させます。
2. 実験期間中、毎日動物の体重を監視します。
3. 食物摂取、移動、姿勢、グルーミング、痛みや苦痛の兆候など、動物の一般的な状態を監視します。
4. 必要に応じて抗炎症治療(イブプロフェン、5 mg / kg)を投与し、痛みを管理します。.必要に応じて、補助的な食事や水を用意してください。
5. 動物が個々のサプリメントから2日以内に回復できない20%を超える体重減少、表皮病変、または薬理学的治療に反応しない慢性的な痛みや不快感の兆候を示している場合は、動物を除外します。.
6. すべての動物を国際的および制度的な倫理ガイドラインに従って安楽死させます。

5. ソフトウェアのインストール、設定、使用

1. この研究で説明する解析には、MouseLabTrack¹⁹ と Solomon Coder を使用します。それらをダウンロードして、インストール手順に従います ( 補足ファイル 1 と 補足ファイル 2 を参照)。
   注: MouseLabTrack は MATLAB フレームワークで実行されますが、Solomon Coder は Windows オペレーティング システム用の実行可能ファイルです。どちらのソフトウェアもオープンソースです。
2. WindowsのスタートメニューでSolomonをクリックするか、Solomon Coderを検索してソフトウェアを開きます。
   1. 設定ファイルが使用可能な場合( 補足ファイル3を参照)は、[ ファイル] |構成をロードします。画面には、事前定義された設定が読み込まれます。
   2. 設定ファイルが利用できない場合は、
      1. 空き領域を右クリックして、新しいボタンを作成します。新しく作成したボタンを右クリックして、 設定 画面を開きます。
      2. [ボタン名] フィールドで、目的の動作を表すようにボタンの名前を変更します。
      3. [ボタン面の色] フィールドで、色を選択します。
      4. [カテゴリ] フィールドで、名前を [デフォルト] を [ビヘイビア] に変更します (これが列名になります)。
      5. ホットキーフィールドで、ビデオ分析中の動作をマークするキーボードキーを割り当てます(例:キー「1」)。
      6. (オプション)イベントが瞬間的な場合は、ホットキーの上のチェックボックスをオンにします。つまり、キーが押されて離されたときに1つのイベントが登録されます。チェックを外すと、キーが離されるまで動作は記録されたままになります。
   3. ビデオを開くには、[ ファイル] |[ビデオ] を開きます。
   4. 再生を押してビデオを開始します。
   5. 動作が観察されたら、マウスの左ボタンをクリックするか、割り当てられたキーボードキーを押してマークします。
   6. データをカンマ区切り値 (.csv) ファイルとして保存するには、[ 分析] |出力に名前を付けて保存します。Solomon コーディング シート (.arch) を保存するには、[ ファイル] |コーディングシートを保存します。
3. MouseLabTrackerを開いてロードします。
   1. MATLABを開き、コンソールで「main()」と入力して Enterキーを押します。
   2. ビデオをロードするには、開くボタンをクリックします。読み込み後、隣接する画面には、背景が緑色のビデオと動物が白で表示されます。
   3. ビデオで分析する時間間隔を指定します。 [開始 ]をクリックして、解析の開始を設定します。 [終了 ]をクリックして、解析の終了点を設定します。
      注意: 間隔が設定されていない場合、ソフトウェアはビデオ全体を分析します。
   4. トラッキング設定を構成するには、[ トラッキング設定 ] タブに移動します。
      1. 「暗いオブジェクト」/「明るい背景」を選択して、動物が背景よりも暗いことを示します。
      2. 動物の数を調整するには、[ 被験者 ] に移動して、数を 1 に変更します。
      3. 検出パラメータを調整するには、半径値が 30 から 40 の間になるように [しきい値] パラメータ設定を変更します。
      4. 動物の色を定義するには、[ 色 ]をクリックして適切な色を選択します。
      5. アリーナを定義するには、「 Define Arena」をクリックし、アリーナの左上隅を選択してから、アリーナの右下隅を選択します。
   5. 追跡プロセスを開始するには、[ 追跡]をクリックします。プログレスバーが100%に達するまで待ちます。
   6. 追跡が完了したら、[ Save results]をクリックして解析の出力ファイルを保存します。

6. コーディング動作

1. まず、マウスが観測アリーナに配置された後、ビデオフレームに再表示されるPTZ管理時間にタグを付けます。この瞬間は 時間ゼロとして機能し、レイテンシ計算を含む他のすべての動作の時間的基準として機能します。
2. PTZ注射の数分後に痙攣とミオクローヌスを観察し(図3)、その後、大脳辺縁系発作の可能性を観察します。痙攣は、軸筋の短時間、一過性、速い収縮であり、両側の耳の屈曲、背筋の収縮、尾の上げ方(ストラウブの尾)、そしてまれに驚愕のジャンプ反応が含まれます(図3A)。痙攣を個別のイベントとしてコード化し、それらを持続時間のない 1 つのビデオ フレームに関連付けます。
   注:けいれんの発現におけるさまざまな身体部分の多様性と組み合わせを定量化します(代表的な結果のセクションを参照)。
3. ミオクローヌスをコードするには、200ミリ秒を超えるイベントを観察します。それらは、頭、首、および前足を含む突然の強いミオクローヌスのけいれんによって特徴付けられます。震えや体の姿勢の喪失に関連している可能性があります(図3B)。下位分類には、振戦を伴う、または前方、左向き、または右向きの姿勢の喪失を伴うミオクローヌスが含まれます。通常、持続時間の範囲は 1 秒から 2 秒です。その長さのために、ミオクローヌスは単一のイベントに対して複数の時間単位にわたるコーディングを必要とします。
4. 大脳辺縁系発作をコード化するには、Racineが記述したものに類似し、Racineスケールを使用してコード化できるイベントを観察します。通常、行動停止または凝視呪文から始まり、その後、嗅覚および味覚の自動化、口腔顔面運動、前肢および/または頭部のミオクローヌス、転倒の有無にかかわらずの飼育、野生のランニングまたはジャンプ、呼吸停止を伴う強直性発作が続きます。修正されたラシーンスケール¹⁸ を使用して、10〜15秒以上続き、けいれんやミオクローヌスと区別できる大脳辺縁発作をサブ分類します。
5. 実験プロトコルに基づく追加の行動クラスを含めることで、行動のより包括的なスクリーニングが可能になります。
6. 録画セッションの終了を 1 つの時間枠 (PTZ インジェクションの 1 時間後) でマークします。動物が強直性発作後に死亡した場合は、死亡時刻を終了マークで識別します。
   注意: コーディングシートは、コーディングプロセスのどの時点でも保存でき、必要に応じてソフトウェア内で再度開き、継続的なコーディングや変更を行うことができます。

図3:PTZ投与後に観察された発作行動のスナップショット。 (A)PTZ注射後に最初に観察された痙攣の代表的な例です。すべてのフレームが表示されます(サンプリング30 fps)。けいれんは200ミリ秒未満続き、吻尾方向に動くことに注意してください。この例では、明白なテールリフティングは発生していません。(B)前傾に関連するミオクローヌスの代表的な例。この例では、ミオクローヌスが1秒以上持続し、複数の尾と前肢のクローヌスが発生しました。(C)大脳辺縁系発作の代表例。Racineステージ1の前に、マウスは体の姿勢の喪失を含む持続的な四肢ミオクローヌスを示しました。このシーケンスは、従来のラシーンスケールの伝統的な5つのステージすべてを示しています。この場合、マウスは 5 のスコアを受け取ります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

7. データ分析と可視化

1. 各行動カテゴリ(痙攣、ミオクローヌス、発作など)の最初の発生の遅延を、コーディングシートに記録された時間からPTZ注入時間を差し引くことによって計算します。
2. 各ミオクローヌスと発作の期間を計算し、それらを合計して各カテゴリの合計期間を取得します。
3. イベントの合計数を記録時間で割ることにより、各動作の発生率を計算します。
4. 連続するイベント間の時間差を見つけることにより、各動作のイベント間間隔を計算します。
5. 該当する場合は、各レコーディングセッションにおける発作性行動の時間的分布に従ってエピソードを定義します。各エピソードの上記のパラメータを計算します。
   注:発作の終了は発作後抑制期間につながり、このプロトコルのエピソードの終了を示します。発作性行動の再発は、新しいエピソードの始まりを示しています。
   注:発作がない場合は、けいれんとミオクローヌスの時間分布に基づいて記録セッションを分類します。.
6. 各グループの Shapiro-Wilk 検定を使用して正規性を検定します。
7. 複数のグループ間のパラメトリック比較では、一元配置分散分析(ANOVA)検定を使用します。対応のあるデータについては、データ構造に応じて、対応のある t検定または反復測定分散分析を使用します。
8. 統計的有意性をp値0.05<に設定します。さらに、p 値を 0.0001 未満に丸め、<0.0001 として報告します。

結果

PTZ誘発性発作時の発作挙動を詳細に説明するコーディング戦略とその能力を評価するために、最初にPTZを3回投与して試験し、C57BL/6マウスへの影響を観察しました(それぞれ40、60、80 mg / kg、N = 7、5、5)。PTZの3回の投与で観察された行動転帰は、1回の注射後に明確な用量依存的な違いを明らかにしました。40 mg / kgPTZで治療された動物はけいれんを示しましたが、大脳辺縁系発作やミオクローヌスは認められませんでした。.対照的に、60 mg/kg と 80 mg/kg で治療された動物では、一貫してけいれん、ミオクローヌス、および辺縁発作が発現しました。PTZを40mg/kgまたは60mg/kg投与した動物の死亡率は0%でした。ただし、80 mg / kgの用量では、死亡率は80%に達し、通常は強直性発作後の呼吸停止が原因です。これらの結果に基づき、単回注射と週1回注射では60mg/kg、毎日注射では40mg/kgの用量を選択しました。

次に、C57Bl/6マウス(N = 15、60 mg / kg、s.c.)に単回PTZ注射を投与し、注射後1時間の行動...

ディスカッション

この研究では、運動表現に基づく行動の分類を採用して、発作のダイナミクスを分析するためのより包括的なフレームワークを提供しました。このアプローチにより、痙攣、ミオクローヌス、大脳辺縁系発作の潜伏期間、持続時間、頻度などの主要なパラメータを定量化することができます。毎週のPTZ注射の結果は、反復曝露が大脳辺縁発作のタイミングと頻度を大きく変化させ、最初の痙攣および大脳辺縁発作の潜伏期間が著しく減少し、大脳辺縁発作の持続時間が増加することを示しました。さらに、PTZ用量を低くした毎日の注射では、痙攣の時間的変化が明らかになり、頻度の増加とイベント間の間隔と潜伏時間の減少が特徴でした。

てんかんの開始、進行、終了、および分類の理解は進んでいますが、臨床および実験的てんかんの研究は、発作前および発作後の段階を無視して、主に発作期に焦点を当てることがよくあります。新たな証拠は、発作間欠イベントが発作ネットワークダイナミクスに深く影響を与える可能性があることを示唆しています^20,21

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.9%塩化ナトリウム溶液	フレゼニウス・カビ・ブラジル株式会社	74MK3168	静脈内使用のためのクローズドシステム;注射液、250 mL。
分析スケール	島津製作所	224年頃	最大容量:220 g、最小容量:10 mg、可読性:0.1 mg。シリアル番号:1311070096
カメラ	ヨルタン	ジョータン-8816AHD	IR CCDカメラ、NTSCシステム、2.0 MP解像度、3.6 mmレンズ、DC 12 V電源。
デジタルルクスメーター	ミニパ	MLM-1011	光の強度をルクス単位で測定します。
皮下注射針	デスカーパック	353101	サイズ:26.5g。
マウス	-	-	雄のC57BL/6野生型マウス。生後2〜3ヶ月。
ペンチレンテトラゾール	シグマ・アルドリッチ(メルク)	P6500-25G	粉末、中枢神経系刺激剤。購入済み:25g。保管:-25°C。
ソフトウェア:MouseLabTracker	ジュリアーノ・ビレラ	-	オープンソースソフトウェア、参考論文: DOI: 10.1016/j.jneumeth.2006.04.005. サイト: https://neuro.ufrn.br/softwares/mouselabtracker
ソフトウェア: Solomon Coder	アンドás Péテル	-	オープンソースソフトウェア、v.19.08.02. サイト: https://solomon.andraspeter.com/
温湿度計	ひかり	HK-T240	温度と湿度を測定します。