方法論記事

MPTP誘発性パーキンソン病のマウスモデルにおける鼻腔内投与オクタデカニューロペプチド類似体の神経保護効果

DOI：

10.3791/68122

⸱

2025年8月29日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Faculty of Sciences of Tunis, LR18ES03, Laboratory of Neurophysiology Cellular Physiopathology and Biomolecule Valorization, University Tunis El Manar, 2Inserm U1239 NorDiC, Laboratory of Neuroendocrine, Endocrine and Germinal Differentiation and Communication, PRIMACEN, Univ Rouen Normandie, 3Confocal Microscopy Unit, Faculty of Medicine of Tunis, University Tunis El Manar

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

鼻腔内投与により、生理活性分子を脳に直接送達することができ、脳室内法に代わる非侵襲的な代替手段となります。この研究は、ODN 類似体であるシクロ(1-8)OP の鼻腔内投与が、パーキンソン病のマウス モデルにおける線条体の MPTP 誘発性酸化損傷およびアポトーシスに対して強力な神経保護効果を発揮することを示し、治療の可能性を強調しています。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

パーキンソン病 (PD) は神経変性疾患であり、既存の治療法は主に緩和的であり、治癒効果に欠けています。オクタデカニューロペプチド (ODN) は、アストロサイトによって排他的に産生されるペプチドであり、PD の in vitro および in vivo モデルで酸化的細胞損傷およびアポトーシスからニューロンを保護します。しかし、ODN は血液脳関門 (BBB) を通過できず、脳に到達するには脳内注射が必要であり、治療応用にとって大きな課題となっています。この研究では、PD の in vivo モデルで BBB をバイパスするために鼻腔内 (IN) 経路を介して送達される ODN 類似体であるシクロ(1-8)OP の神経保護効果を調査します。雄のC57BL / 6Jマウスを実験に使用し、偽、MPTP-(20 mg / kg体重、腹腔内)、シクロ(1-8)OP-(10 ng / 10 μL、 IN)、およびMPTP + cyclo(1-8)OP処理動物。0日目(D0)に、動物は100 μL MPTP溶液を2時間間隔で3回腹腔内注射(MPTP-およびMPTP + cyclo(1-8)OP処理マウス)または生理食塩水(偽およびcyclo(1-8)OP処理マウス)を受けました。最終注射の1時間後、シクロ(1-8)OP(シクロ(1-8)OPおよびMPTP + シクロ(1-8)OP処理マウス)またはIN生理食塩水(偽およびMPTP処理マウス)のIN点滴10 μLを投与した。D7 では、運動機能を評価するためにシリンダー テストを実施しました。その後、動物を犠牲にし、線条体を除去し、RT-qPCRで分析してカスパーゼ-3遺伝子発現を評価しました。組織サンプルは、抗酸化酵素活性、活性酸素種 (ROS)、マロンジアルデヒド (MDA)、およびカルボニル化タンパク質の存在量を測定するためにも使用されました。最終 MPTP 投与の 1 時間後に投与された 10 ng シクロ(1-8)OP の単回 IN 投与により、治療後 7 日で線条体の神経毒性が防止されました。シクロ(1-8)OPを介した神経保護は、線条体におけるMPTPによって誘導されるカスパーゼ-3発現の強力な阻害と関連していました。さらに、シクロ(1-8)OPは抗酸化酵素の活性を回復させ、線条体におけるROS、脂質過酸化生成物、タンパク質カルボニル化の蓄積を防ぎました。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

パーキンソン病 (PD) は、線条体を神経支配する黒質のドーパミン作動性ニューロンの進行性の喪失を特徴とする神経変性疾患です。この喪失は、筋硬直、無動症、運動緩慢などの重度の運動障害を含む重大な神経学的症状を引き起こします1。PD などの神経変性疾患の有病率は、主に人口の高齢化により増加し続けており、公衆衛生上の重大な課題を引き起こしています2。PD の現在の治療法は、主にドーパミン作動性類似体と脳内高周波刺激に依存しています 3,4。しかし、これらの治療法は神経保護効果を欠いており、病気の進行を止めることができないため、ニューロンの喪失を防ぎ、再生を促進し、病気の進行を軽減するための革新的な戦略が緊急に必要であることが強調されています5。

オクタデカニューロペプチド(ODN)は、主に哺乳類の中枢神経系のアストログリア細胞によって発現する、86アミノ酸前駆体ジアゼパム結合阻害剤(DBI)6のタンパク質分解プロセシングに由来するペプチドです。ODNの一次構造の進化的保存は、その重要な生物学的役割を示唆しています。ODN は、食物摂取、睡眠、攻撃性、不安関連行動などの主要な機能を調節することが示されています7。その調節的役割を超えて、広範な研究により、神経変性に関連するさまざまな神経障害における ODN の神経保護特性が実証されています。たとえば、ODN は PD8 のモデルでドーパミン作動性ニューロンを保護し、げっ歯類の脳卒中後の機能回復を促進しながら梗塞サイズを縮小します9。ODN の重要な特徴の 1 つは、抗アポトーシス、抗炎症、抗酸化、および免疫調節活性を通じて、脳損傷中に活性化される多くの有害なプロセスに対抗する能力です 10,11,12。さらに、ODN は、神経新生とニューロンの可塑性を促進することにより、脳卒中の急性期を超えて作用する可能性があります9。治療薬としてのペプチドまたはその類似体の潜在的な臨床応用では、血流中の急速な分解を防ぎ、初回通過効果を最小限に抑えるために、最適な投与経路を選択することが重要です。さまざまな送達戦略の中で、鼻腔内(IN)投与は有望な非侵襲的代替手段として浮上しており、血液脳関門(BBB)をバイパスしながら特定の生理活性分子を脳に直接送達することを可能にする13,14,15。この経路により、侵襲的な定位注射が不要になり、末梢臓器と比較して脳の生体内分布が強化されます。たとえば、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド (PACAP) は、静脈内注射と比較して IN 点滴によって送達された場合、脳の取り込みと神経保護においてより大きな有効性を実証しており、梗塞量を大幅に減少させ、脳卒中モデルにおける機能回復を改善します9。

IN 投与は、BBB をバイパスして治療薬を脳に直接送達するための低侵襲で効率的な技術ですが、その有効性は、投与量や総量など、いくつかの実際的なパラメーターに依存します。げっ歯類では、誤嚥や消化管へのオーバーフローを避けるために、推奨量は通常、鼻孔あたり10〜25μLの範囲です16,17。鼻取り込みの効率は、動物のサイズ、鼻腔表面積、粘液線毛クリアランス、および親油性や分子量などの化合物特性にも影響されます18,19。これらの制約は、前臨床モデルにおける再現性と翻訳的関連性を確保するために、プロトコル設計時に考慮する必要があります。

in vivo 研究では、低用量の ODN の脳内 (ICV) 注射が、特に MPTP 処理マウスのドーパミン作動性ニューロンの変性を防ぐことにより、有意な神経保護効果をもたらすことが示されています8。現在の研究は、神経保護ペプチド類似体を脳に送達するためのICV注射の非侵襲的代替手段として、ODN類似体であるシクロ(1-8)OPのIN投与の実現可能性と有効性を評価することを目的としており、特にこの経路がドーパミン作動性ニューロンの喪失を防ぎ、PDの確立されたモデルであるMPTP治療マウスの運動転帰を改善できるかどうかを判断することを目的としています。

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プロトコル

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すべての実験は米国獣医師会のガイドラインに従い、パスツール研究所の医療倫理委員会によって承認されました (承認番号: FST/LNFP/Pro 160220)。10週間齢のC57BL / 6J雄マウスをチュニスのパスツール研究所から入手しました。マウスは、温度管理された部屋(21°C±1°C)のケージごとに3匹に収容され、12時間の明暗サイクルで収容され、1週間の順応の間、食物と水への自由なアクセスを提供しました。使用する試薬と機器の詳細は 、材料表に記載されています。

1.治療手順

  1. 動物を偽(n = 9)、MPTP-(n = 9)、シクロ(1-8)OP-(n = 9)、およびMPTP +シクロ(1-8)OP処理(n = 9)の4つのグループに分けます。
  2. 治療初日(D0)に、100 μLの0.9%NaClにMPTP(20 mg / kg b.w.)を2時間間隔で3回腹腔内(IP)注射します。最後のMPTP注射の1時間後、10 μLのシクロ(1-8)OP(10 ng)または生理食塩水を鼻腔内(IN)に投与します。
  3. 対照動物にMPTPの代わりに生理食塩水を、シクロ(1-8)OPの有無にかかわらず注射します(図1)。
  4. 7日目(D7)に、マウスにシリンダーテストを実施する。次に、ペントバルビタールのIP注射を使用してマウスを深く麻酔し、それらを犠牲にして(施設で承認されたプロトコルに従って)、リアルタイムPCRおよび生化学分析のために脳を収集します20 (図2)。

2. 注射手順

  1. 腹腔内注射
    1. マウスを慎重に配置し、手順中に頭を固定します。
    2. マウスの頭を下に向けて、臓器が重力によって自然に移動できるようにし、針との接触を最小限に抑えます。
    3. 針を下腹部に45度の角度で挿入します。
    4. 同じ側に100 μLの注射を3回、各注射の間に2時間の間隔をあけて、すべて同じ日に実施します。
    5. 偽およびシクロ(1-8)OPグループには0.9%生理食塩水を注入するか、MPTPおよびMPTP +シクロ(1-8)OPグループにはMPTP溶液(20 mg / kg b.w.)を注入します。
  2. 鼻腔内投与
    注: 選択された用量 (10 ng) は、ODN8 の ICV 投与の神経保護効果を実証する以前の研究に基づいていました。10 μL の総容量と液滴サイズ (鼻孔あたり 5 μL) は、確立された IN 投与プロトコル18,21 に従って選択されました。この体積は、マウス鼻腔の平均容量(0.032 cm3)をはるかに下回っているため、鼻孔閉塞または窒息のリスクを最小限に抑え、安全で効率的な鼻吸収を確保します22。
    1. マウスの首筋をしっかりと持ち、頭の動きを最小限に抑えながら正確な投与を容易にするために、鼻が上を向くようにします。
    2. 腹側が天井を向くように動物を反転させ、首を床と平行にします。マウスの頭がしっかりと固定され、垂直または水平の動きを防ぎます。
    3. ピペットチップをマウスの鼻孔に合わせ、プランジャーをゆっくりと押し下げて小さな液滴を形成します。
    4. 5 μL(体積の半分)の液滴をマウスの各鼻孔の近くに置きます。
    5. マウスが溶液を自然に吸い込むようにします。
    6. MPTP + シクロ(1-8)OPおよびシクロ(1-8)OP群に10 μLのシクロ(1-8)OP(10 ng)を投与し、これらの手順を繰り返して一貫した投与を確保します。
    7. 手順全体を通してマウスの口を注意深く観察してください。口の中の液体の存在は、鼻の吸収が不完全であることを示している可能性があります。これは、液滴のサイズが不適切であること、急速な投与、または不十分な吸入が原因で、溶液が鼻咽頭に溜まり、その後口から排出される可能性があります。
    8. 必要に応じて液滴サイズを小さくし、追加の量を投与する前に吸入に十分な時間を確保することで、このリスクを最小限に抑えます。
    9. 過剰な量を防ぐために、すぐに追加用量を投与することは避けてください。
    10. 置き忘れた用量を記録し、排出された液体を注意深く記録します。
    11. さらに投与を進める前に、各マウスが両方の液滴(鼻孔ごとに1つ)を完全に吸い込んでいることを確認してください。
    12. メチレンブルー溶液のIN注入を行うことで、嗅球の正確なターゲティングを確認します。
    13. 青色の堆積と広がりを目視検査して精度を評価します。

3. シリンダーテスト

  1. 高さ20cm、直径15cmの透明な円柱をテーブルの中央に置きます。
  2. 環境照明の影響を最小限に抑えるために、シリンダーの周囲(4〜8 cm離れた場所)に3枚の黒い段ボールパネルを配置します。ビデオ録画のためにシリンダーの片側を開いたままにしておきます。
  3. カメラを円柱から40〜60cm離して、その全体像をキャプチャします。
  4. マウスをシリンダーに入れ、すぐに5分間記録を開始します。
  5. 各マウスがテストを完了したら、シリンダーを水で洗浄し、70% エタノールをスプレーして臭いを取り除き、拭いて乾かしてから次のマウスをテストします。
  6. 記録を半速で再生し、詳細な観察を可能にします。
  7. マウスがシリンダー壁に足を持ち上げて探索行動を評価する各インスタンスをカウントします23。

4. 生化学実験用脳組織抽出物の調製

  1. ペントバルビタール(40 mg / kg、IP)で動物を麻酔し、首を切ります(施設で承認されたプロトコルに従って)。
  2. 線条体を解剖し、溶解バッファー(1%Triton X-100、50 mM Tris-HCl、10 mM EDTA)を使用して、組織1グラムあたり2 mLのTBSで均質化します。
  3. ホモジネートを14,000 × g で4°Cで15分間遠心分離します。
  4. ビウレット比色測定キットを使用してタンパク質濃度を測定し、後で分析するためにアリコートを-20°Cで保存します。

5. 細胞内ROS形成の測定

  1. 脳組織抽出物を10 μMのDCFH2-DAとともに37°Cで暗所で30分間インキュベートします。
  2. 上清を取り除き、PBS(0.1 M、pH 7.4、37°C)で2回洗浄します。
  3. マイクロプレートリーダーを使用して、励起波長485 nm、発光波長538 nmで蛍光を測定します。

6. 酸化ストレスマーカーの測定

  1. マロンジアルデヒド
    1. 20 μLのサンプル(~50 μgのタンパク質)を125 μLの20%TCAおよび50 μLの0.67%TBAと混合します。
    2. 95°Cで30分間インキュベートし、4°Cで急速に冷却します。
    3. 800 μLのブタノール、ボルテックスを加え、3000 × g で4°Cで10分間遠心分離します。
    4. 532 nmでの吸光度を測定し、吸光係数(1.65 × 105 M-1 cm-1)を使用してMDAレベルを計算します。
  2. タンパク質カルボニル測定
    1. 200 μLのDNPHを50 μLのタンパク質サンプルと混合し、1時間インキュベートします。
    2. 250 μLの20%TCAを加え、氷上で10分間冷却します。
    3. 3000 × g で 4 °C で 10 分間遠心分離し、ペレットを 10% TCA で洗浄し、次に酢酸エタノール:エチル (v/v) で洗浄します。
    4. ペレットを250 μLの6 M塩酸グアニジンに再懸濁し、370 nmで吸光度を測定します。
    5. 消光係数(22,000 M-1 cm-1)を使用してPCOレベルを計算します24。

7. 抗酸化酵素活性の測定

  1. スーパーオキシドジスムターゼアッセイ
    1. サンプル(~50 μg)をウシカタラーゼ(0.4 U/L)、DL-エピネフリン(5 mg/mL)、およびNa2CO3/NaHCO3 バッファー(62.5 mM、pH 10.2)とともにインキュベートします。
    2. 分光光度計を使用して、480 nm でのエピネフリン酸化を 60 秒間隔で 300 秒間測定します25。
  2. カタラーゼアッセイ
    1. サンプルをPBS中の90 mM H2O2 と混合します。
    2. 240 nmでのH2O2 吸光度の低下を30秒間隔で3分間監視します。
    3. 消光係数(40 M-1 cm-1)を使用してCAT活性を計算します。

8. リアルタイムPCR解析

  1. 酸性チオシアネートグアニジニウム-フェノール-クロロホルム法を使用して、マウス線条体から全RNAを抽出します。
  2. RNAをDNase Iで処理してゲノムDNAを除去し、260 nmでRNA濃度を測定します。
  3. 1 μgのトータルRNAを使用して、ワンステップQ-RT PCRキットを使用して定量的RT-PCRを実行します。
  4. SYBR Green PCR Master MixとプライマーでcDNAを増幅します(表1)。
  5. GAPDHを内部対照として2−ΔΔCt 法を用いて相対的なcDNAレベルを計算する26。

9. 統計分析

  1. GraphPadソフトウェアを使用して統計分析を実行します。
  2. 単一比較にはスチューデントの t 検定を使用します。多重比較には、必要に応じて、一元配置または二元配置の分散分析に続いて、ボンフェローニの事後検定を使用します。いずれの場合も、0.05以下の P値を統計的に有意と見なします。

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結果

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MPTP投与後、マウスはストラウブテールの隆起と硬直、立毛、不動、脊椎湾曲などの姿勢異常などの特徴的なパーキンソン病症状を示し、MPTPモデルの確立に成功したことが確認されました(図3)。注射後10分でマウスを犠牲にしたメチレンブルーを使用したIN送達の検証では、 標的の嗅球と脳領域内で効果的な色素分布が示され、この方法の精度が裏付けられました(図4)。

行動評価により、MPTP で処理されたマウスは、MPTP 誘発性パーキンソニズムに特徴的な運動障害を反映して、対照と比較して前足の持ち上げが顕著に減少したことが明らかになりました。対照的に、シクロ(1-8)OP(10 ng / 10 μL)のIN投与は、前足のリフティングがほぼ制御レベルに達し、シクロ(1-8)OPがこれらの運動障害を改善する可能性があることを示唆しています(図5

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

以前の研究では、ODN の ICV 投与が、MPTP 誘発性黒質線条体ドーパミン作動性ニューロンの変性、酸化的損傷、および神経炎症に対抗することが実証されました8。現在の研究では、C57BL/6J マウスを使用した in vivo PD モデルにおいて、MPTP 誘発性運動障害、酸化損傷、および神経毒性を予防するための ODN 類似体であるシクロ(1-8)OP の IN 送達の有効性を評価しました。

その結果、MPTPで治療されたマウスは、ストラウブテールの隆起と硬直、立毛、不動、脊椎の湾曲などの姿勢異常など、特徴的なパーキンソン病症状27を示したことが示され、MPTPマウスモデルにおけるパーキンソン病の運動症状の誘発に成功したことが確認されました。IN 送達経路の有効性を検証するために、メチレン ブルー投与が使用され、標的の嗅球と脳内で効果的な色素分布が実証され、このアプローチの...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは、この記事で報告された研究に影響を与えたと思われる競合する金銭的利益や個人的な関係は知られていないことを宣言します。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、神経生理学、細胞生理病理学、生体分子評価研究所、LR18ES03、NorDiC Inserm U1239、フランス-チュニジア CMCU-Campus France/PHC Utique 24G0807/50283RD 交換プログラム (Olfa Masmoudi-Kouki と Jérôme Leprince へ)、プログラム Horizon-Marie Skłodowska-Curie Actions (MSCA) PsyCoMed 助成金契約 ID: 101086247、および Marie Skłodowska Curie 助成金契約に基づく欧州連合の Horizon 2020 研究およびイノベーション プログラム No によって支援されました101034329.

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
2'、7'-ジクロロフルオレシンDCFH2-DAシグマ・アルドリッチ064M4008V
バイオラッド分光光度計 Bio-Rad Laboratories、米国ペンシルベニア州フィラデルフィア
ブタノール
カメラ
ウシ肝臓由来のカタラーゼSIGMAライフサイエンスSLBZ7596
cyclo(1-8)スレ主INSERM U1239 NorDiC、ルーアン
シリンダーテスト(目盛り付きビーカー)
DNPH 
EDTAプラスサーモサイエンティック 11836714
エタノール 70%
エタノール-エチル酢酸溶液
GraphPadソフトウェア 米国カリフォルニア州ラホーヤ
塩酸グアニジンジーンオン5CCAE310
H2O2 ファーマグレブAEQ10101-D
インスリン注射器 2ml
L-エピネフリン MPバイオメディカルズ151065
メチレンブルー サーモサイエンティフィックケミカルズ10455081
マイクロピペット 
マイクロプレートリーダー Synergy LX-AgilentSynergy LX-アジレント
MPTPメドケムエクスプレスハイ-15608
MPTP
Na2CO3/NaHCO3バッファー 
NaCl 0.9
ワンステップQ-RT PCRキット ニューイングランドバイオラボ
ペントバルビタール シグマ・アルドリッチ
Synergy LX Nanodrop 2000 分光光度計 バイオテックアジレント
チオバルビツール酸 (TBA、0.67%) ロバ ケミー PVT。株式 会社626500025
ヒント
トリクロロ酢酸(TCA、20%)シスコ研究所SRL6740608
トライ試薬 シグマ・アルドリッチMFCD00213058
トリス-HClサーモサイエンティック J22638です。K2
トリトンX-100サーモサイエンティック A16046.AE

参考文献

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