活性アクチンベースアセンブリの収縮性および変形モードのin vitroでのチューニング:2次元活性ネットワークから液晶滴まで

Summary

ここでは、精製されたタンパク質から準2次元(2D)エンタングル、架橋、および液晶アクチンアセンブリを調製する方法を紹介します。

Abstract

アクチン細胞骨格材料は、形状制御や力産生などの細胞力学の物理的メカニズムを解明するためのモデル細胞材料として広く研究されているほか、興味深い軟質高分子材料としても研究されています。この方法では、蛍光顕微鏡研究のために精製タンパク質を使用して in vitro でアクチンベースのアセンブリを作成する方法について詳しく説明します。サンプルチャンバー内で長いアクチンフィラメントを重合し、ポリマーデプレタントを使用して、界面活性剤層で不動態化された表面に対してフィラメントを2次元(2D)に絡み合ったネットワークに集めます。アデノシン三リン酸(ATP)の存在下で骨格筋ミオシンIIフィラメントを添加すると、アクチンネットワークの収縮が誘導されます。アクチンフィラメントを架橋剤と束ねることで、アセンブリの収縮性を調整し、座屈する材料からマイクロスケールでスライドする材料に移行します。キャッピングタンパク質の存在下でアクチンを共重合させることでアクチンフィラメントの長さを短縮することで、材料を2Dネットワークから液晶に調整します。分散した短いアクチンフィラメントの架橋により、3次元(3D)の液晶液滴が形成されます。

Introduction

活性生体材料は、細胞内輸送、細胞遊走、細胞形状調節、生物学的力生成など、さまざまな生理学的プロセスにおける機械的プロセスの根底にあります^1,2,3。精製および操作されたタンパク質成分をバッファー中で自己組織化して構築した細胞骨格系のin vitro集合体は、基本的な生物物理学的および生化学的プロセスを特徴付けるための確立されたツールです4,5,6,7。これらの簡略化されたモデルシステムにより、細胞環境の複雑さなしにタンパク質を研究することができ、個々のコンポーネントの役割を特定することができます。基礎生物学的研究をサポートするだけでなく、in vitroサイト骨格集合体は、^{液晶および活性}または非平衡材料8,9,10,11,12,13,14,15を調査するための実験系としても広く開発されています。

アクチンは、細胞骨格集合体における重要な生体高分子であり、モーターおよび重合駆動の力を通じて細胞力学およびダイナミクスを調節します^3,16。蛍光顕微鏡実験では、モーター駆動の収縮やタンパク質の架橋によるアクチンの結合などのプロセスにおけるアクチンネットワークの構造変化を可視化することができます。インテーディングモータータンパク質によって再構築された3次元アクチンネットワークのイメージングにより、ネットワーク収縮とパターン形成に対するアクチン架橋剤の役割が明らかになった12,17,18,19。しかし、準2次元アクチンネットワークは、ネットワークの構造変化を捉えるのに十分な時空間分解能でイメージングの課題を克服します。さらに、高密度の準2次元アクチン構造は、細胞の密集したアクチン皮質のような細胞集合体により近い模倣である²⁰。準二次元アクチン構造を作製するための戦略には、アクチン核タンパク質のカバースリップ^21,22への結合、リンカー分子10,23,24を介したアクチンの表面への結合、カバースリップ表面^25,26でのビーズに付着した高密度アクチン束の形成、および分子クラウディング剤10によるカバースリップ表面でのアクチンフィラメントの濃縮が含まれていた^、27。

ここでは、アクチンベースの再現性のあるモデルアセンブリを作成する方法と、アクティブネットワークから準2D液晶やネマチック液滴までのバリエーションを準備するための修正方法について詳しく説明します。我々はこれまでに、架橋剤を添加した短いアクチンフィラメントの相分離液晶液滴の形成¹¹、フィラメントの架橋と結合性によるミオシンII生成アクチンネットワーク変形モードの変化(フィラメントの座屈や相対スライドなど)の変化²⁸、ミオシンIIがアクチン束に与える力の間隔やコンプライアンスの違い²⁹、 およびミオシンII輸送³⁰。架橋タンパク質とアクチンキャッピングタンパク質を使用することで、アクチンフィラメントの長さとアセンブリ構造の体系的な変化が可能になります。

Protocol

注:タンパク質と標識:このプロトコルの目的上、研究者は精製されたタンパク質のストックから始めると想定されており、蛍光顕微鏡検査研究に適した場合は蛍光標識されます。これらのタンパク質は、ラボ31,32,33,34,35,36,37で購入または精製し、蛍光標識することができる。このプロトコールでは、液体窒素で凍結し、-80°Cで保存したタンパク質のストックを使用しました。タンパク質は通常、同様の方法で標識できます。タンパク質は、精製のステップとして、または凍結ストックから標識することができます。凍結したタンパク質ストックを氷上で解凍してから、ラベリングを進めてください。以下は、骨格筋ミオシンII(ミオシン)をマレイミド官能化蛍光色素(³⁸から適応)で蛍光標識する方法である。

1. 蛍光標識ミオシンを調製します

1. まず、5〜10 mg/mLの濃度で~2 mLのミオシンから始めます。
   注:このプロトコルでは、公開された方法³⁵ を使用してニワトリ筋肉から精製された骨格筋ミオシンIIを使用した。ミオシンは、精製直後または凍結ストックから、ミオシン保存バッファー(25 mM KPO₄、0.6 M KCl、10 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、1 mMジチオスレイトール(DTT)、pH 6.6)に保存されます。運動活動の喪失を防ぐために、ミオシンを常に冷たく保つことが重要です。
2. 解凍したミオシン溶液にDTTを添加し、最終濃度を10 mMにします。1 M DTTストック溶液を使用して、容量を制限します。
   注:DTTは、ミオシンタンパク質中のシステイン上のチオール基を還元し、標識のためにマレイミドと反応する準備をします。
3. 標識反応との干渉を防ぐため、50 mM HEPES、500 mM KCl、1 mM EDTA、pH 7.6、4°Cで一晩透析してDTTを除去します。
4. 透析後、ミオシン溶液を100,000 x g 、4°Cで15分間遠心分離し、凝集体をペレット化します。上清を集めます。
5. 分光光度計を使用して、上清中のミオシンの濃度を測定します。骨格筋ミオシン³⁸の~148,000 ^{M-1 cm-1}の280 nmでの吸光係数を使用してミオシン濃度を推定します。この吸光係数は、「モノマー」が1つの重鎖、1つの必須軽鎖、および1つの調節軽鎖で構成されると仮定しています。
6. 粉末状の蛍光色素を乾燥ジメチルスルホキシド(DMSO)に再懸濁して、反応を標識する蛍光色素を調製し、5 mMの蛍光色素分子の濃度にしてください。
   注:マレイミド反応性基を持つ蛍光色素であれば、どれでも機能するはずです。Alexa 647マレイミドを使用しました。DMSOは吸湿性があり、水を蓄積します。「ドライ」DMSOとは、水が溜まらないように環境に保管されたDMSOを指します。溶媒が乾燥したDMSOであることを確認するために、このステップでは、新たに開封したDMSOのアンプルを使用しました。DMSO溶液を氷の上に置かないでください。DMSOの融点は19°Cであるため、ピペット³⁹には室温(または少し暖かい)である必要があります。
   注意:DMSOは手袋に浸透する可能性があるため、ダブルニトリル手袋を着用し、こぼれないように注意することをお勧めします。
7. 蛍光色素を添加するためのミオシンを調製するには、ミオシン溶液を氷から短時間取り出し、室温(RT)まで温めます。
   注:ミオシンを必要以上に長くRTに放置しないでください。この手順は、蛍光色素をDMSOに懸濁した後に行ってください。
8. ミオシン溶液がRTに近づいたらすぐに、フルオロフォア溶液をミオシンに加え、フルオロフォアであるミオシンのモル比が5:1になるように急速に混合します。ミオシン溶液を蛍光色素と混合したらすぐに氷の上に置きます。
9. 氷上で1時間インキュベートし、光から保護した後、DTTを1 mMの濃度に添加して反応を停止します。1 M DTTストックを使用して、追加される量を最小限に抑えます。
10. 未反応の蛍光色素を除去する。以下で説明する 2 つの方法のいずれかを使用します。
    1. オプション1:
       1. ミオシンをゆっくりと希釈してFバッファー(10 mM Imidazole、50 mM KCl、1 mM MgCl₂、2 mM EGTA、4 mM ATP、pH 7.5)に重合します。これは、ステップ1.8で添加した色素の量に応じて、約10倍の希釈です。
       2. 氷上で20分間インキュベートします。4°Cの冷蔵遠心分離機で8,000 x g で10分間遠心し、ペレット状にします。
       3. 遊離色素を含む上清を廃棄し、ミオシンをミオシン保存バッファー(ステップ1から)で再懸濁/解重合します。残った色素を除去するには、10 kDカットオフ透析カップを使用して、5 mM 2-[4-(2-スルホエチル)ピペラジン-1-イル]エタンスルホン酸(PIPES)、0.45 M KCl、pH 7.0(>100倍容量過剰)にそれぞれ15分間3回透析します。
    2. オプション 2:
       1. 脱塩カラムを使用して、カラムメーカーの標準プロトコールを使用して、5 mM PIPES、0.45 M KCl、pH 7.0 にバッファーを交換します。
11. 分光光度計でミオシンと蛍光色素の濃度を測定し、280 nmのミオシンの吸光係数とメーカーから報告された蛍光色素の吸光係数を使用して、蛍光色素分子とタンパク質の比率を推定します。2〜4の比率が一般的です。
    注:標識されたミオシンは、液体窒素中でアリコートを急速凍結する準備が整いました。アリコートは-80°Cで保存され、長期保存されます。

2.オプション:不活性ミオシンを除去する手順

注:ミオシンは、解凍したアリコートから直接実験に使用できますが、ミオシンの一部は不活性になります。次の手順では、不活性なミオシンを除去する方法について説明します。これはオプションのステップですが、再現性にとって非常に重要な場合があります。ミオシンアリコートは、解凍後約3日間使用し、4°Cまたは氷上に保存します。

1. 非標識のファロイジン安定化アクチンを重合します。
   1. 10x Fバッファー10 μL、100 mM ATP1 μL、およびddH₂Oを混合して、最終容量(ステップ2.1.2のアクチンを含む)が微量遠心チューブ内で100 μLになるようにします。
   2. アクチンモノマーを最終濃度20 μMまで添加し、ピペットで混合します。
   3. アクチンフィラメントを安定化させるには、メタノールとピペットミックスに100 μMのファロイジンをストックして、ファロイジンを最終濃度6.7 μMまで添加します。
      注意:ファロイジンは毒素⁴⁰です。こぼれや汚染を避けてください。
   4. 氷上で20分間インキュベートし、アクチンを重合させます。重合後、アクチンを4°Cで保存し、将来のスピンダウンに備えます。
2. 氷上の微量遠心チューブ内で、10 μL のファロイジン安定化アクチン、3 μL の 10x F-buffer 3 μL、0.3 μL の 100 mM ATP、6 μL の 2 M KCl、および ddH₂O を最終容量 30 μL (次のステップでのミオシンの添加に関連する容量を含む) にピペットで混合します。
3. 調製したストックから二量体標識ミオシンを所望の濃度まで添加し、ミオシンとアクチンのモル比を≤:6に保ちます。
4. 得られた溶液を冷たく(4°C)、100,000 x g で30分間遠心分離します。不活性なミオシンはアクチンフィラメントに結合し、結合したままになります。不活性なミオシンフィラメントとアクチンフィラメントは、遠心分離中にペレットを形成します。
5. 上清(活性型ミオシンを含む)を取り除き、実験で使用するために4°Cで保存します。
6. 標識後にミオシン濃度を測定するために、同じ分光光度法を使用してミオシン濃度を推定します。
   注:上清に残っているタンパク質とATPの濃度では、280 nmの吸光度ピークは260 nmのATP吸光度ピークによって不明瞭になるため、蛍光色素に関連する吸光度または相対蛍光測定による濃度の測定がより正確になります。

3.界面活性剤溶液を調製します

注:界面活性剤溶液は、事前に混合してすぐに使用できる状態で購入することもできます。

1. きれいなガラスバイアルから始めます。バイアルを水とエタノールですすいで、界面活性剤の溶媒であるオイル中の潜在的な汚染物質を取り除きます。ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)で裏打ちされたキャップ付きのホウケイ酸ガラスバイアルを使用してください。
2. ピペットチップを使用して5〜20 mgのフッ素系界面活性剤をピックアップし、ガラスバイアルの底近くに沈着させます。界面活性剤の量をサブミリグラムの精度の天びんを使用して重量で測定します。
3. 適切な量のフッ素化オイルをピペッティングして2重量%の溶液を作り、バイアルを閉じます。
   注意: オイルは揮発性ですので、測定後すぐにバイアルを閉じてください。
4. 低速で渦を巻いて混ぜます。
   注:溶液は4°Cで数週間保存できるようになりました。界面活性剤の年齢と品質は、アクチンの混雑と外観の両方に影響を与える可能性があります。斑点があるように見える、表面に付着している、または表面に密集していないアクチンは、新鮮な界面活性剤溶液が必要であることを示している可能性があります。窒素ガス下で保管すると、貯蔵寿命を延ばすことができます。

4. サンプルチャンバーの準備(3つのオプション)

注:このセクションでは、顕微鏡用のサンプル調製に使用される3つの標準サンプルチャンバーを構築する手順を説明します。次の2つのセクションでは、実際のサンプルの調製と、サンプルローディングのためのサンプルチャンバーの不動態化について説明します。

1. オプション1:フローセル
   注:シンプルなフローセルは、多くのラボで顕微鏡サンプルを作成する標準的な方法です。このプロトコルでは、エマルジョン液滴に包まれたサンプルに特に適しています。このプロトコルで説明されている界面活性剤表面コーティングでは、大きくて平らな視野を実現するのは難しい場合があるため、2Dサンプルの場合、オプション2と3の方が再現性が高いことがよくあります。チャネル形状は、ミオシンなど、後で追加された成分の混合も不均一にする可能性があります。
   1. 顕微鏡スライドの幅を横切って互いに平行に両面テープを2枚配置し、フローセルチャネルの境界を形成します。2つのテープの間に形成されるチャネルは、幅が約2mmである必要があります。
      注:チャネルが小さいと、エマルジョンがチャネルの先頭部分に詰まるのを防ぐことができます。良好なシールを作成するには、スライドガラスの幅より少し長いテープを使用し、フローセルを構築した後にトリミングします。
   2. カバースリップをテープチャネルの上に置きます。カバーガラスが顕微鏡のスライドに対して垂直になっていることを確認してください。この目的には、スライド上に置いたときに小さなオーバーハングを提供するため、30 mm x 40 mmのカバースリップを使用します。
   3. 良好なシールを作成し、テープとカバースリップの間のエアポケットをなくすには、両面テープと接触しているカバースリップの領域を押し下げます。
      注意: 端を押しながらカバースリップを壊さないように注意してください。キャップ付きのマーカーの端など、丸みを帯びた物体で領域をこすると、テープを押し下げるのに適しています。
   4. カミソリの刃を使用して、顕微鏡のスライドとカバースリップから余分なテープを切り取り、目に見えるテープのみがサンプルチャネル内に来るようにします。
      注意: テープを剥がそうとすると誤ってカバースリップが壊れやすいため、この手順を完了する場合は注意してください。
2. オプション2:未処理のカバースリップにシリンダーを取り付けます
   注:このオプションは、2D平面サンプルに適しています。顕微鏡実験中に異なるタイミングでコンポーネントを追加するのに便利です。このサンプルチャンバーは、沈殿物ではなくクリーム色になり、イメージングが困難になるエマルジョンには使用しないでください。
   1. カバースリップとガラスクローニングシリンダーを水、エタノール、水ですすいでください。風乾します。
   2. 5分間エポキシの薄層を使用して、ガラスクローニングシリンダーをカバーガラスに接着します。
      注意: エポキシが乾く間、シリンダーの上にきれいな物体を置くことにより、シリンダーに力を加えると便利です。小さなペトリ皿の蓋またはカバースリップボックスがうまく機能します。
3. オプション3:シランコーティングされたカバースリップにシリンダーを取り付けます
   注:このオプションは、チャンバーの中央に大きな平面領域が再現性を持って形成され、サンプルのバルクフローが減少します。これを達成するために、カバーガラス上の親水性領域に囲まれた疎水性領域が作製され、その結果、アクチンがチャンバーの端にある親水性領域に固定されている不動態化された閉じ込められた領域にアクチンネットワークを持つ最終サンプルが得られます。このサンプルチャンバーは、バッファー中の沈殿物ではなくクリーム状になり、イメージングが困難になるエマルジョンには使用しないでください。
   1. シランコーティングを施したカバースリップを準備して、疎水性にします。
      1. 清潔なガラスカバースリップをステンレス製のラックにセットします。必要に応じて、洗剤またはエタノールで超音波処理することによりガラスを予備洗浄します。
      2. ガラス染色皿で、トリメトキシ(オクチル)シランをイソプロパノール中の2%溶液に希釈します。
      3. カバーガラスを溶液に10分間浸します。
      4. すすぐには、溶液を水と交換します。カバースリップラックを持ち上げて、再度浸します。このプロセスをさらに4回繰り返し、その間に水の交換を行います。
      5. ラックをアルミホイルで覆ってカバースリップをほこりから保護し、25〜30°Cで乾燥させます。
   2. オクチルシラン処理されたカバースリップを、ガラスのペトリ皿または紫外線(UV)オゾンクリーナーに収まるその他の開いたガラス容器の底に置きます。
   3. 鉗子を使用して、2 mm x 2 mmのPTFE正方形(シートから切り取ったもの)をカバーガラスに置き、次のUVオゾン治療のマスクとして機能します。
   4. カバーガラスをUVオゾンで10分間処理します。このプロセスにより、PTFEマスクで覆われていない露出領域でガラスが親水性になります。
   5. カバースリップやPTFEスクエアを乱さないように、皿を慎重に取り外します。ガラスクローニングシリンダーを5分間エポキシを使用してカバーガラスに接着します。シリンダーがPTFEの正方形を囲んでいることを確認し、エポキシが乾いた後に鉗子で取り外すことができます。
      注:PTFEスクエアは、将来の実験で再利用される可能性があります。

5. アクチンネットワークの組み立て

注:以下は50 μLサンプルの調製用です。シリンダーサンプルの場合、容量が大きいほど、メニスカスの影響が軽減され、サンプルの安定性が向上します。

1. 微量遠心チューブに、最終容量を50 μLにするために必要な10x Fバッファー(ddH₂O)5 μL、25 vol%β-メルカプトエタノール1 μL、225 mg/mLグルコース1 μL、グルコースオキシダーゼ(135 mg / mL)とカタラーゼ(85,000ユニット/ mL)の混合物1 μL、25 mM ATP1 μLを加えます。 2 wt% 15センチポアズメチルセルロース10 μL。ピペットでよく混ぜます。
   注:ベータメルカプトエタノールは毒素です。こぼれや汚染を避けてください。グルコースオキシダーゼ、カタラーゼ、グルコース、およびベータメルカプトエタノールの試薬は、酸素捕捉システムを作成するためのサンプルに含まれています。メチルセルロース原液は、4°Cで攪拌して調製し、4°Cで数週間保存することができます。メチルセルロースは溶液から沈殿する可能性があるため、目に見える沈殿物がある場合、またはアクチンの混雑が悪い場合は、再調製する必要があります。
2. オプション:架橋タンパク質(アクチンモノマー1個につき0.1-1架橋剤タンパク質)を添加します。ピペットミックス。
   注:架橋タンパク質は、アクチン重合後に添加し、ミオシンを添加する前に10〜20分間結合させることもできます。これは、アクチンフィラメントを束ねるのに十分なほど高い架橋剤濃度、つまり束が界面活性剤-水界面でより均一かつ再現性よく分布している場合に適しています。シリンダーサンプルチャンバーは、アクチンが重合した後に架橋剤を追加するのに適しています。
3. 必要に応じて、ファロイジン(アクチンモノマー1〜3個につき1個のファロイジン)を添加します。ピペットミックス。
4. 別のチューブで、アクチン混合物をすべて50 μLサンプルに添加すると、総濃度が2.64 μMになるように、非標識アクチンと標識アクチンを混合します。非標識アクチンモノマー9個に対して標識アクチンモノマー1個の比率を使用します。ピペットミックス。
   注:アクチンモノマーは、サンプル溶液に添加すると重合を開始します。標識されたアクチンと標識されていないアクチンを別々に添加すると、1つのフィラメントの輪郭に沿って暗い蛍光領域が斑点状に見えるアクチンが発生する可能性があります。アクチンモノマーストックを混合して、アクチンフィラメントを均一に標識します。アクチンの精製と標識については^、31で説明しています。
5. オプション:短いアクチンフィラメントを使用して液晶またはその他の実験を行うには、ステップ5.4のアクチンミックスにキャッピングタンパク質を添加します。キャッピングタンパク質の正確な量は、タンパク質の活性画分と標的とするアクチンフィラメントの長さに依存しますが、通常、液晶実験用の短いフィラメントを作成するには、(アクチンに対して)約1〜10 mol%のキャッピングタンパク質で十分です。キャッピングタンパク質の精製については^、36で説明しています。
6. アクチンの重合を開始するには、アクチンミックスをFバッファー溶液とピペットミックスに加えます。
7. アクチンをRTで微量遠心チューブ内で重合させ、10〜30分後にサンプルセルに加えます。
8. オプション:シリンダーサンプルを調製する場合は、溶液全体をピペットチップに引き込み、シリンダーサンプルチャンバーのロードのステップ7.4でピペットを使えるようにします。

6.オプション:エマルジョンを準備します

注:これらのサンプルをエマルジョンで調製すると便利な場合があります。エマルジョンは、閉じ込められたサンプルチャンバーを提供します。エマルジョンは、Chowdhuryらと同様の試薬を用いて調製され、その結果、界面活性剤媒介性の水性エマルジョン滴⁴¹を有する油連続相が生じる。このプロトコルで使用されるメチルセルロースなどの枯渇剤の存在下では、アクチンサンプルはこのエマルジョンの水性界面に群がります。このプロトコルが基づいているサンプルでは、アクチンをエマルジョンに添加する前と後でアクチンを重合することの違いは見られません。しかし、いくつかのカプセル化実験⁴²では、重合ステップを考慮することが重要であることが報告されている。

1. 3.5 μLの油界面活性剤を微量遠心チューブに加えます。このステップには、透明、淡色、または透明な微量遠心チューブを使用してください。
2. 混合せずに、油界面活性剤層の上部に5μLのアクチン溶液を加えます。微量遠心チューブを閉じます。
3. 微量遠心チューブの上部を保持しながら、チューブの下端をフリックして、最初にエマルジョンが見える泡を作成します。バックライト時にフォームが区別できる特徴を示さなくなるまでチューブをフリックし続けます。これはマイクロエマルジョンを示しています。
   注:エマルジョンでサンプルを調製する場合は、アクチンサンプルを作成する前に、フローセルまたはその他のサンプルチャンバーを準備する必要があります。ガラスシリンダーのサンプルチャンバーは、エマルジョンがカバーガラス表面に沈殿するのではなく、空気界面にクリーム状になるため、エマルジョンには適していません。

7.サンプルチャンバー(シリンダーチャンバー)をロードします

1. 5 μLの油界面活性剤溶液をガラスシリンダーチャンバーの底にピペットで移します
   注:あるいは、サンプルは、支持された脂質二重層11,29,30で表面を不動態化することによって作製することができる。
2. カバーガラスを傾けてゆっくりと回転させ、カバーガラスの表面と下部シリンダーが界面活性剤溶液でコーティングされるようにします。
3. 余分な油界面活性剤溶液をピペットで取り除き、揮発性の油を完全に蒸発させないようにしながら、油層をできるだけ薄くします。
4. ステップ5.7のサンプル溶液を直ちにチャンバーに加えます。
5. チャンバーをPTFEテープの小片で覆い、蒸発と流れを防ぎます。

8.代替:サンプルチャンバー(フローセル)をロードします

1. フローセルのローディングに備えるために、少量の5分間エポキシを混合します。通常、面積が0.5 cm² 未満の液滴で十分です。
2. サンプルをフローセルに入れるには、まず1〜3μLの油界面活性剤溶液をフローセルのサンプルチャネルにピペットで注入し、チャネルを濡らす溶液の小さなプラグを作成します。
3. すぐに大量のサンプル溶液またはエマルジョン懸濁液をフローセルの入口にゆっくりとピペットで入れ、チャネルを満たします。通常、約2mmのチャンネルの場合、体積は約8μLです。入口は油性界面活性剤溶液を添加した面です。
   1. サンプル容量がフローセル容量を超える場合は、チャネルのもう一方の端に糸くずの出ないワイプまたはフィルターペーパーを置いて、サンプルをフローセルに通します。
   2. 油性界面活性剤溶液のメニスカスが後退してエアギャップが生じた場合は、サンプルを追加する前に、まずフローセルを傾けて入口のエアギャップを取り除きます。
4. 必要に応じて、チャネル内の空気が見えなくなるまで油性界面活性剤溶液を追加するか、サンプル(特にエマルジョンの場合)をチャネルにさらに押し込みます。
5. チャネルの両側を5分間のエポキシでシールします(フローセルをロードする直前に混合します)。

9.ミオシンを画像化して追加します

1. サンプルを顕微鏡にセットし、20倍、40倍、60倍、または100倍と油浸または水浸のいずれかを使用してアクチンのタイムラプスイメージングを開始し、高解像度イメージングに十分な開口数を提供します。サンプルチャンバー内で重合する場合は、~30分間、またはフィラメントの伸びや動きが目に見えなくなるまで重合します。
2. オプション: 架橋剤を追加します。
3. 以下のオプション1または2でミオシンを追加します。
   1. サンプルの上部にピペットで移したダイマーとしてミオシンを加えます(ミオシンダイマーが拡散するため、混合は必要ありません)。
   2. ミオシンを予備重合フィラメントとして添加します。ピペットは、混雑したアクチンを乱さないように、総量の約半分を非常にゆっくりと混合します。
      注:ミオシンに加えて、カバーガラス表面で所望のフィラメント密度またはサイズを得るための理想的な方法は、アクチンアーキテクチャによって異なる場合があり、実験的に決定する必要があります。
4. タイムラプス撮影を開始します。

Results

精製されたタンパク質を用いたモデルシステムでは、これらの方法で説明されている一般的な戦略に従うことで、アクチンをアセンブリアーキテクチャを修飾するアクセサリータンパク質の存在下でアクチンを重合してフィラメントにすることで、幅広いアクチンアセンブリを形成することができます(図1)。アクチンを架橋剤やキャッピングタンパク質なしでフィラメントに重合すると、絡み合ったフィラメントネットワークが形成されます(図1A)。絡み合ったネットワークに架橋剤を追加すると、準2Dネットワークまたはバンドルのネットワークが形成されます(図1B、C)。ネットワークが形成されるか、バンドルのネットワークが形成されるかは、アクチンネットワークに付加される架橋剤の種類と量によって異なります(例えば、ここに示すように、α-アクチニンは低濃度でネットワークを形成し、高濃度ではバンドルのネットワークを形成します)。架橋剤は、アクチンが重合している間に添加することも...

Discussion

再現性のあるアクチンアセンブリを作製するには、多くの考慮事項があります。再現性と分析性に優れたデータを生成するために最も重要なものの1つは、サンプルチャンバーのカバーガラス表面です。in vitroアクチンサンプル中のタンパク質、特にミオシンは非常に粘着性があり、未処理または処理が不十分なガラス表面に付着するため、サンプルが使用できなくなります(図5A)。私たちは、シラン化カバーガラスを油界面活性剤層で不動態化することにより、再現性のあるサンプルを得るために表面を調製する標準的な方法について説明しました。ただし、このサンプル調製には、利用可能なリソースに応じていくつかのバリエーションがあります。サンプルは、UV/オゾン処理を施さずにシラン化したカバースリップ、または油性界面活性剤層(サンプルセルオプション#2)を施したプレーンガラスカバースリップで作製することができます。これらの方法は調製が簡単ですが、サンプルの油面が不均一になる可能性があり(図5B<...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.6 mLマイクロ遠心チューブ	Fisher Scientific	05-408-123
008-フルオロ界面活性剤	RAN Biotechnologies	00115081361-6525
RAN Biotechnologies	の予混合溶液 008-フルオロ界面活性剤	008-フルオロ界面活性剤 008-フルオロ界面活性剤-2wtH-50G	プレミックス溶液
2-メルカプトエタノール (&β;-メルカプトエタノール)	シグマ アルドリッチ	63689	CAS 番号: 60-24-2 原液: MilliQ 水中 25 mM、4 °C で保存。C
4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-エタン-スルホン酸 (HEPES)	シグマ アルドリッチ	H3375	CAS 番号: 7365-45-9
5 分 エポキシ	Devcon	14250
アクチン	サイトスケルトン株式会社	AKL99-A	>99% 純粋なウサギ骨格筋 (精製の代替)
アクチン (ローダミン標識)	Cytoskeleton, Inc.	AR05-A	ウサギ骨格筋 (精製の代替)
アデノシン 5&プライム;-三リン酸 (ATP)	シグマ アルドリッチ	A6419	CAS 番号: 34369-07-8 原液: MilliQ 水中で 25 mM、-20 &g で保存;C 加水分解を避けるために冷凍保存
塩化カルシウム (CaCl2)	シグマ アルドリッチ	C5670	CAS 番号: 10043-52-4
キャッピングタンパク質 (マウス)			大腸菌 の過剰発現から精製し、HisTag ストック溶液: -80 &g のキャッピングタンパク質緩衝液中 20 mM;
ウシ肝臓由来の C カタラーゼ	シグマ アルドリッチ	C9322	CAS 番号: 9001-05-2 原液: 85 ku/mL、グルコースオキシダーゼで等分して-20°Cで保存。C
カバー ガラス	フィッシャーブランド	12544C	ホウケイ酸塩、#1.5、24 mm x 40 mm フィッシャーブランドではなく フィッシャー ファイネスト
D-(+)-グルコース	シグマ アルドリッチ	G8270	CAS 番号: 50-99-7 原液: MilliQ 水中で 225 mg/mL、-20 度で保管;C
ジチオスレイトール (DTT)	シグマ アルドリッチ	3860-OP	CAS 番号: 3483-12-3 原液: MilliQ 水中 1 M、-20 度で保管。C
両面テープ	3M	3136
エチル アルコホール 200 プルーフ	PHARMCO	111000200	CAS 番号: 64-17-5 200 プルーフ
エチレングリコール-ビス (2-アミノエチルエーテル)-N,N,N&プライム;,N′-テトラ酢酸 (EGTA)	シグマ アルドリッチ	E3889	CAS 番号: 67-42-5
エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)	シグマ アルドリッチ	E9884	CAS番号:60-00-4
グルコースオキシダーゼ	シグマアルドリッチ	345386	CAS番号:9001-37-0 原液:MilliQ水で135 mg / mL、カタラーゼで-20°Cで分注して保存します。C
グリセロール	シグマ アルドリッチ	356352M	CAS 番号: 56-81-5
イミダゾール	フィッシャー バイオ試薬	BP305-50	CAS 番号: 288-32-4
塩化マグネシウム (MgCl2)	フィッシャー生物試薬	BP214	CAS番号:7786-30-3、7791-18-6
チルセルロース	シグマアルドリッチ	M0512	CAS番号:9004-67-5 15センチポアズ
顕微鏡スライドプレーン	/ゴールドシール	63710-05	3 "x1"、厚さ 1 mm
MilliQ 水	Millipore	CUFBI001	超純水
Novec-7500 人工流体	3M	7100134816	予混合溶液の代替
塩化カリウム (KCl)	シグマ アルドリッチ	P3911	CAS 番号: 7447-40-7
リン酸カリウム (KPO4)	シグマ アルドリッチ	P3786	CAS 番号:7758-11-4
ウサギの骨格筋アセトン粉末	Pel-Freez Biologicals	41995-1	アクチンを精製するときに使用(購入の代替) -80 &gでアクチン緩衝液Gに約30 mMを保管します。C
アジ化ナトリウム	シグマ アルドリッチ	71289	CAS 番号: 26626-22-8
テトラメチルローダミン-C6-マレイミド	AnaSpec	AS-81445	CAS 番号: 174568-68-4 アクチンを精製するときに使用 (購入の代替) アクチンバッファー G に約 30 mM を -80 度で保存します。アクチンを標識するときに使用します (購入の代替)
トリス塩酸 (Tris HCl)	シグマ アルドリッチ	648317	CAS番号:1185-53-1
バス	マソンブランソン	CPX2800H