Method Article

活性アクチンベースアセンブリの収縮性および変形モードのin vitroでのチューニング:2次元活性ネットワークから液晶滴まで

DOI:

10.3791/68127

⸱

July 11th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Biophysical Dynamics, University of Chicago, 2Department of Materials Science & Engineering, Clemson University

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Erratum

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Formal Correction: Erratum: Tuning the Contractility and Deformation Modes of Active Actin-Based Assemblies In Vitro: From Two-Dimensional Active Networks to Liquid Crystal Drops
Posted by JoVE Editors on 8/28/2025. Citeable Link.

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Summary

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ここでは、精製されたタンパク質から準2次元(2D)エンタングル、架橋、および液晶アクチンアセンブリを調製する方法を紹介します。

Abstract

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アクチン細胞骨格材料は、形状制御や力産生などの細胞力学の物理的メカニズムを解明するためのモデル細胞材料として広く研究されているほか、興味深い軟質高分子材料としても研究されています。この方法では、蛍光顕微鏡研究のために精製タンパク質を使用して in vitro でアクチンベースのアセンブリを作成する方法について詳しく説明します。サンプルチャンバー内で長いアクチンフィラメントを重合し、ポリマーデプレタントを使用して、界面活性剤層で不動態化された表面に対してフィラメントを2次元(2D)に絡み合ったネットワークに集めます。アデノシン三リン酸(ATP)の存在下で骨格筋ミオシンIIフィラメントを添加すると、アクチンネットワークの収縮が誘導されます。アクチンフィラメントを架橋剤と束ねることで、アセンブリの収縮性を調整し、座屈する材料からマイクロスケールでスライドする材料に移行します。キャッピングタンパク質の存在下でアクチンを共重合させることでアクチンフィラメントの長さを短縮することで、材料を2Dネットワークから液晶に調整します。分散した短いアクチンフィラメントの架橋により、3次元(3D)の液晶液滴が形成されます。

Introduction

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活性生体材料は、細胞内輸送、細胞遊走、細胞形状調節、生物学的力生成など、さまざまな生理学的プロセスにおける機械的プロセスの根底にあります1,2,3。精製および操作されたタンパク質成分をバッファー中で自己組織化して構築した細胞骨格系のin vitro集合体は、基本的な生物物理学的および生化学的プロセスを特徴付けるための確立されたツールです4,5,6,7。これらの簡略化されたモデルシステムにより、細胞環境の複雑さなしにタンパク質を研究することができ、個々のコンポーネントの役割を特定することができます。基礎生物学的研究をサポートするだけでなく、in vitroサイト骨格集合体は、液晶および活性または非平衡材料8,9,10,11,12,13,14,15を調査するための実験系としても広く開発されています。

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Protocol

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注:タンパク質と標識:このプロトコルの目的上、研究者は精製されたタンパク質のストックから始めると想定されており、蛍光顕微鏡検査研究に適した場合は蛍光標識されます。これらのタンパク質は、ラボ31,32,33,34,35,36,37で購入または精製し、蛍光標識することができる。このプロトコールでは、液体窒素で凍結し、-80°Cで保存したタンパク質のストックを使用しました。タンパク質は通常、同様の方法で標識できます。タンパク質は、精製のステップとして、または凍結ストックから標識することができます。凍結したタンパク質ストックを氷上で解凍してから、ラベリングを進めてください。以下は、骨格筋ミオシンII(ミオシン)をマレイミド官能化蛍光色素(38から適応)で蛍光標識する方法である。

1. 蛍光標識ミオシ....

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Results

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精製されたタンパク質を用いたモデルシステムでは、これらの方法で説明されている一般的な戦略に従うことで、アクチンをアセンブリアーキテクチャを修飾するアクセサリータンパク質の存在下でアクチンを重合してフィラメントにすることで、幅広いアクチンアセンブリを形成することができます(図1)。アクチンを架橋剤やキャッピングタンパク質なしでフィラメントに重合すると、絡み合ったフィラメントネットワークが形成されます(図1A)。絡み合ったネットワークに架橋剤を追加すると、準2Dネットワークまたはバンドルのネットワークが形成されます(図1B、C)。ネットワークが形成されるか、バンドルのネットワークが形成されるかは、アクチンネットワークに付加される架橋剤の種類と量によって異なります(例えば、ここに示すように、α-アクチニンは低濃度でネットワークを形成し、高濃度ではバンドルのネットワークを形成します)。架橋剤は、アクチンが重合している間に添加することも.......

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Discussion

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再現性のあるアクチンアセンブリを作製するには、多くの考慮事項があります。再現性と分析性に優れたデータを生成するために最も重要なものの1つは、サンプルチャンバーのカバーガラス表面です。in vitroアクチンサンプル中のタンパク質、特にミオシンは非常に粘着性があり、未処理または処理が不十分なガラス表面に付着するため、サンプルが使用できなくなります(図5A)。私たちは、シラン化カバーガラスを油界面活性剤層で不動態化することにより、再現性のあるサンプルを得るために表面を調製する標準的な方法について説明しました。ただし、このサンプル調製には、利用可能なリソースに応じていくつかのバリエーションがあります。サンプルは、UV/オゾン処理を施さずにシラン化したカバースリップ、または油性界面活性剤層(サンプルセルオプション#2)を施したプレーンガラスカバースリップで作製することができます。これらの方法は調製が簡単ですが、サンプルの油面が不均一になる可能性があり(図5B<.......

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Disclosures

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著者には開示すべき対立はありません。

Acknowledgements

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Todd Thorenson氏、Mike Murrell氏、Jennifer Ross氏、Patrick McCall氏、およびGardel研究室とKovar研究室(シカゴ大学)の他のメンバーには、メソッドの開発に有益な議論をしていただいたことに感謝します。M.A.C.とS.R.は、クレムソン大学のCollege of Engineering Computing and Applied Sciences Undergraduate Research Opportunity Grantsによって部分的に支援され、V.J.A.は、DBIおよびEPSCoRプログラムからの資金提供を受けて、NSF Award #2349368の下でClemson Biophysics REUによって支援されました。この作業は、NSF賞 #OIA-1655740に基づく全米科学財団EPSCoRプログラムによって部分的に支援され、一部はクレムソン創造的調査+学部研究プログラムによって支援されました。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.6 mLマイクロ遠心チューブFisher Scientific05-408-123
008-フルオロ界面活性剤RAN Biotechnologies00115081361-6525
RAN Biotechnologiesの予混合溶液 008-フルオロ界面活性剤008-フルオロ界面活性剤 008-フルオロ界面活性剤-2wtH-50Gプレミックス溶液
2-メルカプトエタノール (&β;-メルカプトエタノール)シグマ アルドリッチ63689CAS 番号: 60-24-2
原液: MilliQ 水中 25 mM、4 °C で保存。C
4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-エタン-スルホン酸 (HEPES)シグマ アルドリッチH3375CAS 番号: 7365-45-9
5 分 エポキシDevcon14250
アクチンサイトスケルトン株式会社AKL99-A>99% 純粋なウサギ骨格筋
(精製の代替)
アクチン (ローダミン標識)Cytoskeleton, Inc.AR05-Aウサギ骨格筋
(精製の代替)
アデノシン 5&プライム;-三リン酸 (ATP)シグマ アルドリッチA6419CAS 番号: 34369-07-8
原液: MilliQ 水中で 25 mM、-20 &g で保存;C
加水分解を避けるために冷凍保存
塩化カルシウム (CaCl2)シグマ アルドリッチC5670CAS 番号: 10043-52-4
キャッピングタンパク質 (マウス)大腸菌 の過剰発現から精製し、HisTag
ストック溶液: -80 &g のキャッピングタンパク質緩衝液中 20 mM;
ウシ肝臓由来の C カタラーゼシグマ アルドリッチC9322CAS 番号: 9001-05-2
原液: 85 ku/mL、グルコースオキシダーゼで等分して-20°Cで保存。C
カバー ガラスフィッシャーブランド12544Cホウケイ酸塩、#1.5、24 mm x 40 mm
フィッシャーブランドではなく フィッシャー ファイネスト
D-(+)-グルコースシグマ アルドリッチG8270CAS 番号: 50-99-7
原液: MilliQ 水中で 225 mg/mL、-20 度で保管;C
ジチオスレイトール (DTT)シグマ アルドリッチ3860-OPCAS 番号: 3483-12-3
原液: MilliQ 水中 1 M、-20 度で保管。C
両面テープ3M3136
エチル アルコホール 200 プルーフPHARMCO111000200CAS 番号: 64-17-5
200 プルーフ
エチレングリコール-ビス (2-アミノエチルエーテル)-N,N,N&プライム;,N′-テトラ酢酸 (EGTA)シグマ アルドリッチE3889CAS 番号: 67-42-5
エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)シグマ アルドリッチE9884CAS番号:60-00-4
グルコースオキシダーゼシグマアルドリッチ345386CAS番号:9001-37-0
原液:MilliQ水で135 mg / mL、カタラーゼで-20°Cで分注して保存します。C
グリセロールシグマ アルドリッチ356352MCAS 番号: 56-81-5
イミダゾールフィッシャー バイオ試薬 BP305-50CAS 番号: 288-32-4
塩化マグネシウム (MgCl2)フィッシャー生物試薬 BP214CAS番号:7786-30-3、7791-18-6
チルセルロースシグマアルドリッチM0512CAS番号:9004-67-5
15センチポアズ
顕微鏡スライドプレーン/ゴールドシール63710-05 3 "x1"、厚さ 1 mm
MilliQ 水MilliporeCUFBI001超純水
Novec-7500 人工流体3M7100134816予混合溶液の代替
塩化カリウム (KCl)シグマ アルドリッチP3911CAS 番号: 7447-40-7
リン酸カリウム (KPO4)シグマ アルドリッチP3786CAS 番号:7758-11-4
ウサギの骨格筋アセトン粉末Pel-Freez Biologicals41995-1アクチンを精製するときに使用(購入の代替)
-80 &gでアクチン緩衝液Gに約30 mMを保管します。C
アジ化ナトリウムシグマ アルドリッチ71289CAS 番号: 26626-22-8
テトラメチルローダミン-C6-マレイミドAnaSpecAS-81445CAS 番号: 174568-68-4 アクチンを精製するときに使用 (購入の代替)
アクチンバッファー G に約 30 mM を -80 度で保存します。アクチンを標識するときに使用します (購入の代替)
トリス塩酸 (Tris HCl)シグマ アルドリッチ648317CAS番号:1185-53-1
バスマソンブランソン CPX2800H
HFE7500 の代替 メ電子顕微鏡科学超音波エ

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Marchetti, M. C., et al. Hydrodynamics of soft active matter. Rev Mod Phys. 85 (3), 1143-1189 (2013).
  2. Needleman, D., Dogic, Z. Active matter at the interface between materials science and cell biology. Nat Rev Mater. 2 (9), 17048(2017).
  3. Murrell, M., Oakes, P. ....

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