方法論記事

神経変性疾患の前臨床モデルにおける関節運動学を研究するための微細運動課題

DOI：

10.3791/68128

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2025年6月13日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Psychology, Arizona State University, 2Phoenix Country Day School, 3School of Biological and Health Systems Engineering, Arizona State University

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

現在の研究では、機械学習を使用して、TgF344-ADラットを含むげっ歯類モデルの運動障害を調べるための細かい運動行動テストについて説明しています。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

運動機能障害は、アルツハイマー病(AD)や関連する認知症などの神経変性疾患の重要な要素でありながら、過小評価されがちな要素です。新しい研究は、人間の微細運動行動、視空間能力、および実行機能を含むタスクが、病気の早期発見に潜在的に存在する可能性があることを示しています。しかし、これらのタスクがADに関連する認知機能の低下を予測する正確なメカニズムについてはほとんど知られていません。現在の方法では、微細運動課題である運動能力課題 (Kinematic Motor Ability Task) が作成され、無料のオープンソース機械学習ソフトウェアを使用して、他の神経変性疾患や正常な老化と比較した AD の前臨床モデルにおける疾患の進行に伴う運動能力の変化を調べています。ここでは、Harmaline誘発性運動障害の有無にかかわらず、Fisher 344 CDFラットのパイロット研究において、微細運動課題の設計、試験、および実施に関する概念実証が確立されました。アルツハイマー病ラットモデル(TgF344-AD)による追加の検証により、モデルの実現可能性とタスク感度がさらに実証されました。ラットは、チャンバーの前面にある小さなスロットから手を伸ばして、難易度の異なる3つのボウルの1つから砂糖ペレットを取り出すように訓練されました。ペレットの回収は、成功(砂糖ペレットをうまくつかんで食べる)、ドロップ(つかむがつかむとおやつを落とす)、または失敗(ペレットが調達されないリーチ、またはつかもうとしたときにペレットがボウルからノックアウトされる)の3つの分類のいずれかを使用して採点されました。対照群とハーマリン治療ラットとの間に運動能力の有意差が観察され、総リーチの減少と足のポーズの変動性の増加によって実証されました。.TgF344-ADラットはまた、すべてのボウルで総リーチの減少と成功の減少を示しました。これをげっ歯類の微細運動課題として検証することで、病理と症状が時間の経過とともに現れるにつれて、ADを含む神経変性疾患の正常な老化と前臨床モデルを研究する将来の可能性があります。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

認知症の人では、アルツハイマー病(AD)やその他のサブタイプ(例:レビー小体型認知症)により運動機能が損なわれることが示されています。握力と歩行速度は、認知障害のある高齢者と障害のない高齢者を区別することができます1,2が、認知症の異なるサブタイプ(すなわち、低い特異性)を必ずしも区別できるわけではありません1,2。したがって、行動と病状との複雑なパターンや関係を評価するために、おそらく機械学習と組み合わせた早期認知症の新しい診断ツールが引き続き必要とされています3,4。動物モデルは、神経変性疾患の進行を調査し、疾患の早期発症、行動相関に関する洞察を提供し、機械学習を分析パイプラインに統合して重症度と症状を区別するために価値があります5,6,7。

人間の新しい行動法は、視空間能力や実行機能8,9,10のような認知処理とともに細かい運動能力を伴うタスクを特定しました。たとえば、機能的な上肢のタスクでは、神経変性のパターンを追跡し、軽度認知障害(MCI)とADを区別できます。このタスクでは、人間はスプーンを使用して、生のインゲン豆(一度に2つ)を中央のホームカップからターゲットカップに移動します。豆がスプーンで獲得される課題の段階は、豆が目標のカップに運ばれる段階よりも認知(具体的には視空間記憶)との強い関連を示す11,12。スプーンがカップに入ると、カップ内の豆が乱れる可能性があり、参加者の動きによってタスクがより困難になる可能性があります。また、試行が進み、ホームカップ内の豆の数が減少すると、作業はより困難になる(すなわち、スプーンで豆を取得する時間が増加する)13。この課題は、AD特異的な病理(アミロイド)9,14および神経変性(海馬萎縮)10,15と相関することが示されており、その性能は、疾患プロセスの早い段階で影響を受ける神経回路および行動プロセスに依存する可能性があることを示唆しています。運動の開始、計画、実行、および運動の修正は、運動皮質を含む脳を横断する多様なネットワークによって制御され、大脳皮質に位置する上部運動ニューロンの細胞体が脊髄内の下部運動ニューロンにシナプスしていることが知られている16。これらの下部運動ニューロンは、筋肉と直接通信して神経筋接合部の動きを制御します。上行路は末梢から脊髄に感覚情報を運び、脳内の下行路は、筋肉17,18に戻る方法と場所に関する方向性情報を伝達します。特に、3xTg-ADマウスやTgF344-ADラットなどの遺伝動物モデルが、AD遺伝子が移動、協調、およびその他の運動障害にどのように影響するかを研究するために以前に使用されてきたため、これらの経路がADの病理によって選択的にどのように影響を受けるかを理解することは、疾患の進行を理解するために重要です19,20,21.通常、これらの課題は全身運動に関連する粗大運動障害に焦点を当てていますが、人間の運動障害ははるかに変動しやすく、げっ歯類では特定が難しい場合があります22。したがって、この変動性を捉えるためには、ヒトモデルと動物モデルの間のギャップを埋めるための新しいタスクが必要です。

運動障害や振戦に一般的に関与している脳領域の1つは、小脳23です。小脳は、正確で協調的な動きの重要な調節因子であり、この随意運動を修正し適応するための下行経路を通じてフィードバックを提供する感覚情報のプロセッサとして機能します24,25。小脳萎縮はAD患者に認められているが、海馬のような他の領域とは対照的に、小脳におけるアミロイド沈着の増加は萎縮の増加と相関しないことに注意することが重要である26。ADの病状の進行は小脳で異なりますが、小脳と海馬の間には多シナプスの双方向接続があり、AD27,28,29で破壊される可能性があります。特に、小脳腫瘍切除術30,31,32,33,34,35,36,37の後に記憶障害が発生することが文書化されているため、小脳と海馬の間には機能的なつながりがあります。げっ歯類では、海馬の場所細胞は小脳の摂動38で破壊される。記憶、社会性、および運動制御におけるこれらの重複する欠損は、認知機能低下30,31,38,39の前に起こる運動経路の潜在的な初期変化を明らかにすることの重要性を強調しています。初期のAD研究における微細運動課題の実施により、ADを単なる認知障害としての従来の理解を再構築し始め、診断努力を早期の運動変化に向け直し、疾患の進行を予測し、認知障害のある高齢者と障害のない高齢者をより大きく区別できるようになる可能性があります。

細かい運動行動が脳構造の変化をどのように示すことができるかを理解するために、上記の人間のタスクのげっ歯類バージョンが作成され、テストされました。このげっ歯類の課題はKINEMAT(KINEmatic Motor Ability Task)と名付けられており、台座や階段から単一のペレットを取り出す必要がある以前の到達課題や、タスク40,41,42,43,44,45,46のすべての段階で一貫したペレットの配置の結果としてのより単純なスコアリングから逸脱しています。47,48.この微細なモーター到達タスクには、新しい採点方法、さまざまな困難を抱えたボウル、人間の相手を模倣する自己摂動機能が含まれ、ペレットの動きとその後の参加者戦略の調整が設計の中心となっています。このタスクでは、機械学習ツールであるSocial LEAP Estimates Animal Poses(SLEAP)とkeypoint-MoSeq49,50を使用して、細かい運動能力と到達行動を偏りなく定量的に測定できます。他の注目すべき計算モデルがげっ歯類44、45、51の熟練したリーチングタスクのために開発されている一方で、keypoint-MoSeqはノイズを排除して、動きと把持ポーズ50の正確な定量化を可能にする。タスクパフォーマンスと運動学習戦略は、Harmaline52を使用して、典型的なラットと運動摂動ラットで高性能マシンビジョンカメラを使用して再構築されました。ハルマリンは、下オリバ核を過活性化し、グルタミン酸作動性クライミング繊維53,54を通じて小脳機能を破壊する。さらに、細かい運動能力は、TgF344-ADラットのサブセットで調べられました。したがって、微細運動課題は、概念実証として、ハルマリン処理ラットとTgF344-ADラットの典型的な対応物と比較して測定可能な障害を見つけることが期待されました。このプロトコルでは、微細運動課題の構築、動物の訓練と試験、およびSLEAPとkeypoint-MoSeqを使用した到達行動の定量化について説明します。

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プロトコル

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ここに記載されているすべての方法は、アリゾナ州立大学の動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されています。

1.チャンバーの設計と建設

  1. 透明なアクリルパネルを準備します。ボックスの回路図は https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask にあります。透明なアクリルパネルを次の寸法にカットします(すべてのパネルの厚さは1cmです)。
    1. 26cm×22cmの2つのサイドパネルを切り取ります。
    2. 天板を切り取ります:27cm×12cm。
    3. 最初の底板を切り取ります:26 cm x 10 cm
    4. 2枚目の底板を切り取ります:26 cm x 11 cm
    5. フロントパネルのカット:20cm×11cm。
    6. 背面パネルを切り抜く:20cm×12cm
    7. フロントパネルのスロット(140 mm x 12 mm)を切り取ります。スロットの下端をパネルの下部に揃えて、スロットを中央に配置します。
    8. 内側の溝を切り取ります:1cm。サイドパネルの内側の端に、フロントパネルがしっかりとスライドして出入りできるように、くぼみまたは溝を作成します。
      注意: スライド機能が不要な場合は、構造を簡単にするためにフロントパネルを恒久的に接着することができます。
    9. 2番目の底板に等間隔の穴(直径5 mm)を開けて、落としたときにペレットが落ちるようにします。穴の間隔を1cm離してグリッドパターンにします。
  2. チャンバーを接着剤で組み立てます(図1A)。
    注意: アクリル素材用に特別に設計された強力で透明な接着剤を使用してください。
    1. サイドパネル:ボトムパネルの端に沿って接着剤の連続線を塗布します。サイドパネルを垂直に置き、しっかりと押します。製造手順に従って接着剤を硬化させます。
    2. 背面パネル:サイドパネルと底面パネルの背面端に接着剤を塗布します。背面パネルの位置を合わせ、所定の位置に押し込みます。
    3. トップパネル:サイドパネルとバックパネルの上端に接着剤を塗布します。トップパネルを位置付け、しっかりと押します。
    4. フロントパネル:フロントパネルをサイドパネルの溝に慎重にスライドさせて、ぴったりと滑らかにフィットするようにするか、フロントパネルの端に沿って接着剤を塗布して、サイドパネル、上部パネル、下部パネルに固定します。
      1. パネルの動きをテストし、チャンバーの他の部分と正確に位置合わせされていることを確認します。
  3. 照明のセットアップ
    1. 赤外線(IR)ライトを試験チャンバーの反対側の端に置き、チャンバーの方を向いています。白い画用紙をチャンバーの上に置き、光を反射させます。
      注意: 照明は適切な追跡に不可欠であり、すべての録音は暗い部屋でIRライトの下で行う必要があります。
  4. トレーニングボウルを準備します。
    1. 3Dプリンターを使用して、半径31mm、延長32mmのトレーニングボウルを製作します。STLファイル https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask で入手可能(図1B:上)
    2. トレーニングボウルをスロットの真正面のチャンバー底に取り付けます。ボウルの上端がチャンバー内のラットの目の高さからほぼ上になるように、木のブロックなどの支持スタンドを使用して、ボウルを配置します。
  5. テストボウルを準備します(図1B:中央と下)。
    1. 付属のSTLファイルを使用してボウルを印刷します。ボウルのデザインは「Plain-Less」と「Plinko」の2種類。(https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask)
      1. 寸法精度と耐久性を検査します(寸法:奥行き50mm×幅40mm)。

2.コンピューターとカメラのハードウェア

  1. 三脚を使用してカメラをしっかりと取り付けます。
  2. カメラをチャンバーのフロントパネルから約15〜20cm離して配置します。
    1. 三脚の高さと角度を調整して、カメラがスロットとボウルの両方の等角投影の45°ビューをキャプチャするようにします。
      注意: カメラのフィールドを確認してください viewラットの足と完全なリーチ、スロット、およびトレーニングボウルまたはテストボウルを囲んでいます。必要に応じてさまざまな角度と距離をテストして、最適な視認性を実現します。
  3. ソフトウェアをダウンロードして、動作記録(https://www.teledynevisionsolutions.com/products/spinnaker-sdk)用にカメラとペアリングし、ソフトウェアを開いてカメラを使用して動作を記録します。
    1. 次のカメラ設定を使用してください:取得モード:連続、フレームレート:216 Hz、露出モード:時限、自動露出:オフ、露出時間:4430 μs、ゲイン自動:オフ、ゲイン:16.85 dB、ガンマ:0.8。
    2. 録画設定は、H264ファイルタイプ、500万(5,000,000)ビットレートです。
    3. 10分間録画するには、130,000フレームを入力し、ストリーミングモードを使用して保存します。
      注:データを保存するには、最低16 GBのRAMと1TBの内部ソリッドステートハードドライブを備えた専用マシンを使用することをお勧めします。

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図1:微細運動課題の概略図。 (A)ラットがスロットを通って糖ペレットを得る微細運動課題の漫画表現。リーチは機械学習分析のために記録されます。(左下)トレーニングボウル、(中央下)プレーン/レスボウル、(右下)赤丸で囲まれた障害物のあるプリンコボウルの3つのボウルが使用されています。(B)各ボウルデザインの概略図((上)トレーニングボウル、(中央)プレーン/レスボウル、(下)Plinkoボウル。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

3.動物の調理

  1. (最低でも)Fisher 344 CDFラット(雄と雌、生後>3か月)を逆の明暗サイクルでペアハウスし、動物が最も活発なときにテストできるようにします。
  2. 慣れ開始の1週間前にすべてのげっ歯類の体重を量り、体重が300gを超えるげっ歯類には~30g、げっ歯類には100-300gの餌を与えて、動物を90%の体重に維持します。
    1. 毎日ラットの体重を量り、それに応じて食物を調整し、げっ歯類が体重の90%に達するまで、1日あたり1〜2 gの食物の量を減らします。毎日の取り扱いは、動物を実験者に慣れさせるのにも役立ちます。
    2. 慣れとテスト全体を通して、この手順を続行し、体重がしきい値を下回るか超える場合は、食品を+/- 0.5 g調整します。
    3. 試験中は、タスク開始前に動物の体重を測定し、タスク完了後にケージに戻ったらすぐに割り当てられた餌を提供します。
      注:1〜2日間で体重が突然減少した場合(>15%)は、根本的な問題を示している可能性があるため、獣医師に相談する必要があります。

4.慣れ(2日間)

  1. IRライト、カメラ、およびコンピューターの電源を入れます。
  2. ペレット入りのトレーニングボウルを開口部に置き、ボウルの先端が装置にわずかに伸びていることを確認します(最初は約2cm)。
  3. ケージを試験室に移し、ラットが5分間順応するのを待ちます。
  4. 1日目:ペアで飼育されたラットをチャンバーに追加し、20分間探索できるようにします。テスト後に3〜5個の砂糖ペレットをホームケージに入れて、ラットがペレットに慣れるようにします。
    注:45 mgのペレットサイズにより、1回のペレット回収が可能です。
  5. ラットの間で消毒用ワイプでチャンバーを清掃します。一日の終わりに、エタノールをスプレーして消毒します。
  6. 2日目:同じ手順を使用して、げっ歯類を個別に装置に慣れさせます(20分)。げっ歯類が怖がっているように見えるか、装置とボウルの前面を避けている場合は、この行動が解決するまで慣れ続けます。ホームケージでおやつとしてペレットを与え続けます(3〜5個のペレット)。
    1. ボウルへの親しみやすさとアプローチを促進するために、慣れ全体を通して細長いチューブを装置シャッターに徐々に移動させ、先端を一度に0.5 cmげっ歯類に近づけて到達を容易にします。.
      注:慣れ、テスト、およびトレーニングはすべて、新しい環境の影響を排除するために、赤い照明の下で同じ場所で実行する必要があります。

5. 整形(10日間)

  1. IRライト、カメラ、およびコンピューターの電源を入れます。
  2. ケージを部屋に移し、ラットが5分間順応するのを待ちます。
  3. トレーニングボウルを使用して、エクステンションに沿って1〜5個のペレットを提供し、初日にエクステンションを装置内に完全に配置します。10分間のセッションで動物を訓練します。シェーピング中の録音はオプションです。
    注:げっ歯類をペレットに慣れさせるためには、装置自体にいくつかの砂糖ペレットを設けて、ボウル内のペレットへの嫌悪感を減らすことが重要です。げっ歯類は、簡単に調達でき、ボウル内のこれらのペレットを認識するため、装置内のペレットを食べる可能性があります。装置の正しい方向を向くことに慣れ、ボウルに触れることに慣れることが重要です。
  4. トレーニングのその後の日には、装置からボウルエクステンションを引っ込め始めます。これには、げっ歯類が前面の開口部に近づき、装置のすぐ外側の延長部との相互作用を促進する必要があります。
    1. この設計により、ペレットの特定の配置が可能になります。たとえば、ペレットをげっ歯類に最も近いボウルの端に置き、徐々に遠ざけて、げっ歯類が装置から手を伸ばすように促します。
  5. げっ歯類がエクステンションの端からペレットを取るのに慣れてきたら、たとえ口だけでも、ピンセットを介してペレットを導入し始め、到達行動を促進します。
    1. 装置のすぐ外側のピンセットに1つのペレットを保持し、げっ歯類がピンセットに触れるだけです。この行動にすぐに報酬を与えて、さらなるリーチを促します。
    2. げっ歯類がピンセットに触れるのに慣れてきたら、ピンセットを装置の開口部から少し離して保持することにより、装置から少し離れてペレットに触れたりつかんだりできるようにします。
      注:すべての動物の行動、特に動物がボウルを恐れている、または手が届かない場合は、メモを取ってください。これらの動物は、追加の成形日数が必要な場合があります。
  6. げっ歯類が最低3日間連続的かつ独立して到達したら(図2A)、到達行動が確立されるまでプレーンボウルに移行します(1日あたり少なくとも10回の独立したリーチで3日間連続的に到達します)。
    1. げっ歯類をプレーンボウルに導入するときは、げっ歯類がボウルの側面にペレットを視覚化できるように、ボウルにできるだけ多くのペレットが充填されていることを確認してください。
      注:この段階では、ピンセットを使用してリーチを促す必要がある場合があります。
  7. ラットの間で消毒用ワイプでチャンバーを清掃します。一日の終わりに、エタノールをスプレーして消毒します。

6. テストの準備をします。

  1. 試験は9日間にわたって完了し(図2A)、各げっ歯類はボウルごとに3回の試行を行い、各10分間の試行は連続した日に行われます。
    注:テストは午前中に行うのが最適です。
  2. テストの各日に、ラットの体重を量ります。完了すると、ラットはテストの前に30〜60分間自宅のケージに放置されます。これは、計量がストレスを誘発し、到達行動を阻害する可能性があるためです。
  3. コンピュータの電源を入れ、ボウルをセットアップします。カメラとライトを接続します。録画ソフトウェアを開き、プロトコルのセクション2で説明されているようにカメラ設定を調整します。
    注意: すべての足の動きをキャプチャするには、少なくとも200フレーム/秒(fps)を記録することをお勧めします。
  4. ボウルをカメラのフレームに合わせ、再生ボタンを押して録画ソフトウェアで視覚化します。ボウルを装置とカメラと同じ高さに置き、ボウルの側面に対して45°の角度で置きます。
    1. カメラを動かして、手の届くところを直接捉えて、個々の指と手のひらの動き、および手のひらが到達するときのボウルの高さに関連する動きを研究します。
    2. カメラをボウルに対して垂直に配置して、ボウルに出入りする腕と手の動きをキャプチャしますが、数字の配置や把持動作の詳細についてはキャプチャしません。
      注:x、y、z平面に沿った動きをキャプチャするには45°の角度が推奨されますが、他の構成では、目的の研究のための情報をより簡単にキャプチャできる場合があります。

7. テスト(9日間)

  1. ネズミを部屋に置き、1時間慣れさせます。
  2. 最初のボウルをボウルプラットフォームに置き、デンタルワックスで固定します。ボウルの前面が装置の開口部と同じ高さで中央にあることを確認します。
  3. Spinview内のビデオファイルに、ラット識別番号、録画日、録画時間を指定して名前を付けます。
  4. ラットを装置に入れます。蓋を閉め、白い厚紙を上に置き、光をそらします。
  5. この時点で、カメラアングルを再確認して適切なシーンがキャプチャされていることを確認し、ボウルが中央に配置されていない場合はボウルを調整します。
  6. 適切な量のペレットをボウルに注ぎ、[ 録音の開始]を押します。
    1-3日目 プレーンボウル:~100ペレット
    4-6日目 ボウル数が少ない:~50ペレット
    7-9日目 Plinkoボウル:~50ペレット
  7. テスト中は部屋にとどまってラットを継続的に監視し、パフォーマンスと行動の達成についてメモを取り、必要に応じてペレットを追加して正しい量を維持します。
    1. プレーンボウルの場合、げっ歯類がボウルの端からペレットを見ることができ、ペレットが常に入手できることを確認します(つまり、ペレットが減少するにつれて試験全体でボウルを満たし、ペレットが層状になります)。
    2. レスボウルの場合:ペレットが互いに積み重なっていないこと、およびネズミが手を伸ばそうとしたときにペレットが散らばるように、ペレット間にある程度のスペースがあることを確認してください。
    3. Plinkoボウルの場合:障害物の間に十分なペレットがあることを確認してください。
  8. 動物を自宅のケージに戻し、割り当てられた餌を提供します。ラットの間で消毒用ワイプでチャンバーを清掃します。
  9. 一日の終わりに、エタノールを噴霧してチャンバー全体を消毒し、翌日に備えます。
    注:オスとメスの両方のげっ歯類をテストする場合は、早朝にテストした一部のメスとオス、および後でテストした同様のミックスで性別を釣り合わせるようにしてください。実験全体を通じてテスターの順序を維持します。

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図2:微細運動課題を実行するラットの訓練と試験(A)実験のタイムライン。ラットを2日間装置に慣れさせた後、10日間成形手順を受けました。動物は、各ボウルに3日間、3つのボウルすべてで細かい運動能力についてテストされました。その後、動物にハルマリンを注射し、各ボウルで3日間にわたって再テストしました。(B)ラット(n = 6)は、成形手順中に2つの異なるボウル(トレーニングボウルとプレーン)を受け、リーチを改善するためにボウルタイプを5日目に切り替えました。基準 (F(9, 45) = 13.5, p < 0.001) に到達するまでに、10 日間で整形が大幅に増加しました。灰色のバーは、元のチューブトレーニングボウルと現在の細長いチューブトレーニングボウルの切り替えを示しています。(C) 3つのボウルすべてをテストした場合、9日間のテストで合計リーチに有意差がありました(F(8, 32) = 3.74, p = 0.003)。注:ラット2は成形後に除去しました。Plinkoボウルは、Lessボウル(p = 0.001)とPlainボウル(p = 0.027)の間に有意差をもたらしました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

8. Harmalineを用いた微細運動破壊のモデル化

注:細かい運動能力と細かい運動課題のパフォーマンスに対する運動障害の影響を特定するために、ラットにハルマリン(10 mg / kg)、モノアミンオキシダーゼ-Aの可逆的阻害剤であり、劣ったオリーブ52,55,56,57を標的とするβ-カルボリンアルカロイドを注射しました。げっ歯類モデルのハーマリンは、姿勢とバランスに影響を与え、細かい運動協調を制限し、上肢の運動障害を誘発します。

  1. ラットの体重を量り、適切なハルマリン投与量を計算します。
  2. ラットが試験室に1時間慣れるのを待ちます。
  3. コンピュータの電源を入れ、ボウルをセットアップします。カメラとライトを接続します。録画ソフトウェアを開き、プロトコルのセクション2で説明されているようにカメラ設定を調整します。
  4. げっ歯類にハルマリン(10 mg / kg、i.p.)を注射します。.
  5. 15分後、ペレットを適切なボウルに注ぎ、録音を開始します。各ボウルでラットを3日間にわたってテストします。
    1日目 プレーンボウル:~100ペレット
    2日目 ボウル数が少ない:~50ペレット
    3日目 Plinkoボウル:~50ペレット
    注:注射後最大3時間、皮膚の炎症、痛みを伴う行動、運動失調、低体温症、姿勢の変化などの異常がないか注射部位を監視します。.3時間のウィンドウに続いて、飲食の遅延や振戦の残存など、行動の変化を引き続き監視します。

9. 機械学習を用いた動画解析

注:データ収集とビデオ録画の後、リーチは手作業でカウントされ、次のように採点されました:成功(ペレットを回収して消費)、ドロップ(ペレットを回収するが、消費前にペレットをドロップする)、失敗(ペレットを回収できない)。このハンドスコアのデータは、機械学習分析のグラウンドトゥルースデータとして使用されました。

  1. https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask でカスタムPythonコードを使用して、ベースラインとハーマリン処理された動物を比較し、リーチパフォーマンスの変化を特定しました(図3、 図4、 図5、 および図6)。
  2. リーチの軌跡、足のコンフォメーションと位置、さまざまなボウルタイプ間のリーチ戦略の変化など、リーチ行動の関節運動学を分析するには、無料のオープンソース機械学習ソフトウェアSocial LEAP Estimates Animal Poses(SLEAP)(オープンソースプログラム49を使用するためのより詳細な説明とステップバイステップガイドについては、https://sleap.ai/ を参照)。
    注: SLEAP49 は https://github.com/talmolab/sleap からダウンロードできます。
  3. 新しいプロジェクトを開き、到達タスクのビデオを3つ追加します。
  4. 15個のノード(上腕1個、手首1個、手のひら中心1個、ベース4個、ナックル4個、指先4個のノード)で構成されるスケルトンを作成します(スケルトンは https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask でダウンロードしてください)。
  5. ノード間にエッジを追加して、上腕が手首に接続し、次に手のひらの中心に接続するようにします。手のひらの中心から、手のひらの中心が常に開始ノードになるように、ベース、ナックル、および指先のノードを接続します(図7A)。
  6. トレーニングを実行する前に、最低50フレームにラベルを付けます。ここでは、新しいモデルをトレーニングしたり、github: https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask で中心化モデルと重心モデルを使用したりできます。
  7. モデルがトレーニングされたら、新しいビデオを開き、inference を実行します: trackin.match: greedy, n_instances:1, tracking.clean_instance_count: 1, tracking.target_instance_count: 1, tracking.pre_cull_to_target: 1.
    注: 推論は、ローカル クラスターで bash スクリプトとして実行できます。追跡されたビデオには校正が必要な場合があります(校正手順については https://sleap.ai/ を参照してください)。
  8. ノードをさらに解析し、ジョイントキネマティクスのグループ間の違いを理解するには、無料のオープンソースのキーポイントであるMoSeq50を使用します(ダウンロードと使用方法の詳細については https://github.com/dattalab/keypoint-moseq を参照してください)。
  9. keypoint-MoSeq50 を使用して、動作の離散的な音節を作成します(図7B)。追加の解析を実行して、ボウルごとのHarmaline条件とBaseline条件間の遷移の頻度の変化、遷移の頻度、確率、および変化をマッピングします(図7C、D)。分析コードについては、https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask を参照してください。

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図3:ボウルを横切る手の届き方と処理の変化。 (A)ベースライン(n = 5)テストでは、3つのボウルすべてで、合計リーチに有意差があり(H(df) = 8.48、p = 0.014、Kruskal-Wallis)、Plinkoボウルタイプ(p = 0.011、ボンフェローニ補正によるポストホックダンテスト)でより多くのリーチが発生しました。(B)ハルマリン(n = 5)の摂動は、ボウルタイプ間の差をもたらさなかった。エラーは S.E.M. *p < 0.05 として報告されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図4:条件間およびボウルタイプ間のパフォーマンスの比較。 (A) ベースライン試験中に有意なボウル (F(2) = 5.78, p = 0.007) と結果差 (F(2) = 3.92, p = 0.029) が見られた。ボウルタイプが難しくなるにつれて、リーチの試みは増加しましたが、ハーマリン状態のすべてのボウルでリーチがベースラインから減少しました。(B)ハーマリン処理ラットでは、ボウル全体のリーチカウントに違いは見られませんでした。.(C)パフォーマンスで分析すると、ベースラインテスト中に有意な結果差(F(2)= 2.07、p < 0.001)がありました。(D)ハーマリンで処理したラットでは、ボウルまたは結果のパフォーマンスに違いは見られませんでした。.エラーはS.E.M.として報告されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-protocol-5
図5:ベースライン条件とハーマリン条件の比較(A)条件間で性能の成功に差はなかった。(B)故障数については、ベースライン条件とハルマリン条件(H(df)= 4.85、p = 0.028、Kruskal-Wallis)との間に有意差があり、ハルマリン条件(p = 0.028、ボンフェローニ補正によるダンの事後検定)で有意な影響が見られました。エラーはS.E.M.として報告されます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-protocol-6
図6:学習率と到達率。 (A)ハルマリン動物は、ベースライン条件と比較して摂動学習率を示しました(t-stat = 2.833、p = 0.022)。(B)1分あたりの総リーチ数では、ボウル(少ない)と条件(ハルマリン)(F(1,5)= 9.83、p = 0.002、混合線形モデル)とボウル(plinko)と条件(ハルマリン)(F(1,5)=22.67、p < 0.001、混合線形モデル)との間に有意な交互作用がありました。Harmalineは、ベースラインと比較して、すべてのボウルタイプで1分あたりの総リーチを減少させました(Less:p = 0.01、Plinko:p < 0.001)。エラーは S.E.M. *p < 0.05、***p < 0.001 として報告されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-protocol-7
図7:機械学習により、独自のポーズとタスク戦略が特定される(A) SLEAPを使用して標識されたラットの足のノードの位置。(B)到達中にkeypoint-MoSeqによって識別される音節の例。(C)連続する音節間のバイグラム遷移頻度の行列。遷移確率は、合計バイグラム数によって正規化されます。(D) HarmalineとBaselineの音節遷移の違いを比較する遷移グラフ。グラフのノードは音節を表し、エッジは音節間の遷移を示します。より目立つエッジは、より高い周波数での音節の遷移を示します。赤色の接続部は、ハルマリン処理動物のアップレギュレーションされた移行を示し、青色の接続部はダウンレギュレーションされた移行を示します。赤い円は規制された使用のアップレギュレーションを示し、青い円はハルマリンで処理された動物で示された音節のダウンレギュレーションされた使用を示します。周波数が0.005未満の音節のペアは除外されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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結果

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ラットが90%の体重の食物制限に達した後、彼らは2日間チャンバーに慣れ、その後1〜2週間の成形手順を受けました。成功したリーチ、ドロップされたリーチ、失敗したリーチの数は、各条件を知らなかった訓練を受けたオブザーバーによってスコアリングされました。9日間(ベースライン)にわたって、ラットは3つの異なるボウル構成(プレーン、レス、およびプリンコ)で細かい運動能力についてテストされました。次に、同じラット(n = 5グループあたり5匹、病気によるトレーニングボウルの成形後に1匹取り除いたラット)にハルマリン(10 mg / kg、i.p.)を1日1回、3日間にわたって注射して、到達能力、戦略、およびパフォーマンスの変化を決定しました(図2A).設計および建設段階では、予備トレーニングボウルは到達能力を高めることができませんでした(1〜4日目)。これにより、トレーニングボウルが細長い形状で再設計され、動物は一貫してペレットに到達するようになり(5〜10日目)、10日目(図2B...

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ディスカッション

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げっ歯類の到達課題は、一般的に単一のペレットに限定されており、神経変性疾患の患者によく見られる障害や自己摂動の特徴は含まれていません。ここで紹介する手法は、再考されたペレット到達タスクと機械学習の両方を使用して、個々の指の動きに加えて、姿勢の特徴と遷移の分析を通じて協調と戦略の両方を検出できます。ここで作成された細かい運動課題は、ポーズとポーズ間の遷移の分析を通じて、協調と戦略を検出しました。典型的なリーチングタスクには、通常、被験者が取り出すための単一の食品報酬が置かれる棚が含まれます。単一の反復的なリーチング戦略に依存しているため、単一ペレットの反復には、タスクの難易度、縦方向に使用した場合の潜在的な学習、テスト中のペレット配置の変更による戦略調整の課題に関連する指標がありません。これらは、この新しい方法で捕捉されます。従来の単一ペレットタスクにおけるこの省略は、単一の反復的なリーチ42の習得により、げっ歯類が速度と精度の両方で頭打ちになるパフォーマンスに天井効果をもたらします。ここに示すように、ペレットの量と障害物が...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は、競合する金銭的利益を宣言しません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、Institute for Mental Health Research、Institute for Social Science Research、Arizona Department of Health Sciences [ADHS14-052688]、US Department of Health and Human Services、National Institutes of Health [P30AG019610]、Arizona Alzheimer's Disease Research Center REC Fellows Program、Arizona Alzheimer's Consortium、Nancy Eisenberg Junior Faculty Scholar Awardの支援を受けました。フィギュアは Biorender.com を使用して作成しました。デザイン協力をしてくださったNelson Yamada氏、Akash Kuppravalli氏、Jeanne Kamau氏に感謝いたします。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
3Dプリント素材アマゾン(序曲)B07PGY2JP1PLAフィラメント 1.75mm PLA 3Dプリンターフィラメント、寸法精度 +/- 0.03 mm
カメラエドモンド・オプティクスBFS-U3-13Y3M-C1.3 MP、モノラル、170 FPS、オンセミ PYTHON 1300 x2
カメラケーブルエドモンド・オプティクスACC-01-2300USB 3.1、3 m、Type-A to Micro-B(ロッキング)ケーブル
カメラレンズソー研究所MVL5WA4.5mm EFL、F/1.4、1/2インチフォーマットのマシンビジョンレンズ
カメラと三脚の接続エドモンド・オプティクス88-210カメラと三脚の接続
クリーニング用ワイプAmazon(Sani-Cloth)B00KMZ7KMOAF3 表面消毒クリーナー ワイプ キャニスター マイルドな香り 160 ct p13872
コンピュータデル精密さIntel Core i7-13700 @ 2.1 GHz、NVIDIA T1000 8 GB、RAM 16 GB
赤外線ライトアマゾン(セルリウム)B0BJFDBT44カメラ赤外線ライト、48個LED赤外線照明、防水、赤外線、夜間視力灯、セキュリティ用CCTVカメラ       
パネルグルーアマゾン(スディンター)B0B1DLRPNZガラス接着剤
プレキシガラスアマゾン(TOOLINHAND アメリカ)B0BRJ1L8TR12 & times;12インチ クリアキャスト アクリル/プレキシグラスシート - 透明 1/8インチ厚さ(3 mm) 
パイソン Pythonソフトウェア財団Python 3.7
スピンビューテレダイン・テクノロジーズバージョン 3.1.0.79 
シュガーペレット(45mg)バイオサーブF002345mg、無味50,000/箱;成分:ショ糖、デキストロース、マグネシウムステアレート、ケイ酸カルシウム、ミネラルオイル
三脚アマゾン(YOUYI)B086PYJF9DAmazon フレキシブルデスク ウェブカメラ三脚
ピンセットファインサイエンスツール11064-07虹彩鉗子
ワックスAmazon(オルソメカニクス)B00FKDC0UU本物のオーソワックス 

参考文献

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