この記事では、新生児Sprague-Dawley(SD)ラットから初代Retinal Müller細胞を単離するための詳細なプロトコルを紹介します。この手順には、眼球の核摘出術、網膜組織の解剖、細胞の抽出と同定、およびその後の細胞培養に関する重要な考慮事項が含まれます。
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この記事について
サマリー
要約
網膜ミュラー細胞(RMC)は、網膜内の構造的支持を提供し、さまざまな機能を調節する上で重要な役割を果たします。網膜微小環境の中核成分として、RMCはいくつかの重要な機能を果たします。これらの細胞は、豊富なイオンチャネル、リガンド、受容体、膜貫通トランスポーター、および酵素系を通じて、神経伝達物質と栄養因子の分泌に貢献し、網膜代謝を調節し、水イオン恒常性を維持します。特に、RMCは最近、内因性網膜再生幹細胞の重要な供給源として特定され、網膜変性疾患の治療のための新しい治療標的を提供しています。したがって、RMCの研究は、網膜障害の根底にある病理学的メカニズムを理解するために不可欠です。この研究では、トリプシンの消化と一次RMCの精製、倒立光学顕微鏡とヘマトキシリンおよびエオシン(HE)染色による形態学的観察、免疫蛍光染色による特異的タンパク質の同定、フローサイトメトリー による 細胞純度分析を含む標準化された実験プロトコルを体系的に確立します。このプロトコルは、RMCに関連する基礎研究と臨床応用の両方にとって貴重な参考資料として機能し、網膜疾患におけるRMCのメカニズムの探索をサポートし、治療戦略の開発を進めます。
概要
網膜ミュラーグリア細胞(RMC)は、網膜の主要なマクログリアであり、網膜神経血管ユニット1,2のコアを形成します。網膜の厚さのほぼ全体に広がるRMCは、ほぼすべての網膜ニューロンと微小血管系を覆っています。その突起は、上向きに内限膜(ILM)まで伸びて頂端部を形成し、下向きに外側制限膜(OLM)まで伸び、そこで特殊な微絨毛3を発達させます。このユニークなアーキテクチャにより、RMCは網膜組織4,5の主要な構造足場として機能することができます。
RMCは、イオンチャネル、リガンド、受容体、膜貫通トランスポーター、および酵素6が豊富であり、解糖7を介して網膜グルコース代謝に関与しています。カリウムイオンチャネル(Kir2.1、Kir4.1)と水チャネルタンパク質(AQP4、AQP9、AQP11)は、細胞膜全体でイオンと水の恒常性を協調的に調節し、網膜の生理学的バランスを維持します7。さらに、RMCは、グルタミン酸、γ-アミノ酪酸(GABA)、グリシン7,8などのニューロンから放出される神経伝達物質を吸収して除去します。
糖尿病性網膜症7、緑内障9、網膜色素変性症10などの病的状態は、RMCを損傷し、血液網膜関門を破壊し、炎症を引き起こし、血管透過性を高め、網膜機能を損なう可能性があります。RMCは、網膜再生細胞11,12の潜在的な内因性供給源としても認識されています。魚類および特定の両生類では、RMCは、損傷によって失われたニューロンを置き換える網膜前駆細胞に脱分化することができる13。成体哺乳類の網膜では、RMCは幹細胞関連マーカータンパク質14,15を発現し、加齢黄斑変性症、緑内障、糖尿病性網膜症などの変性疾患において、網膜ニューロンに分化し、損傷細胞を置き換える可能性を付与する16。一次RMCは、in vivoの状態を密接に模倣しており、網膜変性疾患の研究と治療に大きな価値があります。しかし、文献には、特に新生児Sprague-Dawley(SD)ラットから一次RMCを分離および培養するための確立された方法はほとんどありません。
このプロトコルは、性別の好みなしに、3-5日齢の新生児SDラットを利用します。無菌条件下では、眼球を除核し、トリプシンを使用して網膜組織を消化します。その後、一次RMCは、その後の培養と継代のために、遠心分離と精製 によって 単離されます。倒立光学顕微鏡とヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色を組み合わせた形態学的解析により、単離された細胞が特徴的なRMC特性を示すことが明らかになりました。免疫蛍光染色により、グルタミンシンテターゼ(GS)、細胞性レチナールデヒド結合タンパク質(CRALBP)、ビメンチン、アクアポリン-4(AQP4)、および内向き整流カリウムチャネル4.1(Kir4.1)などのRMC特異的タンパク質マーカーの発現が確認されました。GSおよびCRALBP抗体で標識した後のフローサイトメトリー解析では、細胞純度が≥90%であることが示され、これはRMCベースの生物学的実験の確立された基準を満たし、その後の機能研究への適合性を確保しています。実験過程では、4継代目の細胞は培養フラスコへの付着力の低下、形態学的変化、老化の兆候を示し、最終的には細胞死に至りました。したがって、最初の3つの継代からの細胞のみがその後の実験で使用されました。
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プロトコル
すべての動物実験は、眼科および視覚研究における動物の使用に関するARVO声明に従って実施され、成都中医薬大学の動物倫理委員会(倫理番号:2024069)によって承認されました。この研究では、50匹の特異的病原体フリー(SPF)Sprague-Dawleyラット(3〜5日齢、性別不詳、体重7〜10 g)が使用されました。動物は商業的に入手され、成都中医薬大学実験動物センター(施設使用許可番号:SYXK[四川]2024-049)で標準的な実験室条件下で飼育されました。この研究で使用した試薬と機器の詳細は、 材料表に記載されています。
1. 一次 RMC の分離と培養
- 実験項目の準備
- T25培養フラスコ、遠心分離管とラック、ピペットとスタンド、液体廃棄物の容器、シガレットライター、スピリットアルコールランプ、マーカー。
- 1mLピペットチップ、ベンディングプレート、蓋付きガラスシャーレ、湾曲ピンセット、45μmナイロンメッシュ(300メッシュ)、歯付きピンセット、歯なしピンセット、マイクロ角膜ハサミ。
- 環境への準備:眼球解剖用の環境と手術台を紫外線で30分以上消毒します。クリーンベンチに入る前と出た後、毎回実験者の手にアルコールをスプレーします。インキュベーターを37°Cおよび5%CO2に設定します。インキュベーターを開く前と後に、実験者の手にアルコールをスプレーします。
- 溶液の調製:D-ハンク溶液、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、ダルベッコ修飾イーグル培地(DMEM高グルコース)、ウシ胎児血清(FBS、熱不活性化)、ペニシリン/ストレプトマイシン溶液(100倍)、および0.25%トリプシンEDTA溶液を調製します。
注:使用前にDMEMとFBSを37°Cのウォーターバスで温めてください。- 1%ペニシリン/ストレプトマイシンを含むD-ハンク液とPBS液を調製するには、100 μLのペニシリン/ストレプトマイシン溶液をD-ハンク液またはPBS液10 mLにそれぞれ加えます。.
- 100 mLの高グルコースDMEMに100 μLのペニシリン/ストレプトマイシン溶液と2 mLのFBSを加えて、完全な培地を調製します。
注:実験室のクリーンベンチで溶液を調製し、可能な場合はすぐに使用してください。完全な培地を4°Cで保存し、使用する前に毎回37°Cに温めてください。1週間以上保管する場合は廃棄してください。
- 目の除去
- 新生児SDラットを子宮頸部脱臼(CO2窒息なし)により安楽死させます 施設で承認されたプロトコルに従って滅菌された作業台で。体を75%アルコールに5分間浸して消毒し、滅菌済みの湾曲した皿に移します。
- D-ハンクの溶液を2つの10cmガラス培養皿に注ぎます。
- 歯付きピンセットを使用して、眼瞼裂に沿ってまぶたを引き裂き、眼球を露出させます。
- 歯のないピンセットを開いて眼瞼裂と平行に保持し、眼窩を押し下げます。視神経に到達して眼球が露出したら、ピンセットを閉じて眼球を持ち上げて取り出します。
- D-ハンク液を入れたガラス培養皿に眼球を入れてすすぎ、新鮮なDハンク液を入れた別の皿に移します。
注意: 眼球が無傷のままであることを確認してください。理想的には、網膜組織の分離を容易にするために、視神経の一部を付着させたままにしておく必要があります。
- 網膜解剖
- 滅菌した蓋付きの空の培養皿を準備し、顕微鏡を調整します。
- ステップ1.4.5のガラス培養皿を顕微鏡下に置きます。湾曲した眼科用マイクロ鉗子を使用して、角膜と視神経の間の領域を優しく固定し、角膜を露出させます。
- 角膜の接合部をマイクロ角膜ハサミで穿孔します。輪部に沿って円形に切り込み、長さ約2mmの対称的な強膜切開を行います。鉗子を放し、視神経と強膜の接合部で再度クランプします。
- 2番目の鉗子を使用して視神経根の近くを優しく押し、角膜-視神経界面に圧力を向けます。水晶体組織が出てきたら、慎重に取り除き、網膜組織が浮かび上がるまで押し続けます。
注意: 誤って網膜組織を摘出しないように、レンズを慎重に取り外してください。 - 分離した網膜組織を鉗子を使用して別の滅菌培養皿に移します。皿に蓋をし、アルコールをスプレーして、クリーンベンチに置きます。
- プライマリ RMC の抽出
- クリーンベンチ換気スイッチをオンにします。
- 培養皿の蓋を開けます。先端が1mLのピペットを使用して、網膜組織を約15回上下にピペットで動かし、細かく砕きます。0.25%トリプシン1 mLを加え、37°Cで5分間インキュベートします。
- 培養皿をインキュベーターから取り出し、クリーンベンチに置きます。2 mLの完全培地を加え、ピペットで静かにピペットで消化を止めます。
注:消化を終了するには、2倍の量のトリプシンを使用してください。.例えば、1 mLのトリプシンを使用した場合は、2 mLの完全培地で終了します。 - 細胞懸濁液を300メッシュのナイロンスクリーンでろ過し、15 mLの遠心チューブに入れます。準備したPBSで皿を洗い、残りの懸濁液を回収します。
- チューブを878 x g で室温(RT)で5分間遠心分離します。上清を吸引して捨てます。ペレットを2 mLの完全培地に再懸濁し、再度878 x g で5分間遠心分離して細胞を精製します。
- 遠心分離後、上清を捨てます。細胞を2 mLの完全培地に再懸濁します。事前に各T25フラスコに3 mLの完全培地を加え、次に1 mLの細胞懸濁液を加えます。フラスコを十字型に振ってインキュベーターに入れます。
- インキュベーションの48時間後に最初の培地交換を行います。インキュベーターからフラスコを取り出し、クリーンベンチに置きます。使用済みの培地を廃棄し、細胞付着面をPBS1mLで3回洗浄します。
- 5 mLの新鮮な完全培地を加えます。細胞の密度が90%を超えるまで、一日おきに培地を交換し続け、その後、継代培養を進めます。
2. RMCの通過
注:コンフルエントが90%を超える場合は、細胞を継代します。このプロトコルでは、初代培養は通常、単離後5〜6日で継代する必要があります。最初の通過のタイミングは、めっき密度によって異なる場合があります。細胞密度を4 x 103細胞/mLに調整し、細胞をT25培養フラスコに播種します。3〜4日後に合流点が>90%に達したら、継代を進めます。
- T25培養フラスコをインキュベーターから取り出します。培地を廃棄し、1%ペニシリン/ストレプトマイシンを含むPBS溶液1mLで細胞を3回洗浄します。
- 0.25%トリプシン-EDTA溶液1 mLをフラスコに加え、1分間30秒間インキュベートします。
- 倒立顕微鏡でフラスコを観察します。細胞が丸く見え、分離し、浮き始めたら、インキュベーターからフラスコを取り出します。クリーンベンチに移し、2 mLの完全培地を加えて消化を終了します。
- ピペットを使用して細胞懸濁液を吸引します。フラスコの壁にそっとピペットで触れて、残っている付着細胞を取り除きます。
- 細胞懸濁液全体を15 mLの遠心チューブに移します。1%ペニシリン/ストレプトマイシンを含む2mLのPBSでフラスコ壁をすすぎ、同じチューブに加えます。.チューブを878 x g でRTで5分間遠心分離します。
- 上清を捨てます。細胞ペレットを適切な量の完全な培地に再懸濁します。必要に応じて、1:2または1:3の比率で細胞を継代します。
注:下流の実験には、継代2(P2)の細胞を使用します(図1)。
3. ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色
- ウェルあたり2 x 105細胞の密度で予め配置された滅菌カバースリップを含む6ウェルプレート内のシード継代2(P2)細胞。各ウェルに2 mLの完全培地を加えます。細胞が約80%のコンフルエントに達したら、培地を廃棄し、各ウェルを1 mLのPBSで2回穏やかにすすいでください。
- 4%パラホルムアルデヒド固定剤1 mLを各ウェルに加え、30分間インキュベートして細胞を固定します。固定液を捨て、PBS1 mLで細胞を2回洗浄します。
- 各ウェルに1 mLのヘマトキシリン染色液を加え、15分間インキュベートします。染色液を捨て、PBS1mLでウェルを2〜3回すすいでください。
- 顕微鏡で細胞を観察します。ヘマトキシリン染色が濃すぎるように見える場合は、1%塩酸アルコールを使用して、余分な細胞質染色を区別して除去します。PBS1mLで2〜3回洗浄します。
- 各ウェルに1 mLのエオシン染色溶液を加えます。顕微鏡下で約30秒間、または目的の色の強度が得られるまで染色を観察します。ウェルを1mLのPBSで2〜3回すすぎます。カバーガラスを中性樹脂を使用してスライドに取り付けます。
4. 免疫蛍光染色
- ウェルあたり2 x 105細胞の密度で、事前に配置された滅菌カバースリップを含む6ウェルプレートにP2細胞を播種します。各ウェルに2 mLの完全培地を加えます。
- 細胞が約80%のコンフルエントに達したら、培地を廃棄します。カバースリップをはがし、染色瓶に入れます。カバーガラスをPBS1mLで3回、毎回5分間洗浄します。
- 細胞を覆うために、約50μLの透過処理溶液(Triton X-100:PBS=1:200)を加えます。室温で5分間インキュベートした後、PBS1 mLで毎回5分間、3回洗浄します。約50 μLの3% BSAブロッキング溶液を加え、室温で20分間インキュベートします。
- ブロッキング溶液を静かに廃棄します。PBSで調製した一次抗体溶液約200 μLをスライドに覆うように追加します:AQP4 (1:100)、Kir4.1 (1:200)、GS (1:200)、CRALBP (1:50)、またはビメンチン (1:200)。カバーガラスを加湿チャンバーに入れ、4°Cで一晩インキュベートします。
- カバーガラスをPBS1mLで3回、毎回5分間洗浄します。
- 約200 μLのFITC標識ヤギ抗ウサギIgG二次抗体17を添加します。暗所で室温で50分間インキュベートします。カバーガラスをPBS1mLで3回、毎回5分間洗浄します。
- DAPIで核を10分間染色します。PBS1 mLで3回、毎回5分間洗浄します。
- スライドにフェード防止封入剤を1滴加えます。カバースリップをセル側を下にして取り付けます。密封し、蛍光顕微鏡で観察します。
5. フローサイトメトリー
- フローサイトメトリー染色バッファーを使用して、細胞濃度を1.0 x 107細胞/mLに調整します。
- 100 μLの単一細胞懸濁液を、条件ごとに2つの別々のサンプルチューブに分注します。1つのチューブをネガティブ(染色されていない)コントロールとして指定します。
- 100 μLの透過化培地A(市販のキットから、 材料の表を参照)を各チューブに加えます。静かに混合し、暗所で室温で15分間インキュベートします。
- 各チューブに3 mLの予冷済みフローサイトメトリー染色バッファーを加えます。300 x g でRTで5分間遠心分離し、上清を捨てます。
- 100 μLの透過化培地B(市販のキットから)を各チューブに加え、ボルテックスして混合します。0.1 μLのCRALBP抗体を指定のサンプルチューブに、0.8 μLのGS抗体を対応するチューブに加えます。ネガティブコントロールチューブに抗体を添加しないでください。暗所で4°Cで30〜60分間インキュベートします。
- 各チューブに3 mLのフローサイトメトリー染色バッファーを添加します。300 x g でRTで5分間遠心分離し、上清を捨てます。
- 各チューブを100 μLのフローサイトメトリー染色バッファーに再懸濁します。各CRALBP染色チューブに1 μLのFITC標識ヤギ抗ウサギIgG(H&L)を、各GS染色チューブに1 μLのPE標識ヤギ抗ウサギIgG(H&L)を添加します。ネガティブコントロールチューブに抗体を添加しないでください。暗所で4°Cで30〜60分間インキュベートします。
- 各チューブに3 mLのフローサイトメトリー染色バッファーを添加します。300 x g で5分間遠心分離し、上清を捨てます。
- 各チューブを300 μLのフローサイトメトリー染色バッファーに再懸濁します。すぐにフローサイトメトリー解析を進めてください。あるいは、1%-4%パラホルムアルデヒドを500 μLに再懸濁し、暗所で2-8°Cで保存し、24時間以内に分析します。
- フローサイトメトリーソフトウェアを使用して、ネガティブサンプルとポジティブサンプルを分析します。
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結果
初代細胞を培養フラスコに播種した後、その後の培地交換と継代により、接着不良のRMCを排除し、継代中に発生する細胞破片を除去し、培養中のRMC集団を濃縮します。RMCは、倒立型光学顕微鏡(図1)およびヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色(図2)を用いて、その形態に基づいて同定しました。免疫蛍光染色は、GS、Vimentin、CRALBP、AQP4、およびKir4.1に対する特異的抗体を用いて行い、タンパク質の発現を観察しました(図3)。さらに、GSおよびCRALBP抗体標識を使用してフローサイトメトリーを実施し、RMC集団の純度を決定しました(図4)。
図1
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ディスカッション
この記事では、新生児SDラットから一次RMCを分離するための詳細なプロトコルを提供します。このプロトコルは、実験前の準備、眼球摘出術、網膜組織の分離、RMC抽出、培養、継代、同定の段階的な手順など、すべての段階をカバーしています。また、細胞培養プロセス全体を通じて観察すべき重要な考慮事項を強調し、関連研究のための標準化された技術ガイダンスを提供します。
RMC抽出には、3〜5日齢の新生児SDラットを選択しました。この年齢のラットでは眼球のサイズが小さいため、眼球の分離と網膜組織抽出の手順は、高い技術的熟練度を必要とする重大な運用上の課題を提示します。特に、組織サイズが小さいと、初代細胞の収量が少なくなります。さらに、継代数の増加に伴い、細胞生存率は培養中に徐々に低下し27、多くの場合、その後の研究に必要な細胞数を達成するために、より多くの実験動物の使用が必要になる。
網膜グリア細胞の研究では、出生後1-3日目のS...
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開示事項
すべての著者が、この記事の内容に関連する利益相反を持っていません。
謝辞
この研究は、四川省自然財団基金(2023NSFSC0690)の支援を受けました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 0.1% Triton X-100 | Solarbio | T8200 | |
| 0.25% トリプシン-EDTA | ハイクロン | SH30042.01B | |
| 1% 塩酸アルコール | BIOSYSTEMS | 3803651E | |
| 4% パラホルムアルデヒド | Solarbio | P1110 | |
| 45μm ナイロン メッシュ (300 メッシュ) | Solarbio | YA0926 | |
| 6 ウェル プレート | Servicebio | IMC202302001 | |
| 6 cm ガラス ペトリ皿 | Normax | 5058541 | |
| 75% アルコール | KESHI | GEA004 | |
| アクアポリン-4 (AQP4) | Proteintech Group, Inc | 16473-1-AP | |
| BSA | Servicebio | GC305010 | |
| 細胞培養インキュベーター | Thermo | FORMA311 | |
| 細胞レチアルデヒド結合タンパク質 (CRALBP) | HUABOI | HA721330 | |
| 遠心分離機 | 湖南 Xiangyi | TDZ5-WS | |
| クリーンベンチ | ZHICHENG | ZHJH-C12 | |
| 角膜ハサミ | Jinzhong | BXGJ | |
| DAPI | Solarbio | G1012 | |
| D-Hank 溶液 | Solarbio | H1045 | |
| DMEM 高グルコース媒体 | Gibco | C11995500BT | |
| ウシ胎児血清 (FBS) | Sbjbio ライフサイエンス | BC-SE-FBS01 | |
| FIX&PERMミディアムA | MultiSciences | GAS006/2 | |
| FIX&PERM Medium B | MultiSciences | GAS006/2 | |
| フローサイトメトリー染色バッファー | MultiSciences | S1001 | |
| Fluoromount-G 蛍光封入剤 | SourthernBiotech | 0100-01 | |
| グルタミン合成酵素ポリクローナル抗体 | Proteintech Group, Inc | PTG-11037-2-AP-50ul | |
| Goat 324 抗ウサギ IgG H&L PE | Bioss | bs-0295G-PE | |
| ヤギ抗 - 323 ウサギ IgG H&L FITC | Bioss | bs-0295G-FITC | |
| ヘマトキシリン-エオシン (HE) 染色キット | Solarbio | G1120 | |
| 高圧消毒機 | zealway(xiamen) instrument Inc | GI80DS | |
| 倒立蛍光顕微鏡 | Nikon | SMZ1500 | |
| 逆位相差顕微鏡 | ライカ | DMIL | |
| 内向き整流器カリウムチャネル 4.1 (Kir4.1) | Proteintech Group, Inc | 12503-1-AP | |
| 中性樹脂 | Solarbio | G8590-100 | |
| ペニシリン - ストレプトマイシン溶液 (100×) | ハイクロン | SV30010 | |
| リン酸緩衝液生理食塩水 (PBS) (pH7.2- 7.4) | Solarbio | P1020-500ml | |
| 二次抗体 (FITC 標識ヤギ抗ウサギ) | Servicebio | GB22303 | |
| Sprague-Dawley ラット | 成都大碩実験動物有限公司 | 製造許可番号:SCXK [四川省] 2020-0030 | |
| T25培養フラスコ | コーニング | 430639 | |
| トルネードチューブ:15mL | WHB | WHB-15-1 | |
| トルネードチューブ: 50mL | WHB | WHB-50-1 | |
| 消毒滅菌器 | GEMEISI | xd06 | |
| メンチン | Abcam | ab92547 |
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