閉塞性心筋梗塞モデルの開発のためのラットにおける左前下行冠動脈の結紮

サマリー

このプロトコルは、ラットの左前下行冠動脈を永久に結紮することによる心筋梗塞(MI)モデルの開発を示しています。心筋梗塞後の動物の生存は、虚血帯の心筋細胞を救い、梗塞の拡大を防ぎ、心筋後の炎症と線維症を軽減するために不可欠です。

要約

虚血性心疾患や脳卒中を含む心血管疾患 (CVD) は、世界中で死亡と罹患率の主な原因となっています。心筋梗塞は、虚血が長引くために発生する虚血性心疾患の臨床症候群です。虚血性心筋は機能的、代謝的、構造的変化を起こし、壊死により心筋の一部に不可逆的な損傷を引き起こします。心筋梗塞の実験モデルは、心筋梗塞中および心筋梗塞後に発生する急性および慢性の細胞、分子、および形態学的変化を理解し、治療のための新しい標的または戦略を開発および最適化するために重要です。左冠状動脈前下行動脈 (LAD) の永久閉鎖を採用した小動物における心筋梗塞の外科モデルは、ヒト心筋梗塞にほぼ似ています。この研究の目的は、ラットの LAD 冠状動脈の消えない閉鎖を含む外科的に誘発された心筋梗塞モデルを確立することです。実験プロトコルには、ケタミン 80 mg/kg およびキシラジン 12 mg/kg i.p. による麻酔の初期導入、外因性呼気終末陽圧 (PEEP) を使用して人工呼吸器補助換気下で気管切開を行わずに耳鏡を使用した気管内カニューレの挿管が含まれます肺胞の虚脱を防ぐため。手術中に骨格筋に生じる病変を制限する開胸術が採用されました。このアプローチは低侵襲で再現性があり、手術後の死亡率を低下させます。このモデルでは、動物は心筋梗塞後 4 日間生存して、短期的な病態生物学的変化、主に心筋梗塞後の炎症、梗塞治癒の自然なプロセスとしての血管新生、そして最終的には梗塞心筋の線維化を理解しました。

概要

主に虚血性心疾患 (IHD) と脳卒中を含む心血管疾患 (CVD) は、世界中で死亡と罹患率の主な原因となっています。世界心臓連盟によると、2021 年には 2,050 万人が心血管疾患で死亡しました ^1,2。心臓発作としても知られる心筋梗塞 (MI) は、IHD の急性臨床症候群です。心筋梗塞中、心筋組織は長期にわたる虚血の結果として不可逆的な損傷を受けますが、これは通常、冠状動脈の破裂したアテローム性動脈硬化性プラークの上に形成される閉塞性血栓によって引き起こされます³。

経皮的冠動脈インターベンション (PCI) または血栓溶解薬を使用したタイムリーな再灌流は、虚血性心筋を壊死から救うための主要な治療法です ^3,4。先進国では、PCIの導入拡大により、心筋梗塞後の死亡率は低下しているが、心筋梗塞の発生率は南アジアなどの発展途上国で増加^{している5。}心筋梗塞後、壊死した心筋の一部は、可逆的に損傷した心筋細胞のゾーンと虚血ゾーンに囲まれます。虚血性心筋は心筋梗塞後の心室リモデリングを受け、心室の拡張と機能不全を引き起こし、最終的に心不全に進行する可能性があります⁶。

現在、幹^{細胞療法7} によって損傷した心筋細胞の再生を促進し、虚血帯⁸内の血管新生を刺激することで心筋修復を促進するための広範な研究が行われています。ただし、両方のアプローチの臨床的成功には、戦略の大幅な改善が必要です。したがって、心筋梗塞または虚血を模倣した実験モデルは、心筋梗塞中および心筋梗塞後に発生する病理学的、細胞的、分子的、および形態学的変化を理解し、新しい治療標的または治療戦略を特定し、臨床翻訳のために最適化するために非常に重要です。本研究では、ラットの左前下行(LAD)冠動脈を不可逆的に閉鎖することにより、心筋梗塞の実験モデルを開発した。まず、気管切開を行わずに、気管切開を行わずに、無気肺(肺の気嚢の収縮/虚脱)を防ぐために外因性呼気終末陽圧(PEEP)を適用することにより、気管内挿管を実施しました。胸腔を開くために低侵襲手術が採用され、手術中の骨格筋の損傷が回避されました。結紮の位置には、LADの最初の対角枝の起点が関与しており、これは十分な梗塞を引き起こし、閉塞性心筋梗塞(OMI)の臨床状態を模倣します。結紮の場所は LAD の中央領域であるため、手術後の死亡率および術後合併症は低くなります⁹。このモデルでは、動物は心筋梗塞後 4 日間生存し、心筋梗塞後の心筋組織で発生する短期的な変化を理解し、心筋梗塞を治療するための新しい標的と戦略を特定しました。

プロトコル

実験手順は、施設動物倫理委員会 (IAEC) [プロトコル番号] からの承認後、プロトコルに従って実行されました。(IAEC/KCP/2023/009)]。実験動物の取り扱いと世話は、管理と監督を目的とした委員会(CCSEA)とインド政府の環境・森林・気候変動省のガイドラインに従いました。

1. 気管内カニューレの麻酔と挿管 (所要時間: 10-15 分)

1. 体重200〜240 g、生後6か月以上の男女のWistarラットを使用してください。ネズミの体重を記録します。腹腔内経路を介して体重に応じてケタミン(80mg / kg)およびキシラジン(12mg / kg)を投与することにより、ラットを麻酔します。
   注: 解離性麻酔薬であるケタミンは、迅速な麻酔をもたらしますが、部分的な筋肉の固定を引き起こします¹⁰。したがって、キシラジンと組み合わせて使用して、筋肉の弛緩を引き起こし、外科的麻酔の状態を達成する¹¹。
2. 尾をつまんで麻酔の程度を確認します。ラットが反射神経を示す場合は、ケタミンの^用量の1 /3を投与します。加熱パッドを人工呼吸器に接続して手術台の上に置き、恒温加温を提供します。
3. ラットを加熱パッド上の背側褥位に置きます(図1A)。粘着テープを貼ってラットをこの位置に保持し、手術台を傾斜した位置にセットします。
4. 一回換気量を 8 mL/kg (2-3 mL/分)、呼吸数を毎分 77 回呼吸 (bpm)、ピーク圧 (ピーク吸気圧) を 15 cm H₂O で調整します。肺の虚脱を防ぐために、呼気終末陽圧(PEEP)を2 cm H₂Oに調整します。
5. 気管内挿管を行うには、舌をつかみ、鈍いピンセットで持ち上げます。耳鏡(図1B)を口に挿入して声帯を観察し、気管内カニューレ(図1B および 図2A)を声帯を通して導入します。喉頭蓋をはっきりと見るには、上から喉の周りに懐中電灯を投影します。
6. 気管内カニューレを人工呼吸器チューブに接続し (図 1A および 図 2B)、胸部の動きを監視して、正しい挿管を確認します。腹部の腫れは食道挿管の疑いを示し、ステップ 1.8 に従って挿管を繰り返します。
7. すべてのセットアップが完了したら、LADライゲーションに外科用実体顕微鏡を使用し(図1A)、手術中に加熱ランプを使用してラットの体温を37°Cに維持します。
8. 脱毛クリームをラットの首と胸部に塗布し、10〜20分間放置します。ネズミの毛皮を首から胸部までそっと取り除きます。

2. 心筋梗塞の外科的導入(所要時間:20〜25分)

1. ピンセットを使用して剣状突起の皮膚を摘み取り、はさみを使ってわずかな切開(約1 cm)を行い、続いて剣状突起から始めて胸鎖乳突筋に向かって縦方向に切断します。
   1. 重度の出血を防ぐために、筋膜を傷つけないようにしてください。出血がある場合は、包んだワイプを使用して出血部分を優しく押します。
2. 胸鎖乳突筋の基部から5^〜6^番目の 肋骨まで、胸骨の左側に沿って筋膜と胸筋を切断します。
3. 鉗子を使用して、胸骨の左側に向かって3^番目 と4^番目の 肋間腔に穿刺します。穴(約6〜8 mm)を開けている間、心臓や肺を傷つけないでください。このステップで覗き見を適用します。
4. 肋骨カットニッパーを使用して、肋間筋とともに4^番目、5^番目、および6^番目の 肋骨を切断し、残りの肋間筋を鉗子で切り離します(図2C)。
5. リブリトラクターをそっと挿入して、リブを離し、心臓を露出させます(図2D)。左心房をはっきりと見るには、ピンセットと湾曲したハサミを使用して、心膜と胸腺を心臓の前面から分離します。
6. 縫合糸による結紮のための左前下行 (LAD) 冠状動脈の位置を特定します。
   1. 心膜を慎重に除去した後、LADを心室間溝に沿って心臓の基部から頂点まで斜めに走る顕著な表在動脈として識別します。LADは2つの枝に分かれます:まず、心室中隔に穴を開ける中隔枝(S1およびS2)。斜めの枝(D1およびD2)と呼ばれる2番目の枝のセットは、左心室の前部に穴を開けます。
   2. LADの3つの領域、すなわち近位、中位、遠位領域を特定します。近位LAD:その起源から最初の枝までのLADの領域で、中隔または対角線のいずれかである可能性があります。Mid LAD:最初の枝と2番目の斜め枝の間の領域。遠位LAD:2番目の対角枝を越えた領域は、遠位LADとして知られています(図2E)。
   3. LADは、壁が厚い拍動性の赤みがかった動脈として現れます。その位置を確認するには、マイクロ鉗子で軽く押すと、脈動が感じられます。
7. 8-0 を渡して LAD を永久に閉鎖します。最初の対角枝D1の起点近くの中央LAD領域にシルク縫合糸を針ホルダーを使用し、縫合糸を優しく引っ張って、心臓への害を防ぎます(図2E)。
8. 鉗子を使用して、同じ方向で結紮糸の2つの結び目(外科医の結び目)を作ります。鉗子を使って両側に複数の結び目をつけて結紮糸を固定します。

3.偽手術

1. 手順 2.1 から 2.6 を実行します。左側開胸術を行った後、心臓を露出させ、絹縫合糸を通し、結紮せずに左主冠動脈(LAD)の下を引っ張ります。

4. 治療薬の投与(所要時間:2〜5分)

1. LAD結紮後、直ちにドキサゾシン0.06mg/kgを治療群の尾静脈から静脈内注射します(図3)

5. 外科手術後の胸腔閉鎖(所要時間:5分)

1. リトラクターを取り外して、肋骨と肋間筋が元の位置に戻るようにします。6-0シルク縫合糸を使用して左右の肋間筋を縫合して胸腔を閉じます。4-0プロレン縫合糸でステッチを行い、皮膚を閉じます(図2F)。

6. 術後のケアとモニタリング(所要時間:40分〜60分)

1. 手術したラットを40分以上追跡し、麻酔から回復する。尻尾を持ち上げたりつまんだりして、完全な回復を保証します。
2. 人工呼吸器から接続を一時的に取り外し、胸部の正常な動きを調べることにより、ラットの自己調節呼吸を確保します。
3. 人工呼吸器の電源を切り、気管内カニューレを取り外します。手足に固定されている粘着テープをはがします。
4. トラマドール (12.5 mg/kg) を腹腔内経路で注射し、術後の痛みを和らげます。
5. ラットを加熱パッドの上に置いて、体温を37°Cに少なくとも30分間保ちます。不規則な呼吸や困難などの病的状態、または梗塞の危険な兆候がないかラットを継続的に監視します。
6. ラットが自由に動き回れるようになったら、麻酔から完全に回復した状態にあると考えてください。ラットは自発的に動くことができなくても、人工呼吸器から取り外してから45分以内にケージに入れてください。
7. 最初の4日間は毎日ラットを観察します。4日目に、CO₂ 安楽死室を使用してラットを犠牲にします。

7. 心筋梗塞の生化学的マーカーの解析

1. 動物の血液サンプルで、手術後 6 時間および 4 日で心筋梗塞のバイオマーカーとしてトロポニン レベルを評価します。
   1. サンプルの収集と準備: EDTA コーティングまたはヘパリンコーティングされたチューブで梗塞の 6 時間後に尾静脈から血液サンプル (200 μL) を採取し、心筋梗塞の 4 日後に眼窩後穿刺 (1 mL) によって採取します。
      注:トロポニンT検査には、抗凝固全血サンプルが好ましい。
   2. キットに付属の心臓ピペットと使い捨て投与シリンジを使用して、150 μLのサンプルをテストストリップに適用します。
   3. 室温で15〜20分間インキュベートし、15〜20分以内に検出ゾーンにシグナルライン(赤みがかったライン)が現れることに基づいて結果を解釈します。次のパラメータを使用します: 検出線なし、制御線のみ = 陰性。可視検出ラインとコントロールライン=陽性(図6B)。
2. 標準F分析装置を使用して、血清サンプル中のトロポニンIを検出します。
   1. サンプルの収集と準備:EDTAコーティングまたはヘパリンコーティングチューブで梗塞の6時間後に尾静脈から血液サンプル(200 μL)を収集し、心筋梗塞の4日後に眼窩後穿刺(1 mL)によって収集します。
   2. 検査前にキットと血液サンプルを室温に置いてください。ホイルポーチの裏面に記載されている賞味期限を確認してください。ホイルパウチを開けて、テストデバイスを確認します(図4)。
   3. アナライザーのテストスロットにテストデバイスを挿入します。アナライザはバーコードデータを読み取り、テストデバイスが有効であることを確認します(図4)。
   4. 固定容量スポイト(100 μL)で100 μLのサンプルを収集します。採取したサンプルを抽出バッファーチューブに分注します。次に、使用済みの固定容量スポイト(100 μL)を廃棄します。
   5. サンプルとバッファーを使い捨てスポイト(100 μL)で2x〜3x混合します。次に、100 μLのサンプル混合物を収集します。
   6. サンプルを試験装置のサンプルウェルに塗布した後、すぐに分析装置の TEST START ボタンを押します。アナライザーは10分以内にテスト結果を自動的に表示します。
      注:トロポニンI(TnI)が存在する場合、それはユウロピウム微粒子に結合します。この複合体はテストライン上の捕捉抗体によって捕捉され、蛍光の強度は分析装置によって検出されます。

8.梗塞部位の分析

1. ラットを4日後に犠牲にした後、2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロリウム塩化物(TTC)色素の巨視的法を用いて梗塞の面積を決定する。
   1. 動物の体から心臓を取り出し、4°Cで一晩保持します。 耳介、大動脈の根元、右心室の両方を切除します。凍結した左心室を外科用ブレードを使用して厚さ2〜4mmのスライスに切断します。心室スライスを37°Cで1%TTC溶液(pH 7.8に維持された0.1 M Trisバッファーを使用して調製)で20分間インキュベートします。
   2. デヒドロゲナーゼ酵素と補因子NADHを含む生存心筋は、ホルマザンの形成によりTTCでレンガ色に染色され、梗塞を起こした心筋領域は染色されていないままであるため、染色パターンを分析します。
2. 体積法で梗塞部位を決定します。
   1. 2つのスライドガラスの間に心室スライスを置き、その上に1cmの100個の正方形を配置した透明なプラスチックグリッドを置きます。
   2. 両側の正方形の数を数えて、各心室スライスの平均面積を計算します。同様に、両側の汚れた領域と汚れていない領域に落ちる正方形の数を計算します。染色されていないくすんだ黄色の領域は梗塞部分を表し、赤い領域は生存可能な部分を表します。
   3. 梗塞サイズは、左心室総容積 (%LVV) に対するパーセンテージとして表します。

9.病理組織学的分析

1. ヘマトキシリンとエオシンの染色
   1. 組織病理学的所見については、LADライゲーションの4日後に動物を犠牲にし、心臓を除去し、リン酸緩衝液(PBS、pH 7.4)で洗浄し、直ちにホルマリン溶液(10%)で保存します。
   2. 一連のアルコール濃度(70%、80%、95%、95%および無水アルコール)の増加で組織を1時間脱水することにより、組織処理を実行し、組織から水分が除去され、アルコールが組織内に入ります。キシレンに浸漬して組織からアルコールを除去します。
   3. 透明化後、鉗子を使用して組織をステンレス鋼の型で溶融パラフィンワックスに移します。透明剤が拡散し、溶融ワックスが組織に浸透します。コールドプレートの上で型を冷やしてパラフィンを固めます。ワックスが完全に冷却されて硬化したら(30分)、パラフィンブロックを型から簡単に取り出します。
   4. ミクロトームを使用して、埋め込まれた組織を含むパラフィンブロックを厚さ4μmの切片に切断します。パラフィン切片のリボンを40〜45°Cの水浴に入れます。セクションをスライドに取り付け、スライドを自然乾燥または穏やかに温めます。次に、切片をキシレンで洗浄し、無水アルコールと水で再水和することにより、切片を脱パラフィンします。
   5. ヘマトキシリンで15分間染色します。染色された切片を水で洗浄し、1%酸性アルコール混合物で20秒間処理します。
   6. 水で洗浄した後、対比染色(エオシンの1%水溶液)で切片を2分間染色します。スライドを顕微鏡で観察し、10倍および40倍の倍率で組織病理学的変化を視覚化します。
2. マッソントリクロ染色
   1. 以下の試薬を準備します。
      1. ブアンの溶液:75 mLの飽和ピクリン酸、25 mLの40%ホルムアルデヒド、および5 mLの氷酢酸を加えます。ワイガートの鉄ヘマトキシリン溶液:95%アルコール100 mLにヘマトキシリン1 gを含むストック溶液Aを調製します。29%塩化第二鉄を4mLの水、1mLの濃塩酸、95mLの蒸留水に含むストック溶液Bを調製します。原液AとBを同量加えて使用します。混合物は3か月以内しか安定しません。
      2. ビーブリッヒ緋色酸フシン溶液:90 mLの1%ビーブリッヒスカーレット水溶液、10 mLの1%酸フシン水溶液、および1 mLの氷酢酸を加えます。リンモリブ酸-リンタングスチン酸溶液:25 mLの5%ホスホモリブ酸と25 mLの5%リンタングステン酸を加えます。アニリンブルー溶液:2.5 gのアニリンブルーと2 mLの氷酢酸を100 mLの蒸留水に加えます。1%氷酢酸溶液。
   2. キシレンを使用してパラフィン包埋心臓切片を脱パラフィンし、続いて異なる濃度のアルコールで再水和します。
   3. 心臓切片をブアン溶液とともに56°Cで30分間インキュベートし、最終的な色の強度を高めます。黄色が取れるまで、流水道水ですすいでセクションをすすぎます。
   4. ヘマトキシリンで組織を1分間染色し、次に流水道水で2〜3分間洗浄します。切片をビーブリッヒ緋色酸フクシン溶液で15分間染色します。
   5. 5%リンモリブ酸-リン酸で5〜8分間分化します。セクションを直接(すすぎずに)アニリンブルー溶液に6〜8分間移します。
   6. 蒸留水で洗います。次に、1%酢酸溶液で分化します。95%エタノールで脱水し、キシレンで透明にし、スライドに取り付け、顕微鏡で調べます¹²。

結果

気管内挿管は、ラットの開胸胸部手術を含む LAD 結紮手順中の換気を補助するために必要です。挿管の成功は、手術前の基礎呼吸パラメータと、外科手術中の安定した呼吸、一回換気量、および分心量の維持によって確認されます (図 5)。

LAD 結紮手順の成功は、心筋損傷の生化学的マーカーとして心筋トロポニン T とトロポニン I を評価し¹³、梗塞サイズを測定し、組織病理学的変化を観察することによって確認されました。心筋トロポニン (cTn) タンパク質はアクチン フィラメントと相互作用し、心筋の収縮と弛緩を調節します。心臓に存在するトロポニンの2つのアイソタイプ、すなわちトロポニンI(cTnI)とトロポニンT(cTnT)は、心筋細胞の損傷後に血中に放出されます¹³。トロポニン T (cTnT) レベルは、TropT 定性キットを使用して検出されます。テストストリップには、2つのモノクローナル抗体が含まれており、1つは金標識抗体、もう1...

ディスカッション

本研究は、ラットにおける左前下行冠動脈(LAD)の永久閉鎖による心筋梗塞の誘発を表しています。この手術プロトコルでは、腹腔内経路で投与された麻酔薬ケタミン 80 mg/kg とキシラジン 12 mg/kg の腹腔内投与により、十分な筋弛緩が得られ、それによって外科手術全体が効果的に促進され、副作用を最小限に抑えながら短期間のスムーズな術後回復が促進されました。ケタミン 80 mg/kg およびキシラジン 10 mg/kg の投与など、さまざまな用量のケタミンおよびキシラジンでの同様の麻酔プロトコルが以前の研究で確立されており、これはラットにおける心筋梗塞の誘発のための手術を行うのに望ましい十分な麻酔と心筋梗塞後の高い生存率をもたらしました^15,16。気管内カニューレの挿管は、懐中電灯の下で耳鏡を使用して声帯を視覚化することにより、傾斜した手術台の仰臥位でラットを加熱パッドの上に置くことによって成功しました。以前の研究では、Kastl et al. 動物を...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
18ゲージ静脈内カニューレ	ケント・サイエンティフィック、米国
20ゲージ静脈内カニューレ	ケント・サイエンティフィック、米国
4-0 ポリプロピレン縫合糸	カンナ外科手術
6-0シルク縫合糸	ナナク外科手術
8-0シルク縫合糸	ナナク外科手術
アドソン鉗子	ナナク外科手術
麻酔装置	オーキッドサイエンティフィック
麻酔導入チャンバー	オーキッドサイエンティフィック
湾曲したはさみ	ナナク外科手術
気管内挿管チューブ	ケント・サイエンティフィック、米国
脱毛クリーム	ナナク外科手術
加熱パッド	ケント・サイエンティフィック、米国
フック付き鉗子	ナナク外科手術
ケタミン			アムリトサルのKVASからのギフトサンプル
マイクロニードルホルダー	ナナク外科手術
ニトリル手袋	ナナク外科手術
操作テーブル
耳鏡	ナナク外科手術
ピーン鉗子	ナナク外科手術
リブリトラクター	ナナク外科手術
ストレートピンセット	ナナク外科手術
海峡ニッパー	ナナク外科手術
手術用ヘアキャップ	ナナク外科手術
サージカルマスク	ナナク外科手術
手術用実体顕微鏡	オリンパスマグナス	24B1187	ステレオズーム MSZ-TR顕微鏡 アームブームスタンド付き、ズーム比:1:7 対物レンズズーム:0.65 - 4.5倍 接眼レンズ10倍/22mm 倍率:6.5 - 45倍、10倍接眼レンズ付きLEDリング照明
歯のない鉗子	ナナク外科手術
トラマドール			ASRのアマンディープ病院からのギフトサンプル
ピンセット	ナナク外科手術
人工呼吸器	RoVent (ケント サイエンティフィック、 米国)	RV-04-220	容量と圧力の制御、温度の加温と監視を備えた自動人工呼吸器
キシラジン			アムリトサルのKVASからのギフトサンプル