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方法論記事

失われた割合の評価:水生システムにおけるマイクロプラスチック(1〜300μm)の多様性、存在量、および質量

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DOI:

10.3791/68148

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2025年8月22日

 ,  , 
1School of Marine and Atmospheric Science, Stony Brook University

この記事について

サマリー

このプロトコルは、ミクロンサイズ(1〜300μm)のMPを検出、同定、および定量するために、フィルターで収集された水生サンプルに適用する方法論を説明しています。ラマン顕微分光法は、MP粒子の高分子化学構造を同定し、水サンプル中の粒子の数とその質量の観点からそれらの存在量を定量化できます。

要約

ここで提示するプロトコルは、直径~1 μmのマイクロプラスチック(MP)の定量化、ポリマータイプの正確な同定、および粒子体積の推定を可能にし、MP質量の計算を決定的に可能にします。ニューヨーク州グレートサウスベイ(GSB)で収集されたサンプルの代表的な結果は、1〜6μm相当の球径(ESD)範囲内の粒子が最も豊富で、粒子の約75%が5μm未満であることを示しました。特に、ふるい分け前のステップでは60μmを超える粒子が得られず、サンプリングされた沿岸サイトでは大きなMPがまれであったことが示唆されました。ろ過の前に、化学酸化ステップを使用して有機破片を除去し、個別のボトルで収集したサンプルからより大きな量の水(>1 L)のろ過を容易にし、フィルターの目詰まりを減らしました。このアプローチによりろ過効率が大幅に向上しましたが、サンプル前処理とデータ分析に必要な合計時間を短縮するために、方法論の側面を改良する必要があります。ラマン顕微分光法と関連するデータ処理は、特に複雑な環境マトリックス中の10μm未満の粒子を正確に分析するために、依然として時間がかかります。継続的な取り組みは、分析の不確実性を最小限に抑え、粒子計数精度と処理時間の間のトレードオフを最適化し、検出ワークフローのアーティファクトを減らすことに重点が置かれています。

概要

マイクロプラスチック (MP) は、サイズ、形状、色、密度、化学組成、その他の物理的特性が大きく異なる非常に不均一な粒子グループであり、その識別と定量化が特に困難です1。MP調査では、光学顕微鏡2 などの視覚技術から、熱分解ガスクロマトグラフィー3などのより高度な化学的アプローチまで、さまざまな分析方法が採用されています。光学顕微鏡は、そのシンプルさ、速度、費用対効果の高さから、より大きなMP(通常0.5〜5 mm)を特徴付けるために一般的に使用される方法です1。プラスチックのような粒子の視覚的な識別と定量化を可能にし、表面の形態と構造に関する情報を提供します2。ただし、この手法では化学組成に関する化学情報が得られず、分析者の専門知識に依存します。誤識別は、視覚分析の十分に文書化された制限であり、特に小さくて透明な粒子の場合、エラー率は 20% から 70% の範囲で報告されています。このような誤差は、環境サンプル中のMP濃度を大幅に過大評価する可能性があります4。

一方、熱分解ガスクロマトグラフィー(GC)と質量分析(MS)を組み合わせることで、熱分解生成物を分析することでMPの化学組成に関する詳細な情報を得ることができます3。熱脱着ステップと組み合わせると、同じ分析中にプラスチック添加剤も検出できます5。ただし、この方法では、プラスチック様粒子を手動で事前に選択し、熱分解システムに慎重に配置する必要があるため、サンプルのスループットが低くなります1。

従来の方法の限界を克服するために、MPの同定と定量化の両方を可能にする自動化技術がますます不可欠になってきています。ラマンおよびフーリエ変換赤外(FTIR)分光法は、独自のスペクトルフィンガープリント6,7,8を通じて正確なポリマー同定を提供します。これらの振動分光法は、光、ラマン用レーザー、FTIR用赤外線によって誘発される分子振動を検出し、特定の分子構造を反射するスペクトルを生成します7。どちらの技術も、さまざまな環境マトリックス中の小さなMP粒子(<300μm)の検出と特性評価を大幅に進歩させました8。プラスチックのような粒子を化学的に確認することで偽陽性を減らし、偽陰性を最小限に抑え、非破壊的です。顕微鏡(顕微分光法)と組み合わせると、これらの技術により、0.3 mm未満の高分子粒子の同定と定量が可能になります(μFTIRは~10 μmまで、μRamanは~0.3 μmまで検出します)8。ただし、ラマンは特定のポリマー(ポリスチレンなど)に対してより高い空間分解能と強化された検出を提供しますが、蛍光干渉の影響を受けやすく、通常、より長い取得時間を必要とします。それにもかかわらず、ラマン顕微分光法は0.3μm未満の粒子を検出でき、FTIRイメージング8,9よりも広いマイクロプラスチックサイズ範囲をカバーします。

ここで説明する作業の主なツールは、SoMASのNAno-Raman Molecular Imaging Laboratory(NARMIL)内で利用可能な共焦点ラマンマイクロ分光光度計です。このプロトコルは、プランクトンまたはマンタネットを使用して海洋プラスチックをサンプリングする場合に通常除外される水サンプルからのフィルター上のマイクロサイズのMP(<300μm)を検出、識別、および定量するように最適化されています。また、非プラスチック残留物(有機破片)の存在を減らすために、化学酸化プロセスが必要です。これにより、ラマン顕微分光分析前の分析干渉が最小限に抑えられ、重要なことに、フィルターの細孔の目詰まりが防止され、大量の水をろ過できます。この技術により、水サンプルからフィルターに採取されたサブミクロンからミリメートルサイズの割合のMP粒子を検出することができ、特定のMP濃度、粒子サイズ、質量の計算が可能になります。

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プロトコル

このプロトコルは、元のバージョン9 から変更されました。このプロトコルは、水生サンプル(飲料水、河川、湖沼、沿岸、または外洋)を分析して、フィルター上のMP(<300 μm)を抽出、検出、定量するためのガイダンスです。使用する試薬と機器は 、材料表に記載されています。

1. 品質管理

  1. 使用前に、すべての試薬を0.22 μmのメンブレンフィルターでろ過してください。
  2. 担当者が綿の白衣(合成素材は使用しない)を着用し、サンプルの取り扱い前と取り扱いの合間に手を洗ってください。
  3. ろ過の前とろ過の間に、ろ過装置をろ過前およびろ過の間に0.22 μmろ過した蒸留水ですすいでください。使用しないときは清潔なアルミホイルで覆ってください。
  4. フィールドブランク:すすぎたサンプルボトルに0.22 μmのろ過された蒸留水を入れ、環境サンプルのように処理します。
  5. 実験室用ブランク:1 Lの0.22 μmろ過蒸留水を、各サンプルバッチと一緒にAl2O3 フィルターで処理します。

2. MP定量のための天然水サンプルの収集と調製

  1. 汚染を最小限に抑えるために、すべてのサンプルボトル(Niskinおよびガラス容器を含む)を0.22 μmのろ過蒸留水で事前にすすぎます。
  2. 水生システムからのディスクリート水柱サンプル(>1 L)は、ガラス瓶(地表水)やロゼットに取り付けられたポリ塩化ビニル(PVC)ニスキンボトル(水柱)などの標準的なサンプリング方法を使用して収集し、ガラス瓶に直接移すことができます。
  3. 200 μmおよび60 μmの金属ふるいを使用して集水した水をプレフィルターし、有機破片を除去し、MPをサイズ画分に分離しました。
    注:保持された粒子は、顕微鏡下で直接識別できます。
  4. 60μmの金属ふるいを通過した水をガラス瓶に保管します。その後、この画分を酸化アルミニウム(Al2O3)メンブレンフィルター(直径25 mm、孔径0.2 μm)にろ過します。

3. 水サンプルの化学酸化

注:豊富な生体粒子からの分析干渉を最小限に抑えるために、サンプルはラマン顕微分光分析の前に化学酸化によって洗浄されます。

  1. 100 mLの30%(v/v)過酸化水素と1 Lのサンプルをガラス容器に入れて混ぜ合わせ、よく混合します。
    注意:H2O2 は慎重に取り扱ってください-強力な酸化剤は、皮膚や目に炎症を引き起こす可能性があります。手袋とゴーグルを着用し、ラボの安全手順に従ってください。
  2. 容器を蓋またはアルミホイルで覆い、60°Cのオーブンに~10時間入れます。
  3. サンプルを10分間冷ましてから、温かいうちにろ過に進みます。

4. 水サンプルのろ過

注意: フィルターには固有の脆性があるため、膜に接着された環状ポリプロピレンリングのみでフィルターを扱い、取り付けおよび取り外し中にAl2O3 メンブレンフィルターを曲げないように注意する必要があります。

  1. 層流フードでは、焼結ガラスベースと金属クランプを備えた全ガラスろ過システムを使用して、1 Lのサンプルとブランクをろ過します。
  2. ろ過後、フィルターを0.22μmろ過した蒸留水ですすいでください。
  3. ラマン分析用のカバーガラスなしで顕微鏡スライドにフィルターを取り付けます。

5. ろ過されたMP粒子のラマン顕微分光分析

注:共焦点ラマンマイクロ分光光度計とそのソフトウェアは、MP粒子を同定および定量するための分析方法として使用されます。この装置は、修正された正立落射蛍光顕微鏡、全寸法で0.1 μmのステップサイズを持つコンピュータ制御の電動x-y-zステージ、4つのレーザーライン(457/514 nm Ar+イオンレーザー、633 nm He/Neレーザー、785 nmダイオードレーザー)、および1,040 × 256ペルチェ冷却CCD検出器で構成されています。

  1. ラマンソフトウェアの画像取得機能を使用して、水生サンプルのMPs分析用の装置構成を設定します。
    1. レーザー:~9.3 mWのレーザー出力で633 nm He/Ne(50×対物レンズ経由 )。
    2. グレーチング:1200ライン/ mm。
    3. スペクトル範囲:200-2500 cm-1。
    4. 露光時間:0.7秒/スペクトル。
  2. x次元とy次元で1μmごとにスペクトルを取得することにより、関心領域(ROI)内にグリッドを設定します。
  3. 各ROIをカメラ画像(10,000 μm2)の100 μm x 100 μmグリッドとして定義します。
    注: ROI 領域は変更できます。たとえば、領域が小さいほど、解析の合計時間が短縮されます。
  4. クロスパターンモデルを使用してランダムに選択されたフィルターごとに~40のROIを解析し、露出したフィルター領域全体にわたるMP空間分布を表します。
  5. 自動データ収集後、ソフトウェアの画像取得機能を使用して、各ROIの詳細な2Dケミカルマップを作成します。
  6. 各化学マップから、ソフトウェアの機能に従って成分分析(非負の最小二乗相関法)を使用してMP粒子を識別および定量します。
  7. スペクトルと参照ライブラリを比較します。スコア >60 (内部ライブラリ スコア 0-100) の一致を確認済みの MP として受け入れます10。

6. MP粒子のフィルターベースの定量的列挙

  1. ~40 ROIの粒子数を合計した後、式111に従って、サンプル1リットルあたりのMP粒子数(N)を計算します。
    figure-protocol-1(1)
    ここで、 Af は総露出フィルター面積(mm2)、 n は検査されたすべてのROIで合計されたMP粒子の総数、 b は検査されたROIの数、 M は1つのROIの面積サイズ(mm2)、 V はサンプルからろ過された水の体積(l)。
  2. サンプルごとにカウントされたすべてのROIから標準誤差を計算することにより、各サンプルの粒子の総数(N)の分析上の不確かさを確立します。
  3. Lあたりの粒子の総数をN±1S.E.として報告します。

7. 粒子サイズ、体積、質量の計算

注:画像解析ソフトウェアを使用して、各粒子の寸法、面積、および等価球径(ESD)を決定します。

  1. 各パーティクル画像に割り当てられたプラスチックポジティブピクセルの合計をカウントして、面積を決定します。
  2. この粒子面積(Ap)を使用して、式211を適用してESDを計算します。
    figure-protocol-2(2)
  3. 式312を使用して、各粒子の理想化された楕円体体積推定値を計算します。
    figure-protocol-3(3)
  4. 体積推定値と各プラスチックポリマーの公表された比密度(ρ;g cm3)(つまり、M = ρV)を使用して、MPプール内の各プラスチックポリマーの質量(M)を計算します。質量は通常、μg/L で報告されます
    注:各粒子の質量計算で伝播される不確かさ(質量相対誤差、RE = SD /平均)を推定するために、次の式13を適用して、体積アルゴリズムと平均密度の両方の解析的不確かさが考慮されます。
    figure-protocol-4(4)
    ここで、R.E. volは、線形回帰勾配(3次元および「2次元体積」)の相対誤差(勾配/勾配のSE)です9。RE den は、特定の粒子に含まれる各ポリマーについて報告された密度値の範囲における相対的な変動 (SE / 平均) です。

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結果

ここでは、最新バージョンの方法論を使用して得られた結果を示します。この方法は、元のアプリケーション9,14から変更されています。この記事で使用されているサンプルは、ニューヨーク州ロングアイランドの3つの主要な沿岸水域(グレートサウスベイ、ペコニック河口、シネコックベイ)のMP汚染を評価するプロジェクトの一部です。ここで提示された結果は、これらの水域の水質の体系的な評価ではなく、改良された方法の概念実証として機能します。2024年8月28日、米国ニューヨーク州グレートサウスベイ(GSB)にある2つの観測所から地表水が採取されました(図1)。各ステーションで、1.5 Lの地表水を小さな容器(~12 m)を使用して収集し、ガラス容器に移しました。サンプルは、ストーニーブルック大学海洋大気科学部(SoMAS-SBU)の研究室で処理および分析されました。

図2

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ディスカッション

この方法論により、フィルターに採取された水サンプルから 1 μm のマイクロプラスチック (MP) 粒子を定量化できるため、粒子の存在量、化学組成、サイズ、質量を詳細に測定できます。ただし、特に複雑な環境マトリックス中の 10 μm 未満の粒子を分析する場合には、このアプローチに固有の不確実性の原因を認識し、対処することが不可欠です。

マイクロプラスチック (MP) 研究における検出限界 (LOD) と定量限界 (LOQ) を決定するための標準化された手順が現在欠如していることは、対処すべき重要な側面です。バックグラウンド汚染の現場結果を調整するために、特に手順ブランク15、16、17、18、19

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開示事項

著者らは、この論文で報告された研究に影響を与えると思われる競合する経済的利益や個人的な関係が知られていないことを宣言します。

謝辞

著者らは、ラボとデータ分析の協力をしてくれたラリッサ・クライム、アンソニー・ヒル、アランナ・チェン、マヤ・ブトケビッチ、レスリー・メヒアに感謝しています。すべてのラマンスペクトルデータは、環境科学応用に特化したコミュニティリソースであり、NSF-MRI助成金OCE-1336724で設立されたSBUの海洋大気科学部のNAnoラマン分子イメージング研究所(NARMIL)で作成されました。研究は、ストーニーブルック大学 (SBU) のシード助成金と SBU 大統領論文完成フェローシップ CF21 によって部分的に支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アルミホイル あらゆる商用ブランド
分析用ステンレス鋼ふるいRetsch GmbH、ドイツDIN 4188
Anodiscフィルターワットマン
フィルターホルダーフィッシャーブランド-ミリポアシグマXX1012542
ガラスボトルフィッシャーブランド-ミリポアシグマ02-912-313サンプリングプロセスには、どのガラス容器でも機能します
ガラス製品漏斗フィッシャーブランド-ミリポアシグマXX1012514
過酸化ヒドロゲン 30 %科学の革新7722-84-1
inVia共焦点ラマンマイクロ分光光度計 レニショー
層流フードLabconcoまたは実験室での使用のためのその他の層流フード
金属製クランプフィッシャーブランド-ミリポアシグマXX1012503
金属鉗子フィッシャーブランド-ミリポアシグマ13-820-061
顕微鏡スライドサーモフィッシャーhttps://www.thermofisher.com/
ニトリル手袋キムテック55080-54
ニトロセルロースメンブレンフリッター 0.22GVSフィルター技術 1214898
ラジアルヒートオーブンラボライン機器 3609
真空ポンプウェルチ25468-01 A
ワイヤー5.2レニショー

参考文献

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