Penium margaritaceumの実験的スクリーニングプロトコル、免疫細胞化学および顕微鏡ベースのイメージング技術

Summary

本報告では、単細胞連鎖球菌藻類 Penium margaritaceumの培養と実験的操作に用いた基本的な方法について述べる。また、モノクローナル抗体やその他の蛍光プローブによる生細胞の標識や走査型電子顕微鏡など、顕微鏡ベースのイメージングの基本的なプロトコルも提供します。

Abstract

細胞壁は、発生中および環境非生物的および生物的ストレッサーに応答する際の植物細胞のシグナル受信/伝達の最初の構成要素です。細胞は、細胞壁の完全性を常に監視し、ストレスに応じて細胞壁を調節します。細胞壁で起こる特異的な構造的および生化学的調節を解明することは、特に多細胞植物とその器官/組織を使用する場合には困難な作業です。これは、複雑な多細胞ネットワークの一部である個々の細胞で解決できるものに関する制限によるものです。単細胞連鎖球菌藻類である Penium margaritaceumは、最近、ペクチンの動態、細胞壁に基づく表現型の可塑性、および藻類細胞生物学の複数の側面の研究に使用されています。その単純な表現型、陸上の植物細胞壁と特に類似した多くの成分を持つ明確な細胞壁、および免疫細胞化学的および実験的研究の容易さにより、植物細胞壁生物学における強力なモデル生物となっています。この研究の目標は、培養、実験的操作、および適用ストレッサーのスクリーニングのための基本的な技術を提供することです。免疫細胞化学、共焦点レーザー走査型顕微鏡イメージング、および細胞壁構造の走査型電子顕微鏡イメージングのためのスクリーニングプロトコル。同様に、記載されている技術の多くは、他の広範な細胞および分子研究のために変更され得る。

Introduction

植物の細胞壁は、植物細胞¹の生涯において複数の役割を果たす複雑な高分子ネットワークです。細胞壁の完全性は、発生中および環境ストレスに応答して細胞によって常に監視され、それに応じて化学的および構造的に調節されます。 Penium margaritaceum は、最近、Streptophyte藻類(Streptophyta、陸上植物に最も密接に関連し、祖先である緑藻類のグループ⁾の研究に使用されている単細胞緑藻です2。

過去20年間、P. margaritaceumは、細胞壁と細胞外マトリックスのダイナミクス、膜内システムの活動、細胞形状の発現、および植物の進化の研究において重要な生物でした3,4,5,6,7,8,9,10,11

Protocol

注: Penium margaritaceum は、 Sammlung von Algenkulturen der Universität Göttingen - Culture Collection of Algae at Göttingen University, SAGで取得されています。株#2640。

1. 文化の維持

1. 藻類を液体のウッズホール培地(WH¹²)に維持し、土壌水抽出物(つまり、培地1リットルあたり40 mL)を補給することもできます。16 h:8 h light:3.5 klux (74 μmol photons/m²/s) の冷白色蛍光灯による暗サイクルで、培養物を 20-25 °C に維持します。
2. 継代培養を毎週準備し、10〜14日齢の細胞培養物を使用します。 ペニウム 培養は6ヶ月間生存可能であり、この期間中に継代培養を開始するために使用できます。藻類は、1%-2%の寒天固化WHMでも成長します。
3. 定期的な細胞周期の同期のために、10〜14日齢の培養細胞を20〜25°Cで2〜6週間暗所に置きます。 この時間の後、新鮮なWHM(下記参照)で細胞を洗浄し、上記のよう....

Results

P. margaritaceumの細胞壁を抗ペクチンモノクローナル抗体(JIM5など)で標識すると、カルシウム錯体繊維のネットワークと、規則的なパターンまたは格子を形成する突起が明らかになります(図1)。ペクチンは細胞中心または峡部に沈着し、そこで古いペクチンを極に向かって移動させます(図2)。異なるペクチン抗体様JIM7で標識すると、峡部の狭いバンドにおける高メチルエステル化ペクチンの初期分泌が強調されます(図3A、B)。細胞壁に位置する他のポリマーには、mAbで標識されたアラビノガラクタンタンパク質、JIM13が含まれます(図4)。大量のEPSが細胞壁の外部から分泌され(図5)、滑走と細胞凝集体の形成が可能になります。これらの標識技術のいくつかは、細胞壁の定量的検査や細胞増殖などの発生研.......

Discussion

P. margaritaceumは、植物や連鎖球菌藻類の細胞壁発生とECM分泌の動態を解明するのに有効な生物です。主な特性には、単細胞の習慣と培養維持および実験的操作の容易さ、明確な外側のペクチン格子と他のポリマーを持つ初代細胞壁、その後の発生および/または実験的研究に間に合うように追跡できる細胞壁指向性mAbによる生細胞標識の容易さ、蛍光ビーズ1を使用してリアルタイムでモニターできる大量のEPSの産生が含まれます^。2、3、6。さらに、ほとんどのラベリング手法は、定量的測定のための簡単な手段を提供します。

P. maragaritaceum は、ここで説明するプロトコルに対するいくつかの控えめな変更に対応できる堅牢な生物です。.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mLマイクロセント。チューブ	Fisher Scientific	01-549-740
12ウェルマイクロプレート	Fisher Scientific	50-233-6077
22 x 22 mm カバーガラス	Fisher Scientific	12-541-016
45 x 50 cm カバーガラス	Brain Research	4550-1.5D
寒天	シグマ アルドリッチ	A9414
抗ラット FITC	シグマ アルドリッチ	F6258
抗ラット TRITC	シグマ アルドリッチ	T4280
塩化カルシウム	シグマ アルドリッチ	C4981
カンブリッジ スタブ	EMS	75183-65
フルオビュー CLSM	エビデント	フルオビュー 1200
JIM5	ケラファスト	ELD004
JIM7	ケラファスト	ELD005
マイクロ遠心分離機	Fisher Scientific	13-100-675
マイクロピペータ	BioRad	1660499EDU
Penium margaritaceum	Sammlung von Algenkulturen der Universität Göttingen - Göの藻類の文化コレクション。ティンゲン大学	2640
ポリスフィアキット	Polysciences	18336
SEM	ThermoFisher	Quattro SEM
スパッタコーター	EMS	Q150V
ボルテックスミキサー	Fisher Scientific	02-215-414