Method Article

ヒトCD14+ 単球から寛容性樹状細胞を作製するための免疫調節剤を試験するための簡便で効率的な方法

DOI:

10.3791/68159

⸱

April 11th, 2025

 , 
1Chemical and Biological Engineering Department, Drexel University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

薬理学的薬剤がナイーブ単球由来樹状細胞からin vitro で寛容性樹状細胞を生成する能力を評価し、自家制御性T細胞生成によってその効力を検証する手順について説明します。

Abstract

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トレロゲン樹状細胞(tolDC)は、ナイーブT細胞を制御性T細胞(Treg)表現型に向けて影響を与えることが知られている樹状細胞(DC)のサブセットです。TolDCは、自己免疫の治療法として、また細胞療法として、また内因性DCからtolDCを誘導する方法として、現在研究が進められています。しかし、今日まで、ナイーブDCからtolDCを誘導する既知の薬剤の数は比較的少なく、 in vivo でTregを生成するそれらの効力、特に内因性DCからtolDCを誘導する治療法には一貫性がありません。これにより、耐性を生み出すための新規化合物を探索する機会が得られます。

ここでは、単球由来DC(moDC)上の新規免疫調節化合物を in vitro で試験し、その機能を検証して自家Tregを生成する方法について説明します。まず、PBMCを取得し、市販の磁気分離キットを使用してCD14+ 単球とCD3+ T細胞を分離します。次に、単球をmoDCに分化し、ラパマイシン、デキサメタゾン、IL-10、ビタミンD3などの確立された免疫調節剤で24時間処理し、プロトコルの検証として寛容性マーカーの変化をテストします。最後に、誘導されたtolDCを抗CD3/CD28刺激の存在下で自家T細胞と共培養し、Treg集団とT細胞増殖の変化を観察します。このプロトコルは、すでに分化しているDCをtolDCに向けて再プログラムするための新規免疫調節剤の有効性を評価するために使用されることを想定しています。

Introduction

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樹状細胞(DC)は、自然免疫と適応免疫の間の重要なメディエーターです。DCは、主に粘膜、皮膚、リンパ組織に存在する主要な抗原提示細胞(APC)1です。DCは外来タンパク質を取り込み、それらをナイーブT細胞に対して主要組織適合菌(MHC)タンパク質で処理して提示します。DCは、ヒトのヒト白血球抗原-DR(HLA-DR)などのMHCクラスIIタンパク質を特異的に発現します。抗原曝露時のDCの活性化状態は、下流のT細胞応答2にとって重要です。未成熟DCは、細菌壁成分であるリポ多糖(LPS)3など、病原体関連分子パターン(PAMP)と呼ばれる分子のクラスを認識するさまざまなパターン認識受容体(PRR)を発現します。PRR刺激を受けると、DCは成熟DCとなり、CD80、CD86、CD40などの重要なT細胞共刺激タンパク質をアップレギュレートし、腫瘍壊死因子α(TNFα)などの炎症誘発性サイトカインを分泌し、ナイーブT細胞の従来のエフェクターT細胞またはヘルパーT細胞への分化を促進します2。それどころか、DCの成熟が中断された場合、またはDCが寛容性の環境で発達した場合、DCは耐久性DC状態(tolDC)4を生成する可能性があります。Tol....

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Protocol

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すべてのヒト末梢血単核細胞(PBMC)サンプルは、ペンシルベニア大学のヒト免疫学コアから、患者の同意を得てペンシルベニア大学の治験審査委員会(IRB)からの事前承認を得て、匿名化されたドナーから取得されました。

オプション:この方法では、学術研究室から入手した新たに分離されたPBMCを使用しましたが、PBMCは全血または白血フェレーシスが豊富な血液製剤から分離できます。密度勾配遠心分離法は、他の場所で説明されているように、十分に確立され信頼性の高い方法であるため、使用することをお勧めします23。

1. 単球/T細胞の単離とmoDCの分化

  1. PBMCからの単球とT細胞の単離-1日目
    1. 健康なドナーから2億個のヒトPBMCを入手します。細胞を15mLのチューブに入れ、氷上に移します。
    2. 50 mLの分離バッファー(市販の分離キットで提供)をコニカルチューブに入れて分注します。
      注:分離バッファーは、2%ウシ胎児血清(FBS)および1 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を含むDPBSに置き換えることもできます。
    3. PBMCチューブを氷から取り出し、分離バッフ....

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Results

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我々は、ヒトPBMCのプロトコルを記載し、市販の磁気分離キットを用いてCD3+ T細胞とCD14+ 単球の両方を単離し、単球をGM-CSFおよびIL-4を用いてCD14-、HLA-DR+、CD141+、CD1c+ moDCに分化させ、それらを24時間処理し、抗CD3/CD28刺激を伴う自家T細胞と72時間共培養した。実験的な概略図を 図1に示します。

単球/T細胞の単離とmoDCの分化
私たちの最初の代表的な結果として、2億個のヒトPBMCがペンシルベニア大学のヒト免疫学コア(HIC)から1人の健康なドナーから購入され、プロトコルセクション1および2で説明されているように処理されました。1日目に採血し、HIC施設で標準的なFicoll分画を用いて単離した。T細胞と単球の単離には1億個のPBMCを使用し、それぞれ1,000万個のT細胞と300万個の単球を収.......

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Discussion

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ここでは、免疫調節剤がmoDCからtolDCを誘導し、 その機能が生体内で自己生成T細胞からTregを生成する機能を検証するための、信頼性と汎用性の高い方法について説明します。このプロトコルには、いくつかの重要なステップがあります。まず、単球は感受性が高いことで知られており、最良の結果を得るには、以前に凍結されたPBMCではなく、新鮮なPBMCから取得する必要があります。単球はできるだけ早く単離し、分化カクテルに入れる必要があります。通常、最初の24時間での単球の収量の低さまたは単球の死亡率が高いのは、PBMCと単球の分離の間の凍結/融解サイクルまたは長期化によるものです。次に、moDCとT細胞培養培地の分化に使用されるサイトカインは、高品質の供給源からのものでなければなりません。通常、moDCの分化不良は、サイトカインの品質が低いか、濃度が正しくないことが原因です。第三に、T細胞は1日目から7日目まで凍結し、ナイーブで刺激されていない表現型を維持するために培養物に保持しないことをお勧めします。第四に、 図6<.......

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Disclosures

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著者には、開示すべき利益相反はありません。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ペンシルベニア大学のHuman Immunology Core(HIC)がドナーから新鮮なヒトPBMCを提供してくれたことに感謝します。HIC は、NIH P30 AI045008 および P30 CA016520 によって部分的にサポートされています。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.1-10 & マイクロ;L ろ過ピペットチップVWR76322-158一般細胞培養
1.5 mL 遠心分離管VWR77508-358一般細胞培養
10 mL 血清学的ピペットVWR414004-267一般細胞培養
100-1000 &L ろ過ピペットチップVWR76322-164一般細胞培養
15 mL コニカルチューブVWR77508-212一般細胞培養
20-200 &L フィルター付きピペットチップVWR76322-160一般細胞培養
2-メルカプトエタノールMP 生物医学194834T 細胞培養
50 mL コニカルチューブVWR21008-736一般細胞培養
60 x 15 mm ディッシュ、Nunclon DeltaThermo Fischer150326一般細胞培養
96 ウェル コニカル (V) 底板、未処理表面サーモフィッシャー277143一般細胞培養
96ウェル フラットボトムサーモフィッシャー161093一般細胞培養
APC/シアニン7 抗ヒトCD272 (BTLA) 抗体バイオレジェンド344518フローサイトメトリー
Attune NxT (赤/青レーザー、7チャンネル)サーモフィッシャーA24863フローサイトメトリー
BSAサーモフィッシャー15260-037一般セル培養
CD14 モノクローナル抗体 (61D3)、PEサーモフィッシャー12-0149-42フローサイトメトリー
CD1c モノクローナル抗体 (L161)、PE-シアニン7サーモフィッシャー25-0015-42フローサイトメトリー
CD209 (DC-SIGN) モノクローナル抗体 (eB-h209)、PerCP-シアニン5.5サーモフィッシャー45-2099-42フローサイトメトリー
CD25 モノクローナル抗体 (CD25-4E3)、APCサーモFischer17-0257-42フローサイトメトリー
CD274 (PD-L1、B7-H1) モノクローナル抗体 (MIH1)、PEThermo Fischer12-5983-42フローサイトメトリー
CD4 モノクローナル抗体 (RPA-T4)、Alexa Fluor 488Thermo Fischer53-0049-42フローサイトメトリー
CD40 モノクローナル抗体 (5C3)、APCThermo Fischer17-0409-42フローサイトメトリー
CD40 モノクローナル抗体(5C3)、APC-eFluor 780サーモフィッシャー47-0409-42フローサイトメトリー
CD69 モノクローナル抗体 (FN50)、PEサーモフィッシャーMA1-10276フローサイトメトリー
CD86 モノクローナル抗体 (BU63)、FITCサーモフィッシャーMHCD8601フローサイトメトリー
CD8a モノクローナル抗体 (RPA-T8)、PE-シアニン7サーモフィッシャー25-0088-42フローサイトメトリー
円錐底(Vウェル)96ウェルプレートッシャー2605サイトメトリー
低温バイアル、2 mLモフィッシャー430488T細胞培養
メチルスルホキシド(DMSO)、シーケンシンググレードッシャー20688細胞培養
DPBSサーモフィッシャー14200166一般細胞培養
EasySepヒト単球単離キットStem Cell Technologies19359細胞分離
EasySep ヒト T 細胞分離キットStem Cell Technologies17951細胞分離
EasySep MagnetStem Cell Technologies18000細胞分離
EDTAサーモフィッシャーAIM9260G一般細胞培養
ファルコン 丸底ポリスチレンチューブ、5 mL幹細胞技術38025細胞分離
Fc 受容体結合阻害剤 ポリクローナル抗体サーモフィッシャー14-9161-73フローサイトメトリー
ウシ胎児血清サーモフィッシャーA5670701一般細胞培養
固定可能な生存率色素 eFluor 780サーモフィッシャー65-0865-18フローサイトメトリー
Foxp3 / 転写因子染色バッファーセットサーモフィッシャー00-5523-00フローサイトメトリー
FOXP3 モノクローナル抗体 (PCH101)、PE-シアニン5.5サーモフィッシャー35-4776-42フローサイトメトリー
HBSSサーモフィッシャー14170-112一般細胞培養
不活化ウシ胎児血清サーモフィッシャーA5670801一般細胞培養
HEPES (1 M)サーモフィッシャー15630106moDC 細胞培養
HLA-DRモノクローナル抗体(L243)、Alexa Fluor 488Thermo FischerA51009フローサイトメトリー
ヒトCD3/CD28/CD2 T細胞活性化因子StemCell Technologies10970T細胞培養
トGM-CSF組換えタンパク質Thermo Fischer300-03moDC細胞培養
ヒトIL-10 ELISAキット、高感度サーモフィッシャーBMS215-2HSELISAの
ヒトIL-4、動物性フリー組換えタンパク質サーモフィッシャーAF-200-04moDC細胞培養
ヒトPBMC(新たに単離UPenn HICN/A細胞
ヒトTNFアルファELISAキットサーモ
光学顕微鏡(DMi1)Lucia391240細胞培養
ポポリサッカリド(LPS)Invivogentlrl-eblpsmoDC細胞培養LIVE
/DEAD固定可能な近赤外死細胞染色キットッシャーL34975サイトメ
トリーMEM非必須アミノ酸溶液(100x)サーモフィッシャー11140050T細胞培養
ニシリン-ストレプトマイシン(100x)サーモフィッシャー15140122一般細胞培養
ペットコントローラーVWR77575-370一般細胞培養ラ
パマイシン、98+%サーモフィッシャーJ62473。MFmoDC 細胞培養
RPMI 1640 グルタマックスサーモフィッシャー61870-036一般細胞培養
バッファー幹細胞技術20144細胞分離
T 細胞刺激カクテル (500x)サーモフィッシャー00-4970-93T 細胞培養
UltraComp eBead Plus 補償ビーズサーモフィッシャー01-3333-41フローサイトメトリー
可変ピペットセットFischer Scientific05-403-152一般細胞培養
プレート サーモフィフロー極サージサーモフィ一般 熱 ヒ)フィッシャーBMS223-4ELISA一般リサーモフィフローペピ付き 分離

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Banchereau, J., et al. Immunobiology of dendritic cells. Annu Rev Immunol. 18 (1), 767-811 (2000).
  2. Blander, J. M., Medzhitov, R. Toll-dependent selection of microbial antigens for presentation by dendritic cells. Nature. 440 (7085), 808-812 (2006).
  3. Anderson....

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