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方法論記事

ヒトCD14+ 単球から寛容性樹状細胞を作製するための免疫調節剤を試験するための簡便で効率的な方法

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DOI:

10.3791/68159

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2025年4月11日

 , 
1Chemical and Biological Engineering Department, Drexel University

この記事について

サマリー

薬理学的薬剤がナイーブ単球由来樹状細胞からin vitro で寛容性樹状細胞を生成する能力を評価し、自家制御性T細胞生成によってその効力を検証する手順について説明します。

要約

トレロゲン樹状細胞(tolDC)は、ナイーブT細胞を制御性T細胞(Treg)表現型に向けて影響を与えることが知られている樹状細胞(DC)のサブセットです。TolDCは、自己免疫の治療法として、また細胞療法として、また内因性DCからtolDCを誘導する方法として、現在研究が進められています。しかし、今日まで、ナイーブDCからtolDCを誘導する既知の薬剤の数は比較的少なく、 in vivo でTregを生成するそれらの効力、特に内因性DCからtolDCを誘導する治療法には一貫性がありません。これにより、耐性を生み出すための新規化合物を探索する機会が得られます。

ここでは、単球由来DC(moDC)上の新規免疫調節化合物を in vitro で試験し、その機能を検証して自家Tregを生成する方法について説明します。まず、PBMCを取得し、市販の磁気分離キットを使用してCD14+ 単球とCD3+ T細胞を分離します。次に、単球をmoDCに分化し、ラパマイシン、デキサメタゾン、IL-10、ビタミンD3などの確立された免疫調節剤で24時間処理し、プロトコルの検証として寛容性マーカーの変化をテストします。最後に、誘導されたtolDCを抗CD3/CD28刺激の存在下で自家T細胞と共培養し、Treg集団とT細胞増殖の変化を観察します。このプロトコルは、すでに分化しているDCをtolDCに向けて再プログラムするための新規免疫調節剤の有効性を評価するために使用されることを想定しています。

概要

樹状細胞(DC)は、自然免疫と適応免疫の間の重要なメディエーターです。DCは、主に粘膜、皮膚、リンパ組織に存在する主要な抗原提示細胞(APC)1です。DCは外来タンパク質を取り込み、それらをナイーブT細胞に対して主要組織適合菌(MHC)タンパク質で処理して提示します。DCは、ヒトのヒト白血球抗原-DR(HLA-DR)などのMHCクラスIIタンパク質を特異的に発現します。抗原曝露時のDCの活性化状態は、下流のT細胞応答2にとって重要です。未成熟DCは、細菌壁成分であるリポ多糖(LPS)3など、病原体関連分子パターン(PAMP)と呼ばれる分子のクラスを認識するさまざまなパターン認識受容体(PRR)を発現します。PRR刺激を受けると、DCは成熟DCとなり、CD80、CD86、CD40などの重要なT細胞共刺激タンパク質をアップレギュレートし、腫瘍壊死因子α(TNFα)などの炎症誘発性サイトカインを分泌し、ナイーブT細胞の従来のエフェクターT細胞またはヘルパーT細胞への分化を促進します2。それどころか、DCの成熟が中断された場合、またはDCが寛容性の環境で発達した場合、DCは耐久性DC状態(tolDC)4を生成する可能性があります。TolDCは、従来のT細胞共刺激受容体をダウンレギュレートし、代わりにプログラム細胞死リガンド1(PD-L1)やBリンパ球およびTリンパ球減衰因子(BTLA)などの耐性受容体をアップレギュレートし、インターロイキン10(IL-10)やトランスフォーミング成長因子ベータ(TGF-β)4などの抑制性サイトカインを生成します。これは許容範囲マーカーの包括的なリストではなく、実際、どのtolDCマーカーがtolDC状態5を定義するのに適しているかについてのコンセンサスは限られています。これを考慮して、さまざまなtolDC誘導剤の有効性を比較するために使用するべき機能マーカーとして、制御性T細胞(Treg)の生成を提案します。

tolDC/成熟DC活性化状態に加えて、DCは系統または組織の位置に基づいて分類することもでき、各サブセットはわずかに異なる機能を示します。tolDC/成熟DCの分裂はそれほど明確ではなく、連続体として存在しますが、系統の分裂はヒトとマウスの両方で明確に定義されたマーカーを持っています。DC前駆体は骨髄で形成されますが、DCにはその系統に基づいて、1)リンパ系に由来する形質細胞様樹状細胞(pDC)と、2)骨髄系に由来する従来の樹状細胞(cDC)の2つの主要なサブタイプがあります。ヒトでは、pDCはリンパ器官で成熟し、CD303を発現し、ウイルス感染に対して高い応答性を示します6。一方、cDCを発現するCD11cは末梢組織で成熟し、CD1c+ cDC1とCD141+ cDC2の2つの異なるサブタイプに存在し、それぞれが異なるT細胞応答を産生する7。さらに、すべてのcDCは、組織常在性(CD103-)または遊性(CD103+)の亜状態8のいずれかに存在することができる。最後に、特定の条件下で、単球系統からの細胞(CD14+)を樹状細胞の表現型に向けて誘導することができ、CD14−、CD141+、CD1c+ 9として同定される。単球由来DC(moDC)として知られるこれらの細胞は、単球がヒト末梢血単核細胞(PBMC)の約10〜30%を占めるのに対し、pDCはわずか10%を構成するため、ヒトの ex vivo 分析に最も一般的に使用されています10。これにより、moDCは魅力的な選択肢になりますが、moDCは一次組織から単離された典型的なcDCよりも炎症性が高いことも知られています9。

現在、臨床的耐性を生み出すためにtolDCを採用する取り組みには、大きく分けて2つのカテゴリーがあります。まず、tolDCは単球から生成され、細胞療法として使用されます。このパラダイムでは、moDCは通常、IL-4/GM-CSFと、ビタミンD3、ラパマイシン(ラパ)、IL-10、デキサメタゾン、またはこれらの11,12の組み合わせなどの免疫調節剤と併用して分化されます。これらのtolDCは、自己免疫および移植のための自家細胞療法として研究されてきた13。tolDCの他の用途は、遊離薬物またはナノキャリアを使用して内因性DCをtolDCに向けて再プログラムし、免疫調節剤および目的の抗原の両方を送達することである14,15,16。しかし、すでに分化したDCの誘導は、典型的にはtolDC代謝17,18とは対照的なDCの堅牢な代謝表現型の発達により、より困難である。これは、ほとんどの薬理学的免疫調節剤にとって高いハードルです。このため、ほとんどの内因性DCリプログラミング研究は、効果的なDC抑制としばしばいくつかのTreg誘導を報告していますが、多くの場合、T細胞の持続性の欠如により、臨床的成功を欠いています15,19,20。このことは、既存のDCから潜在的なtolDC誘導剤を特定する戦略の必要性を浮き彫りにしています。

ここでは、自家Treg誘導の最終指標を使用して、分化したmoDCに対する免疫調節剤の in vitro 評価方法を紹介します。このプロトコルは、免疫調節剤の有効性を評価するために設計されています すでに分化したヒトmoDCを耐性に向けて再プログラムします。さらに、このプロトコルは、同じPBMCサンプルから単離された自家T細胞に対してTregを生成するために、再プログラムされたtolDCの機能性を検証します。これは、分化中に耐性を誘導する、および/または同種ドナー21からのT細胞によるtolDCへの挑戦を行う他のプロトコルとは対照的である。このプロトコルでは、一般的な忍容剤であるラパを例として使用しますが、ラパ処理された moDC が Treg を生成するための限定的な有効性も示しています。代表的な結果では、IL-10、デキサメタゾン、ビタミンD3などの他の一般的な免疫調節治療の有効性も示しています。このプロトコルは、すでに確立されたmoDCに対して、より効果的な可能性のあるtolDC誘導剤をスクリーニングするために使用されることを想定しています22。

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プロトコル

すべてのヒト末梢血単核細胞(PBMC)サンプルは、ペンシルベニア大学のヒト免疫学コアから、患者の同意を得てペンシルベニア大学の治験審査委員会(IRB)からの事前承認を得て、匿名化されたドナーから取得されました。

オプション:この方法では、学術研究室から入手した新たに分離されたPBMCを使用しましたが、PBMCは全血または白血フェレーシスが豊富な血液製剤から分離できます。密度勾配遠心分離法は、他の場所で説明されているように、十分に確立され信頼性の高い方法であるため、使用することをお勧めします23。

1. 単球/T細胞の単離とmoDCの分化

  1. PBMCからの単球とT細胞の単離-1日目
    1. 健康なドナーから2億個のヒトPBMCを入手します。細胞を15mLのチューブに入れ、氷上に移します。
    2. 50 mLの分離バッファー(市販の分離キットで提供)をコニカルチューブに入れて分注します。
      注:分離バッファーは、2%ウシ胎児血清(FBS)および1 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を含むDPBSに置き換えることもできます。
    3. PBMCチューブを氷から取り出し、分離バッファーで満たします。300 x gで5分間遠心分離します。
    4. 10mLの血清ピペットを使用して上清を吸引します。血清ピペットを使用して、細胞ペレットを4 mLの推奨培地に再懸濁します。
    5. 懸濁液を2つの異なる15 mLチューブに分割し、チューブあたり2 mL(チューブあたり5 × 107 細胞/mL)を追加します。一方のチューブに「T」、もう一方に「単球」とラベルを付けます。
    6. Human Monocyte Isolation Kitを取り出し、製造元のプロトコルに従って、単球標識チューブから単球を分離します。
    7. ヒトT細胞単離キットを取り出し、2本目のチューブのメーカーのプロトコルに従ってT細胞を単離します。
  2. T細胞の分化と凍結のための単球のプレーティング-1日目
    1. 50 mLのmoDC Culture Medium(表1)を37°Cで少なくとも10分間予熱します。
    2. 濃縮単球を含む15 mLチューブとステップ1.1のT細胞を含む15 mLチューブを250 × g で5分間遠心分離します。
    3. 上清を吸引します。ピペッティングで上下させて、単球を1 mLのmoDC Culture MediumおよびT細胞培養培地(表1)に再懸濁します。ペレットが適切に分散していることを確認してください。
    4. 自動セルカウンターまたはTrypan Blue染色を使用した手動血球計算盤を使用して細胞をカウントします。
      注:代表的なデータとして、1000万個のT細胞と300万個の単球を単離した。
    5. 単球を入れたチューブを取り、9 mLの温かいmoDC Culture Mediumを懸濁液に加え、最終容量10 mLにします。次に、10 μg/mL の GM-CSF ストックと 10 μg/mL の IL-4 ストックをそれぞれ 100 μL 加えて、培地中の GM-CSF と IL-4 の両方を最終濃度 100 ng/mL にします。懸濁液をペトリ皿に移し、「moDC」とラベル付けし(1日目)、5%CO2で37°Cでインキュベートします。
    6. T細胞チューブを取り、1 mLのT細胞凍結培地(表1)と1 mLのT細胞懸濁液を混合します。2つの2 mLクライオバイアル(1 mL /バイアル)に分けます。しっかりと密封します(バイアルあたり500万個の細胞の最終濃度)。クライオバイアルを、未使用のウェルにバランスチューブを入れた凍結チャンバーに入れます。チャンバーを-80°Cで一晩保存し、クライオバイアルをクライオタンクに移します。
    7. 4日目に、5 mLの新鮮なmoDC Culture Mediumを加えて培地をリフレッシュし、GM-CSFおよびIL-4ストックをそれぞれ100 μL加えます。差別化されたmoDCは7日目に準備が整います。

2. 寛容性moDCを作製するための免疫調節薬の添加

  1. moDC プレートを設定します。
    1. 7日目に、インキュベーターから分化したmoDCを取り出し、moDC細胞懸濁液を50mLチューブに移します。
    2. 懸濁液を250 × g で5分間遠心分離します。上清を吸引し、ピペッティングで上下させて、細胞ペレットを1 mLの温かいmoDC培養培地に再懸濁します。血球計算盤で細胞をカウントし、100 ng/ml、GM-CSFおよびIL-4を含む温かいmoDC培地で細胞を3×105 細胞/mLの濃度に希釈します。
    3. 平底×96ウェル組織培養プレートで、100 μL中34 細胞/ウェルを希望のウェル数まで加えます。
      注:代表的な結果として、合計48のウェルを使用しました(セクション3と4の4つの異なる分析のために準備されたトリプリケートで行われた4つの条件)が、これは最大60ウェルまで調整できます。残りのすべてのウェルを100 μL/ウェルPBSで満たし、特に外側のウェルの乾燥を防ぎます。分析方法ごとに異なるプレートを用意することをお勧めします。
    4. 1 μL/ウェルの免疫調節薬を目的のウェルに加えます(ここでは10 ng/mLラパ)。プレートを5%CO2で37°Cで一晩インキュベートします。
      注:8日目に免疫刺激を含める場合は、免疫刺激の有無にかかわらず、免疫調節薬のウェルを準備します。.成熟したmoDCへの免疫刺激の使用はオプションです。
  2. T細胞を再解凍します。
    1. 8日目に、クライオタンクから2つのクライオバイアルを取り出し、内容物が溶け始めるまで(<3分で)37°Cのホットビーズバスまたはウォーターバスでクライオバイアルを解凍します。
    2. 内容物が溶け始めたら、バイアルを細胞培養フードに移し、1 mLの温かいT細胞培養培地をバイアルにピペットで移して急速に解凍します。バイアルの内容物全体を50mLチューブに移します。クライオバイアルを1 mLのT細胞培養培地ですすぎ、すべての細胞がチューブに移されたことを確認します。
    3. 懸濁液にフロー染色液(表1)を15 mLまで補充します。200 × g で10分間遠心分離し、上清を吸引します。次に、ペレットを5 mLのフロー染色溶液に再懸濁し、再度遠心分離します。
    4. 上清を吸引し、細胞を温かいT細胞培養培地1 mLに再懸濁します。血球計算盤を使用して細胞をカウントします。
      注:この段階での生存率は>70%である必要があります。死細胞が大量に残っている場合は、新しいチューブに移し、細胞染色液10 mLを加え、200 × g で5分間遠心分離し、T細胞培地1 mLに再懸濁して再計数します。
    5. 9 mLの温かいT細胞培養培地を加えて、最終容量を10 mLにします。懸濁液をペトリ皿に移します。「Rethawed T Cells」とラベル付けし、5% CO2 で 37 °C で一晩インキュベートし、細胞を休ませます。
  3. moDCプレートを洗浄し、必要に応じて免疫賦活剤を追加します。
    1. 8日目に、moDCプレート(7日目から)を300 × g で5分間遠心分離します。
    2. 上清を吸引し、温かいHBSSで洗浄し、遠心分離を繰り返し、再度吸引し、GM-CSFとIL-4(100 μL/well)を含む温かいmoDC培地に細胞を再懸濁します。
      注:セルを乱さないように注意してください。吸引中はプレートを傾けます。ウェル内には約10μLが残存します。
    3. 免疫刺激を使用する場合は、100倍ストックLPS(またはその他の免疫賦活剤)の1 μL/ウェルを目的のウェルに加えます。プレートを5%CO2で37°Cで一晩インキュベートします。

3. moDCのフロー解析(検証+許容誤差)

  1. moDCの検証のためのフロー解析
    1. 8日目に、表2に記載されているように、HLA-DR、CD14、樹状細胞特異的C型レクチン(DC-SIGN)、CD1c、およびCD40のマーカーを標的として、バリデーションパネル用の抗体カクテルを調製します。すべての抗体をフロー染色液で希釈します。
      注:このパネルは、7チャンネルの赤/青レーザーフローサイトメーター用に設計されました。
    2. インキュベーターからmoDCプレートを取り出します。プレートを300 × g で5分間遠心分離します。上清を取り除きます。 オプション:サイトカインIL-10およびTNFαのELISA分析のために、メーカーの指示に従って市販のキットを使用して上清を保持します。
    3. 200 μL/ウェルのフロー染色溶液を添加します。プレートを300 × g で5分間遠心分離します。
    4. 上清を吸引し、フロー染色溶液で1:200に希釈した50 μL/ウェルのFc受容体結合阻害剤抗体を添加して、非特異的結合をブロックします。室温(RT)で30分間インキュベートします。
    5. 調製した Validation Panel 抗体カクテルを50 μL/ウェル加えます。
    6. プレート内または1.5 mLチューブ内に、50 μLのコンペンセーションビーズと希釈した各抗体50 μLを混合して、コンペンセーションコントロールを調製します。プレートを4°Cで1時間インキュベートします。
      注:ここでは、moDC上のマーカーの発現が低い可能性があるため、補正のために細胞ではなく補正ビーズが使用されます。
    7. 300 × g で5分間遠心分離し、上清を取り除き、200 μLのフロー染色溶液に再懸濁して洗浄します。2回の洗浄を行います。
    8. 最終洗浄後、再度遠心分離し、細胞を110 μL/ウェルのフロー染色溶液に再懸濁します。これで、サンプルをフローサイトメトリー分析する準備が整いました。
  2. 寛容性moDC(トレランスパネル)の流動解析
    1. 8日目のステップ3.1と同様に、CD86、PD-L1、DC-SIGN、CD1c、BTLA、およびCD40のマーカーを標的とする Tolerance Panel用の抗体カクテルを調製します(表2)。
    2. 手順3.1.2-3.1.8を繰り返し、抗体カクテルを Tolerance Panel カクテルに置き換えます。

4. T細胞の流動解析

  1. T細胞を治療した寛容性moDCと組み合わせます。
    1. 9日目に、再解凍したT細胞ペトリ皿をインキュベーターから取り出し、すべてのT細胞を50mLチューブに移します。フロー染色液を補充します。
    2. オプション:T細胞増殖解析を行う場合は、T細胞を2つのチューブに分割します。
      1. 最初のチューブで、250 × g で5分間スピンダウンし、上清を取り除きます。このチューブを細胞増殖色素でメーカーの指示に従って染色します。
        注:Fixable Viability Dye eFluor 670を使用しましたが、これには30分のインキュベーションステップとその後の2回の洗浄ステップが必要です。細胞の損失を防ぐために50 mLのコニカルチューブを使用し、染色後の洗浄には10% HIFBSを含むHBSSを使用することをお勧めします。
      2. Treg分析には、未染色のT細胞を含む2番目のチューブを使用します。同様に、250 × g で5分間スピンダウンし、上清を除去し、温かい細胞培養培地に再懸濁し、染色プロセス中はインキュベーターに保持します。T細胞の増殖が不要な場合は、すべてのT細胞をスピンダウンし、温かいT細胞培養培地と交換します。
    3. 細胞を数え、少なくとも400万個(Treg解析のみの場合)または800万個(TregおよびT増殖解析の場合)を取得します。
    4. 残りのウェルとともにインキュベーターからmoDCプレートを取り出し、300 × g で5分間遠心分離し、上清を補呈します。200 μL/ウェルのT細胞を1.6 × 105 細胞/ウェルで添加します。Treg分析プレートには未染色T細胞を、T細胞増殖プレートには染色T細胞を添加します。
      注:これにより、最初の3 × 104 moDCは通常わずかに拡大するため、TセルとmoDCの比率は5:1に維持されます。
    5. 25 μL/mLの抗CD3/CD28抗体カクテルをネガティブコントロールウェルを除くすべてのグループに加えて、T細胞を刺激します。プレートを5%CO2 で37°Cで72時間インキュベートし、12日目までインキュベートします。
      注:増殖解析には染色したT細胞を、Treg解析には未染色のT細胞を使用してください。
  2. Tregフロー解析
    1. 表面マーカー染色
      1. 12日目に、Tregパネル用の抗体カクテルを調製します(表2)。
      2. すべての細胞懸濁液を96ウェル培養プレートからフロー染色溶液を含むVボトムプレートに移します。サイトカイン分析のために上清を保持します。
      3. 細胞を遠心分離(200 × g で5分間、続いて200 μLのFlow染色液)で2回洗浄します。一部のセルを補正コントロール用に取っておきます。FOXP3染色用および未染色コントロール用に1つ取っておきます。
        注:ステップ4.2.1.3の最終スピンの前に、すべてのサンプルを10 μLでコーミングして、必要なコンペンセーションコントロールを得ることをお勧めします。これにより、細胞上の各マーカーのすべての表面レベル発現の代表的なサンプルが得られます。
      4. 2回目の洗浄後、室温で200 x g で5分間遠心分離して吸引し、50 μL/ウェルのFc受容体結合阻害剤抗体(フロー染色溶液で1:200に希釈)を加えます。室温で10分間インキュベートします。
      5. 調製した Treg Panel 抗体カクテルを50 μL/ウェル加えます。
      6. コンペンセーションコントロールには、50 μLの未染色コンペンセーションセルと50 μLの染色済み抗体をそれぞれ混合します。
      7. プレートとコンペンセーションコントロールを4°Cで1時間インキュベートします。プレートをFlow Stain Solutionで一度洗浄し、300 × g で5分間遠心分離します。
      8. HBSS(1:1,000)で200 μL/wellで希釈したLive/Dead Near-IR色素で染色します。4°Cで30分間インキュベートします。
      9. プレートをFlow Staining Solution (200 μL/well) で 300 × g で 5 分間 1 回洗浄します。
    2. 製造元の指示に従ってFoxP3で染色しますが、これには一晩のインキュベーションが必要です。FoxP3染色プロトコルの簡単な概要を以下に示します。
      1. 製造元の指示に従って、 FoxP3固定/透過化作業溶液 を準備します。FoxP3固定/透過化濃縮液1部とFoxP3固定/透過化希釈液3部を混合します。サンプルあたり200μLの作業溶液を調製します。
      2. すべてのサンプルを200 μL/ウェルの作業用固定/透過化溶液でインキュベートします。4°Cで1時間放置します。
      3. 1x Permeabilization Bufferを調製する:10x Permeabilization Buffer(市販のキットから入手)1部と9部の蒸留水とを混合します。
      4. プレートを1x Permeabilization Buffer(200 μL/well)で300 × g で5分間2回洗浄します。
      5. FoxP3抗体(PE-Cy5.5、1:300希釈、1x透過化バッファー)で染色する:希釈したFoxP3抗体を100 μL/ウェル加え、4°Cで一晩インキュベートします。
      6. プレートを1x Permeabilization Buffer(200 μL/well)で300 g×5 分間2回 洗浄します。
      7. 細胞を110 μL/ウェルのフロー染色溶液に再懸濁します。
      8. フローサイトメトリー解析を行います。
  3. T細胞増殖解析
    1. T増殖パネル用の抗体カクテルを調製します(表2)。
    2. すべての細胞懸濁液を96ウェル培養プレートからフロー染色溶液を含むVボトムプレートに移します。サイトカイン分析のために上清を保持します。
    3. 細胞を遠心分離(200 × g で5分間、続いて200 μLのFlow染色液)で2回洗浄します。一部のセルを補正コントロール用に取っておきます。FOXP3染色用および未染色コントロール用に1つ取っておきます。
      注:ステップ4.3.3の最終スピンの前に、すべてのサンプルを10 μLコーミングして、必要なコンペンセーションコントロールを得ることをお勧めします。これにより、細胞上の各マーカーのすべての表面レベル発現の代表的なサンプルが得られます。
    4. 2回目の洗浄後、遠心分離(200 × g 、室温で5分間)して吸引し、50 μL/well Fc受容体結合阻害剤抗体(フロー染色溶液で1:200に希釈)を加えます。室温で10分間インキュベートします。
    5. 調製した T Proliferation Panel 抗体カクテルを50 μL/ウェル加えます。
    6. コンペンセーションコントロールには、50 μLの未染色コンペンセーションセルと50 μLの染色済み抗体をそれぞれ混合します。
    7. プレートとコンペンセーションコントロールを4°Cで1時間インキュベートします。プレートをFlow Stain Solutionで一度洗浄し、300 × g で5分間遠心分離します。
    8. HBSS(1:1,000)で200 μL/wellで希釈したLive/Dead Near-IR色素で染色します。4°Cで30分間インキュベートします。
    9. プレートをFlow Staining Solution (200 μL/well) で 300 × g で 5 分間 1 回洗浄します。
    10. フローサイトメトリー解析を行います。

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結果

我々は、ヒトPBMCのプロトコルを記載し、市販の磁気分離キットを用いてCD3+ T細胞とCD14+ 単球の両方を単離し、単球をGM-CSFおよびIL-4を用いてCD14-、HLA-DR+、CD141+、CD1c+ moDCに分化させ、それらを24時間処理し、抗CD3/CD28刺激を伴う自家T細胞と72時間共培養した。実験的な概略図を 図1に示します。

単球/T細胞の単離とmoDCの分化
私たちの最初の代表的な結果として、2億個のヒトPBMCがペンシルベニア大学のヒト免疫学コア(HIC)から1人の健康なドナーから購入され、プロトコルセクション1および2で説明されているように処理されました。1日目に採血し、HIC施設で標準的なFicoll分画を用いて単離した。T細胞と単球の単離には1億個のPBMCを使用し、それぞれ1,000万個のT細胞と300万個の単球を収...

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ディスカッション

ここでは、免疫調節剤がmoDCからtolDCを誘導し、 その機能が生体内で自己生成T細胞からTregを生成する機能を検証するための、信頼性と汎用性の高い方法について説明します。このプロトコルには、いくつかの重要なステップがあります。まず、単球は感受性が高いことで知られており、最良の結果を得るには、以前に凍結されたPBMCではなく、新鮮なPBMCから取得する必要があります。単球はできるだけ早く単離し、分化カクテルに入れる必要があります。通常、最初の24時間での単球の収量の低さまたは単球の死亡率が高いのは、PBMCと単球の分離の間の凍結/融解サイクルまたは長期化によるものです。次に、moDCとT細胞培養培地の分化に使用されるサイトカインは、高品質の供給源からのものでなければなりません。通常、moDCの分化不良は、サイトカインの品質が低いか、濃度が正しくないことが原因です。第三に、T細胞は1日目から7日目まで凍結し、ナイーブで刺激されていない表現型を維持するために培養物に保持しないことをお勧めします。第四に、 図6<...

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開示事項

著者には、開示すべき利益相反はありません。

謝辞

ペンシルベニア大学のHuman Immunology Core(HIC)がドナーから新鮮なヒトPBMCを提供してくれたことに感謝します。HIC は、NIH P30 AI045008 および P30 CA016520 によって部分的にサポートされています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.1-10 & マイクロ;L ろ過ピペットチップVWR76322-158一般細胞培養
1.5 mL 遠心分離管VWR77508-358一般細胞培養
10 mL 血清学的ピペットVWR414004-267一般細胞培養
100-1000 &L ろ過ピペットチップVWR76322-164一般細胞培養
15 mL コニカルチューブVWR77508-212一般細胞培養
20-200 &L フィルター付きピペットチップVWR76322-160一般細胞培養
2-メルカプトエタノールMP 生物医学194834T 細胞培養
50 mL コニカルチューブVWR21008-736一般細胞培養
60 x 15 mm ディッシュ、Nunclon DeltaThermo Fischer150326一般細胞培養
96 ウェル コニカル (V) 底板、未処理表面サーモフィッシャー277143一般細胞培養
96ウェル フラットボトムサーモフィッシャー161093一般細胞培養
APC/シアニン7 抗ヒトCD272 (BTLA) 抗体バイオレジェンド344518フローサイトメトリー
Attune NxT (赤/青レーザー、7チャンネル)サーモフィッシャーA24863フローサイトメトリー
BSAサーモフィッシャー15260-037一般セル培養
CD14 モノクローナル抗体 (61D3)、PEサーモフィッシャー12-0149-42フローサイトメトリー
CD1c モノクローナル抗体 (L161)、PE-シアニン7サーモフィッシャー25-0015-42フローサイトメトリー
CD209 (DC-SIGN) モノクローナル抗体 (eB-h209)、PerCP-シアニン5.5サーモフィッシャー45-2099-42フローサイトメトリー
CD25 モノクローナル抗体 (CD25-4E3)、APCサーモFischer17-0257-42フローサイトメトリー
CD274 (PD-L1、B7-H1) モノクローナル抗体 (MIH1)、PEThermo Fischer12-5983-42フローサイトメトリー
CD4 モノクローナル抗体 (RPA-T4)、Alexa Fluor 488Thermo Fischer53-0049-42フローサイトメトリー
CD40 モノクローナル抗体 (5C3)、APCThermo Fischer17-0409-42フローサイトメトリー
CD40 モノクローナル抗体(5C3)、APC-eFluor 780サーモフィッシャー47-0409-42フローサイトメトリー
CD69 モノクローナル抗体 (FN50)、PEサーモフィッシャーMA1-10276フローサイトメトリー
CD86 モノクローナル抗体 (BU63)、FITCサーモフィッシャーMHCD8601フローサイトメトリー
CD8a モノクローナル抗体 (RPA-T8)、PE-シアニン7サーモフィッシャー25-0088-42フローサイトメトリー
円錐底(Vウェル)96ウェルプレートッシャー2605サイトメトリー
低温バイアル、2 mLモフィッシャー430488T細胞培養
メチルスルホキシド(DMSO)、シーケンシンググレードッシャー20688細胞培養
DPBSサーモフィッシャー14200166一般細胞培養
EasySepヒト単球単離キットStem Cell Technologies19359細胞分離
EasySep ヒト T 細胞分離キットStem Cell Technologies17951細胞分離
EasySep MagnetStem Cell Technologies18000細胞分離
EDTAサーモフィッシャーAIM9260G一般細胞培養
ファルコン 丸底ポリスチレンチューブ、5 mL幹細胞技術38025細胞分離
Fc 受容体結合阻害剤 ポリクローナル抗体サーモフィッシャー14-9161-73フローサイトメトリー
ウシ胎児血清サーモフィッシャーA5670701一般細胞培養
固定可能な生存率色素 eFluor 780サーモフィッシャー65-0865-18フローサイトメトリー
Foxp3 / 転写因子染色バッファーセットサーモフィッシャー00-5523-00フローサイトメトリー
FOXP3 モノクローナル抗体 (PCH101)、PE-シアニン5.5サーモフィッシャー35-4776-42フローサイトメトリー
HBSSサーモフィッシャー14170-112一般細胞培養
不活化ウシ胎児血清サーモフィッシャーA5670801一般細胞培養
HEPES (1 M)サーモフィッシャー15630106moDC 細胞培養
HLA-DRモノクローナル抗体(L243)、Alexa Fluor 488Thermo FischerA51009フローサイトメトリー
ヒトCD3/CD28/CD2 T細胞活性化因子StemCell Technologies10970T細胞培養
トGM-CSF組換えタンパク質Thermo Fischer300-03moDC細胞培養
ヒトIL-10 ELISAキット、高感度サーモフィッシャーBMS215-2HSELISAの
ヒトIL-4、動物性フリー組換えタンパク質サーモフィッシャーAF-200-04moDC細胞培養
ヒトPBMC(新たに単離UPenn HICN/A細胞
ヒトTNFアルファELISAキットサーモ
光学顕微鏡(DMi1)Lucia391240細胞培養
ポポリサッカリド(LPS)Invivogentlrl-eblpsmoDC細胞培養LIVE
/DEAD固定可能な近赤外死細胞染色キットッシャーL34975サイトメ
トリーMEM非必須アミノ酸溶液(100x)サーモフィッシャー11140050T細胞培養
ニシリン-ストレプトマイシン(100x)サーモフィッシャー15140122一般細胞培養
ペットコントローラーVWR77575-370一般細胞培養ラ
パマイシン、98+%サーモフィッシャーJ62473。MFmoDC 細胞培養
RPMI 1640 グルタマックスサーモフィッシャー61870-036一般細胞培養
バッファー幹細胞技術20144細胞分離
T 細胞刺激カクテル (500x)サーモフィッシャー00-4970-93T 細胞培養
UltraComp eBead Plus 補償ビーズサーモフィッシャー01-3333-41フローサイトメトリー
可変ピペットセットFischer Scientific05-403-152一般細胞培養
プレート サーモフィフロー極サージサーモフィ一般 熱 ヒ)フィッシャーBMS223-4ELISA一般リサーモフィフローペピ付き 分離

参考文献

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