顔面 高次元空間分子解析のためのマウス網膜の凍結切片

サマリー

網膜は、その層状構造全体で複雑な空間構成を示します。最新の空間トランスクリプトミクスおよびシーケンシング技術では、厚さ20μm<組織切片が必要であり、網膜研究の適用性は限られています。この新鮮凍結凍結切片法は、平面的な空間的関係を維持しながら、マウス網膜の薄い 顔 面切片を生成し、椎弓板全体の包括的な分子マッピングを可能にします。

要約

網膜の複雑な層状構造は、包括的な空間分子マッピングに大きな課題をもたらします。組織構造と分子相互作用を研究するための現在の技術は、空間的関係を損なったり、分子プロファイリングを制限したりする技術的な制約によって制限されています。クロスセクショニング、ホールマウント調製、化学的または機械的な解離、厚い 表面 切片などの既存の方法は、組織の完全性を乱すか、重要な空間的文脈を失うか、ほとんどの場合、高次元空間シーケンシングプラットフォームと互換性がありません。

本研究では、網膜細胞の分布をマッピングするために必要な空間的関係を維持しながら、薄い(<20μm) 顔面 切片を作製するクライオセクショニング技術を紹介します。この分析法は、RNAの完全性と組織構造を維持しながら、ハイスループット分子解析プラットフォームに適合した切片を生成します。この技術は、空間的トランスクリプトームプラットフォームのメーカーが後固定組織に対して公式にサポートしている新鮮な凍結組織を切片化するため、RNAの完全性が維持されます。このアプローチは、複数の分子プロファイリング法を用いて検証し、手動のRNAscope in situ ハイブリダイゼーション(12ターゲット)とXenium空間シーケンシング(300ターゲット)の両方との統合に成功したことを実証しています。この技術は、これらの敏感な分子アプリケーションに適したRNA品質を維持しながら、サンプル間で組織構造を一貫して保持します。

この方法論の進歩により、網膜細胞の種類の分布、椎弓板全体の分子勾配、および網膜病理学の空間的側面に関する新たな調査が可能になります。この技術の汎用性と最新の空間生物学プラットフォームとの互換性は、網膜の複雑な細胞組織の包括的な分子マッピングの基盤を提供します。

概要

網膜ニューロンは、情報処理を容易にする空間トポグラフィーを進化させており、その結果、多くの種で、中心窩、領域中枢、縞などの全体的な特殊化が生じます^1,2,3。光受容体分布の多様性がよく理解されているのとは対照的に、網膜神経節細胞(RGC)によって形成される網膜出力の空間的特殊化は、あまり明確ではありません。ほとんどの種にとって、RGCの空間分布はまったく不明です。視覚機能の脊椎動物モデルの中で最も研究されているモデルではないにしても、おそらくマウスでさえ、RGCサブタイプの3分の1未満がホールマウント免疫組織化学²のような従来の技術でマッピングされています。これらの技術は、ほとんどのRGCサブタイプが特定の遺伝子マーカーを持っていないため、失敗します。その代わり、シングルセルRNAシーケンシング^5,6,7による正確なRGC分類⁴のためには、より高次元の分子情報が必要である。

マウスで観察された地形は、RGCの配置と視覚機能との間に明確な生態学的相関関係を示しているため、RGC分布に関する情報は重要です。最も顕著な例は、側頭網膜に集まるɑON-S RGCの空間構成である。この領域は、狩猟行動⁹中に獲物⁸のイメージを受け取る。また、RGCのサブタイプは疾患に対して異なる感受性を持ち10、緑内障のようないくつかの一般的な疾患は、その進行に空間的な要素を持っていることもよく理解されている^11,12。したがって、この分野が直面している重要な問題は、RGCサブタイプが網膜¹をタイル状に並べるときの空間構成は何かということです。この知識のギャップは、現在、他の視覚的に誘導された行動や病気への洞察を制限しています。

本手法の焦点は、空間的関係を維持しながら高解像度の分子分析を可能にする アンフェイス 凍結切片アプローチを通じて、これらの分子知識のギャップに対処することです。10XのXeniumのような最新の空間シーケンシングプラットフォームは、分子プロファイリングの変革的な進歩を表しており、組織組織と細胞相互作用に関する前例のない洞察を提供します。しかし、これらのプラットフォームは、RNAscopeのようなロープレックス技術やVisiumのような空間的にバーコード化されたシーケンシング法とともに、20μmより薄い組織切片を必要とするという重要な技術的制約を共有しています。この要件は、通常、厚さが200μmの網膜組織にとって特に課題となります。

今日まで、研究者はこれらの技術を網膜組織¹³に適用する際に主に断面に依存してきました。断面は、垂直回路の文脈で核層と網状層内の分子関係を効果的に明らかにするが、ホールマウント調製物が伝統的に明らかにしてきた網膜細胞のより広範な空間分布を捉えるにはあまり適していない⁸。表面切片化の最近の試みは、切片の厚さの制約によって制限されており、最新のハイプレックス分子分析プラットフォームには^厚さが14分の50μmの切片しか達成されていません。個々の網膜薄板を研究するために展開されてきたが、現代の空間シーケンシング技術と互換性がない他の歴史的アプローチには、機械的解離^15,16と組み合わせた酵素的消化、または機械的解離のみ17,18,19,20が含まれる.ここでは、これらの制限を克服する、薄く湾曲した網膜組織用に特別に設計された新しい凍結切片技術を紹介します。簡単に言うと、私たちの方法は、眼の後房を切除し、網膜と強膜の両方にレリーフカットを作成し、カバーガラスに対して内側の網膜を持つ組織を平らにし、組織をOCTに埋め込み、最後に外側から内側の網膜に凍結切片を切開することを含みます(図1)。私たちの方法は、空間的な関係を維持しながら、高次元の空間生物学ツールに十分な薄さ(<20 μm)の切片を生成し、手動のRNAscope(12のターゲット)と自動化されたXeniumプラットフォーム(300のターゲット)の両方で成功した実装によって検証され、分子分析のさまざまな複雑さのスケール間で互換性が実証されています。

プロトコル

すべての実験は、コロラド大学が監督するこれらの方法を承認する関連施設ガイドライン(IACUC)およびこれらの方法を承認する関連施設ガイドラインに従って、承認を得て実施されました。動物の使用と安楽死に関連するすべての手順は、地域の規制と実験許可に従う必要があります。すべてのマウスは、食物と水に無料でアクセスできる認定獣医施設に標準的なケアで収容されました。この 顔 面凍結切片技術は、C57BL/6マウスに最適化された標準的な網膜解剖技術に基づいています。この技術を開発するために、6週齢から2歳齢までの雌雄の約150匹のマウスを使用しました。ここで紹介する最終的な手法は、マウスの人口統計学的特性に関係なく、約95%の成功率を示しています。ステップの温度がリストされていない場合は、約20〜25°Cの室温が予想されます。温度が記載されていない溶液は、冷却すると機能するため、溶液の使用温度範囲は4〜25°Cです。

1. 解剖

1. イソフルランでマウスを麻酔し、つま先をつまんで麻酔を検証するか、他の方法が同様に適切であるため、麻酔を誘発および確認するために地域の規則や規制に従ってください。
2. 頸部脱臼によってマウスを安楽死させます:片手でマウスの頭を固定し、もう一方の手で尾の付け根を固定してから、反対方向に引っ張ります。斬首による二次安楽死を行います。
3. 角膜上の球の側頭極をブランド化して、向きを維持し、解剖の弱点を作成します(図2B および 図3A)。
4. 濾紙(地球儀より大きいが皿より小さい)が入った皿に地球をエイムズ溶液に浸します。
   注意: エイムズ以外の溶液を使用すると、網膜が劣化します(図4A)。
5. 鋭利な#5鉗子と虹彩はさみを使用して、強膜を穿刺せずに、すべての筋肉組織、筋膜、血管系、および神経を地球から慎重に取り除きます(図2E、Fおよび図3B)(図2D)。
   注:このステップ(図4B)中に強膜に穴を開けると、組織ヘルニアが発生します(図4C)。
6. 1つの虹彩はさみの刃の先端を角膜ブランドに対して垂直に配置し、はさみを視神経頭と平行にします。この位置で地球に穴を開けます(図3C、D)。
7. 角膜と輪部を1回きれいに切開し、強膜と網膜に続いて視神経乳頭に向かいます(図3E)。
   注:視神経乳頭を切断しないと、強膜と網膜が分離します。この切開の正確な長さは、地球のサイズによって異なり、老齢の動物と若い動物の間で劇的に異なる可能性があり、野生型の動物と比較して一部のCreラインでも大きく異なります。この切開部の最も深い範囲と視神経乳頭の間に約1mmの組織を残すことをお勧めします。
8. ブレードを最初のカットに対して垂直に配置し(図3F、G)、リンバスの約1mm後方に配置します(図2C)。強膜と網膜を通して放射状に切断を開始します。
   1. 鋭い鉗子を使用して地球をガイドおよび回転させることにより、リンバスの後方および平行に一貫した切断線を維持します。カットを最小限に抑えることが理想的ですが、きれいな放射状のパスを維持することを優先します。網膜と強膜が分離している場合は、虹彩はさみの刃を再配置して一緒に切断します。
      注:輪部に切り込むと、レンズの抽出中に強膜から網膜が分離する可能性があります。小さな切り傷や回転は許容されます。網膜ヘルニアのリスクがあるため、力を加えて固定することは避けてください。
   2. 虹彩はさみ刃の中央幅を使用して、1mmの後方距離を推定します。不確かな場合は、網膜と辺縁部の接続が内部で湾曲しているため、より後方の位置に向かって誤ります。より後方のカットは、平らな網膜抽出を容易にします。
9. 輪部と平行な放射状カットが完了したら、残りの網膜接続を検査します。これらを虹彩はさみで慎重に切断し、前部と後部の球体が分離するまで切断します。
10. 2対の鋭い#5鉗子を使用して、グローブの前部と後部を静かに分離します(図3H)。高齢のマウスでは、透明な繊維がレンズを網膜カップに接続することがあります。網膜と強膜の分離を最小限に抑えながら、これらを虹彩はさみで慎重に切断します。
    注意: レンズは、輪部と角膜に取り付けたままにしておく必要があります。
11. 濾紙をサポートプラットフォームとして使用して、虹彩はさみで網膜をクローバーの葉(鉄の十字とも呼ばれます)パターンに切ります(図3I-K)。
    注:クローバーの葉の切開は、このスライスでの記録向きが必要な場合、最初にリンバスを介して行われた一次配向切開よりも短くする必要があります。これら 3 つの新しい橈骨切開のサイズを縮小して、一次切開よりも約 1 〜 2 mm 短くすることをお勧めします。オプシン勾配のような別の機能を配向に使用する場合は、網膜と強膜の分離を防ぐために、切開部の最深部と視神経頭の間に常に約1mmの組織を保持しながら、すべての切開部を同じ長さにすることが適切です。
12. もう一方の目で解剖を繰り返します。壊死を最小限に抑えるために、安楽死から10分以内に第二眼の前房を完全に切除します。

2. 凍結保存

1. ディスポーザブルトランスファープラスチックピペットは、先端を切開して解剖した網膜や強膜(以下、網膜)よりも大きな開口部を作ります。
2. 網膜をピペットにそっと吸引し、ガラス製の顕微鏡スライドに置きます。実験室のワイプを使用して、網膜の周りの余分なエイムズ溶液を慎重に取り除き、網膜が自由に浮かぶことができなくなり、平らにすることができます。
3. 2つの鋭い#5鉗子を使用して、網膜を広げ、内側のアイカップを上に向けて平らに配置します。組織のサイズに応じて、各クローバーの葉のセグメントに0.5〜2 mmのレリーフカットを入れて網膜をさらに平らにし、組織が折りたたまれないように慎重に調整します(図5A)。液体が網膜に隣接してのみ残るまで、追加のエイムズ溶液を取り出します。.
4. カバースリップを使用して、網膜(図5B)とその周囲の液体をすばやく押して移し、外側の強膜が上を向き、内側のアイカップがカバースリップに接触する、つまり網膜神経節細胞が上を向くようにします(図5C)。
5. 網膜が折りたたまれていないことを確認し、必要に応じて調整します。操作を容易にするためにエイムズソリューションを追加します。過剰な液体は組織をカールさせる原因となるため、実験室のワイプを使用して余分なエイムズ溶液をすべて取り除き、網膜を5〜10秒間風乾させます。
   注:短時間の空気乾燥を怠ると、凍結切片中に組織OCTがランダムに分離する可能性があります。過度の空気乾燥は、塩結晶関連の組織損傷につながる可能性があります。
6. OCTメディウムを塗布して網膜を覆い、鉗子を使用してこの層をカバーガラス全体に均等に広げ、網膜の浮遊を防ぎます。OCT培地が網膜に浸透するまで30秒待ちます。
7. OCTで網膜を瞬間凍結します(図5D)液体窒素蒸気で間接的に冷却された金属板を使用するか、ドライアイスと直接接触させることにより。
8. 網膜をすぐに使用する場合はドライアイスで保管し、長期間保管する場合は乾燥剤の入ったビニール袋または容器に入れて-80°Cの冷凍庫に保管してください。

3. クライオセクショニング

1. クライオスタットチャンバーを-18°Cに設定し、ステージを-12°Cに設定します。 網膜をチャンバーに入れて、温度に平衡化します。
2. 試料チャックにOCTドームを作成します。同じモデルのクライオスタットを使用する場合は、このドームが内側の2〜3個の環を占めていることを確認してください。凍結したら、OCTドームをトリミングして、チャックのブレードと平行な平らなステージ面を作成し、層流の平坦性を維持します(図6A)。
3. チャックをクライオスタットステージに関連付けるオリエンテーションガイドを作成するか、メモします。
   注:モデルクライオスタットでは、オリエンテーションガイドはチャックホルダーの上の12時位置にエッチングされた中心線であり、チャック自体は最も外側の環状に三角形の切り欠きがあります。これらの機能をまとめて、オリエンテーションガイドと呼びます。お使いのクライオスタットにそのような機能がない場合は、油性マーカーを使用して自分で作成することをお勧めします。
4. カミソリの刃を使用して、網膜を横方向に囲む余分なOCTを取り除き、次に網膜をカバーガラスから慎重に分離して可動性を持たせることにより、網膜を転写する準備をします。
5. チャックをステージから取り外し、準備した平らなOCTステージ表面に液体OCTを少量滴下します。
6. 事前に冷却した(-18°C)スライドガラスを使用して、網膜をOCTステージに対して10〜30秒間、凍結するまで押し続けます。
7. 網膜とステージに追加のOCTを適用して、完全な接着を確保します。クライオスタットの急速凍結エリアで凍結します。Retina/OCTステージをクライオスタットで最小30分間インキュベートして、完全な接着を確保します。
8. セクショニングを開始します。
   1. 網膜が見えるまで、余分なOCTを慎重にトリミングします(図6B)。かみそりの刃を使用して、ブロックの端から余分なOCTを取り除きます。
      注:手動のラジアルトリミング後にセクショニングを再開する前に、必ずステージを引っ込めてください。スライス を面としてトリミングする場合は、目的のセクションに使用されるのと同じカット厚さを使用することをお勧めします。ただし、トリミングの厚さは、ユーザーの好みに基づいて10μmから100μmの間になる場合があります。
   2. 強膜の存在について切片を検査しながらトリミングを続けます。強膜が見えたら、必要に応じてステージの角度を調整します。切片が強膜分布が等しくなるまでトリミングを続け、各切片で最適な平坦度とクローバーリーフの面積が最大になります。
   3. 組織切片を収集します(図6C)。
      注:最適な厚さは、実施される最終アッセイによって異なり、このダウンストリームプロトコルを遵守する必要があります。例えば、10X Xeniumを使用する場合は、20μm厚の切片を推奨します。一方、10X Visiumの場合は、厚さ15 μmの切片がより適切です。
   4. 事前に冷却されたスライドを使用し、2 つのペイントブラシを使用してセクションを所定の位置に操作します。
   5. OCTが溶けて組織が付着するまで(約5秒)、切片の下に指を置きます。
   6. スライドを冷たい表面に戻し、ティッシュを再凍結します。
      注:小さな領域(Xeniumなど)で切片を収集する場合、複数回の凍結融解サイクルが必要になる場合があります。これはプローブベースの技術には影響しませんが、バイアスのないシーケンシングアプローチのRNA品質に影響を与える可能性があります。
9. スライドはドライアイスで保存してすぐに使用でき、翌日のRNAscopeの場合は-20°Cで、長期保存の場合は-80°Cで保存します。

4. ターゲット検出と顕微鏡検査

注:この手法は他の分子プロファイリング法と互換性がありますが、検証済みの例としてRNAscopeについて詳しく説明します。

1. サンプル調製:
   1. スライドを-80°Cの保管から取り出し、-20°Cで1時間温めます。
      注:スライドは、この手順の残りの部分を開始する前に、-20°Cで最大12時間保存できますが、RNAの分解を最小限に抑えるために、-20°Cに長時間放置しないでください。
2. スライドを37°Cで10秒間すばやく加熱します。
3. スライドを新鮮な4% PFAに室温で30分間浸して組織を固定します。
4. スライドを1x PBSでよく洗います。
5. エタノールシリーズによる組織脱水:50%エタノールを5分間、70%エタノールを5分間、100%エタノールを5分間、新鮮な100%エタノールを5分間。
   注:これは、ティッシュの取り付けにとって重要な品質管理ステップです。脱水中に組織の剥離が発生した場合は、マウント中に隣接するセクションからOCTが重なっていることを示しています。切片化および埋込み中に余分なOCTを慎重にトリミングすることで、この問題を回避できます。
6. バリアの準備:
   1. スライドをベンチトップで室温で5分間風乾します。
   2. 疎水性バリアペンを使用して、各組織切片の周りにバリアを描きます。バリアを室温で5分間完全に乾かします。
7. 分子検出:
   1. 組織透過化のためにプロテアーゼIV治療を適用します。
   2. ターゲットプローブハイブリダイゼーション(40°Cで2時間)、シグナル増幅ステップ(3つのシーケンシャルアンプ)、蛍光色素の検出(3プレックス染色のための4つのシーケンシャルラウンド)について、メーカーのプロトコールに進みます。
8. イメージング：
   1. 各カバーガラスをマウントする前に、DAPI核対比染色を行ってください。
   2. カバーガラスは、色あせ防止封入剤を使用して取り付けます。
   3. 適切なフィルターセットを備えた蛍光顕微鏡法を使用した画像。
   4. 多重検出の場合は、計算レジストレーションのために 4 回の検出ラウンドすべてで同じフィールドをキャプチャします。
   5. ラウンド間で一貫した露出設定を維持し、正確な信号比較を実現します。
      注:RNAscopeの実装の詳細については、製造元のプロトコルを参照してください( 資料の表を参照)。Xeniumのような完全に自動化されたプラットフォームの場合は、提供されているすべてのメーカーのプロトコル手順に正確に従ってください。すべてのプロトコルについて、組織の剥離による失敗は、この模範的なプロトコルに記載されているように、OCTの重複により、初期の脱水または洗浄ステップ中に発生する可能性が最も高いことを想定してください。

結果

このプロトコルを成功裏に実施すると、網膜表面全体の空間的関係を維持しながら、複数の分子プロファイリングアプローチに適した無傷 の顔面 網膜切片が作成されます。私たちは、従来の免疫組織化学から手動のマルチプレックスRNA検出を経て、自動化されたハイスループット分子プロファイリングへと進む、体系的な検証アプローチを通じて、プロトコールの有用性を実証しています。

私たちのプロトコルの最初の検証では、2つの十分に特徴付けられたマーカーを使用して、すべての網膜の組織完全性と構造保存を評価します(図7)。網膜神経節細胞は抗RBPMS免疫染色で標識され、血管系ネットワークはトマトレクチンを用いて可視化されます。この組み合わせは、両方のマーカーが健康な網膜に明確で十分に文書化された分布パターンを持っているため、プロトコルの成功に関する即時のフィードバックを提供します。

適切に調製された組織では、RBPMS免疫反応性は神経節細胞層の個別の細胞標識として現れ、シグナルは...

ディスカッション

ここで紹介する方法は、最新の分子プロファイリング技術に適した薄い 顔 面切片の作成を可能にすることにより、網膜空間生物学における重大な技術的障壁に対処します。このプロトコールで最も重要なステップは、初期解剖中の組織の取り扱いと、凍結保存および切片化中の温度と水分の正確な制御に集中しています。実装を成功させるには、特にOCTを埋め込む前に適切な組織を平坦化し、切片化プロセス全体で一貫した温度制御を維持することにかかっています。

一般的な技術的な成果物とトラブルシューティング:
プロトコルの実装中にいくつかの技術的な課題が発生する可能性があり、それぞれに明確な原因と解決策があります。

組織の剥離:最も一般的な技術的障害は、組織がスライドから剥離する脱水ステップ中に発生します。これは通常、取り付け中に隣接するセクション間でOCTが重なることに起因します。取り付け手順では、後続のセクションを配置する前に、各セク...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
エイムズ&プライム;ミディアム	シグマ・アルドリッチ	A1420-10X1L	特定のブランドは重要ではありません
ビーズスミス スレッド ザップ、スレッド バーナー	ビーズスミス ストア	7.90524E+11	代替焼灼器を使用できます
ライオスタット	ライカ	cm1950	重要な考慮事項は、ステージ温度に対して個別に制御可能な容量です。
ライアイス	NA	NA	NA Fine
Science Tools Dumont #5 鉗子	Fine Science Tools 1129500	NC9889584	特定のブランドは重要ではありません
Fisher Healthcare Tissue-Plus OCT コンパウンド	Fisher Scientific	23-730-571	特定のブランドは重要ではありません
Fisherbrand 高精度ストレート スレンダー ファイン ポイント ピンセット/鉗子	Fisher Scientific	12-000-127	特定のブランドは重要ではありません
フィッシャーブランド標準解剖はさみ	フィッシャーサイエンティフィック	08-951-20	特定のブランドは重要ではありません
フィッシャーブランド スーパーフロストプラス顕微鏡スライド	フィッシャーサイエンティフィ	22-037-246	特定のブランドは重要ではありません
インテグラミルテックスノイエスアイリスハサミ	インテグラミルテックス181510	12-460-278	特定のブランドは重要ではありません
オリンパス IX81 スピニング ディスク 落射蛍光顕微鏡			図 7 RNAscope
HiPlex	ACDBio
長方形カバー メガネ	フィッシャー サイエンティフィ	12-541-033	特定のブランドは重要ではありません
重炭酸ナトリウム	シグマ アルドリッチ	S6014-25G	特定のブランドは重要ではありません
Thermo Scientific Nunc ガラス底皿	フィッシャーScientific	12-567-400	特定のブランドは重要ではありません
ブームスタンドの World Precision Instrument 精密ステレオズーム三眼顕微鏡 (IV)	Precision Instrument PZMTIVBS	50-253-8607	特定のブランドは重要ではありません
Zeiss Axio Imager.M2 落射蛍光顕微鏡			光学セクショニングが有効(図8の場合)