拍動流シミュレータを用いた Ex Vivo 僧帽弁評価モデルの開発

Summary

私たちは、生理学的条件下で弁の機能を評価するために、子羊の僧帽弁を拍動シミュレータにマウントするための ex vivo モデルを提示します。このセットアップにより、再現性のある解剖学的に正確な構成で生体組織を使用して、僧帽弁のダイナミクスを定量的に評価することができます。

Abstract

外科的僧帽弁修復術は、依然として困難な手順です。いくつかの修復技術が定義されていますが、それらの血行動態効果を比較するデータは不足しています。市販のパルスデュプリケーターは、一般的に、機械式または3Dプリントされた心臓弁を介した血液循環をシミュレートするために使用されます。しかしながら、僧帽弁の特定の構造および作用機構のために、外科的技術に関する実験は生体組織の使用を必要とする。 ex vivo lamb 僧帽弁はこのような実験に適していますが、これらの弁をパルスデュプリケーターシステム(PDS)に取り付ける方法は十分に定義されていません。そこで、3Dプリンティングと僧帽弁ホルダーとしてのシリコーン成形により、システムを修正しました。私たちは、各実験で子羊の心臓から僧帽弁を切除しました。これには、その輪と弁下装置が含まれています。これをシリコンホルダーを使用して、テストマシンの房室(僧帽弁)弁領域に埋め込みました。乳頭筋の緊張は、脊索と乳頭状接合部の周りに縫合糸を結び、これらの縫合糸を心室下部の解放孔に通すことによってシミュレートされました。弁の能力の初期テストは、毎分 120 拍の心拍数と 2 L/分の心拍出量で実施されました。弁の逆流と心房室と心室の間の圧力勾配は、パルスデュプリケーター電磁流量計を使用して測定され、心エコー検査で検証されました。ベースラインの血行動態試験では、5回の実験で一貫した弁機能が実証され、平均逆流率は21.1%、エコー由来の伝搬勾配は5.15〜8.13mmHgの範囲でした。一回拍出量とピーク流量は検体間で異なり、小児モデル内の生理学的変動を反映していました。

Introduction

僧帽弁の修復は大幅に進化しており、現代の外科技術は有効性の向上と長期的な転帰の改善を提供しています¹.多くのセンターが標準化された僧帽弁修復戦略を持っていますが、これらの介入の血行動態への影響の包括的な評価には根強いギャップが残っています²。特に解剖学的に複雑な症例や小児の症例に対して、修復戦略を最適化するには、制御された再現性のある生理学的検査を可能にするモデルが必要です。

この研究の主な目的は、生物学的僧帽弁を使用して再現性のあるex vivoモデルを開発し、生理学的流れ条件下での弁動態の正確な評価を可能にすることでした。パルスデュプリケーターシステムは、生理学的に近い条件下での弁機能のex vivo分析を容易にすることにより、弁の生体力学の分野を大幅に進歩させました^3,4,5。これらのシステムは、大動脈弁や肺動脈弁、そして最近では僧帽弁にも適用されています。しかし、この技術の開発の目的は、僧帽弁、特にその弁下装置の独特な解剖学的および機能的複雑さから来ており、生物学的に正確なモデルが必要です。僧帽弁のex vivoモデルに関する文献は数多く存在します。しかし、これらの研究のいずれも、採取技術の詳細な説明を提供しておらず、抽出中に僧帽弁と弁下装置の構造的完全性を維持するために必要な重要なステップを強調していません^6,7。さらに、文献には、生理学的に関連性のある血行動態シミュレーションを達成するために不可欠な、切除された弁をパルスデュプリケーターシステムにうまく統合する方法に関する実用的なガイダンスが不足しています。

成人の心臓手術では、 ex vivo モデルを使用して、エッジツーエッジ修復、脊索置換、乳頭近似5など、いくつかの修復技術が評価され^{ています。}これらの技術は、貴重な生体力学的な洞察をもたらしました。対照的に、小児への応用は未だに未開拓で、僧帽弁裂などの先天性異常を扱った ex vivo 研究は限られています。そのような研究の1つは、弁の能力を回復するための完全な裂け目閉鎖の重要性を示しました⁶。

この方法は、制御された環境で先天性または複雑な僧帽弁の病状の修復結果を評価することに関心のある研究者や臨床医に特に適しています。小児弁との解剖学的類似性のために選択された子羊の心臓から僧帽弁装置を採取し、拍動性フローシミュレータ内のカスタムシリコンホルダーに取り付けることにより、システムは現実的な血行動態を再現し、連続検査を可能にします。重要なことに、このモデルは生きた動物実験を回避し、逆流、狭窄、裂け目、または弁下癒合をシミュレートするための適応可能なプラットフォームを提供します⁸。

この研究では、Vivitro Pulse Duplicator Systemを使用して、僧帽弁の有効性を評価し、心機能をシミュレートしました。手順は、システムソフトウェアの起動から始まり、続いて収縮期と拡張期の比率、心拍数(1分あたりの心拍数)、波長などの適切な波形パラメータが選択されました。その後、僧帽弁をデュプリケーターの試験チャンバーに挿入し、必要なすべてのセンサーを接続しました。キャリブレーションファイルが開かれ、同時にシステムが開始され、センサーの取り付け後にセンサーとチューブからすべての空気が除去されたことを確認しました。正確な測定を保証するためには、流体回路全体に酸素がなく、生理食塩水で完全に満たされていることが不可欠でした。システムが定常状態で運転されたとき、一回拍出量は 25 mL に変更されました。データ取得は、システムにリークやエラーがないことが判明した10サイクルを記録することから開始しました。生成されたデータは、さらに分析するためにスプレッドシート形式でエクスポートされました。この研究の定量的評価は、逆流液量やいくつかの圧力測定値など、必要なパラメータのほとんどを自動的に計算するシステムの能力によって容易になりました(図1A)。

要約すると、この ex vivo モデルは、僧帽弁修復の研究、in silico モデリングと in vivo 検査の間のギャップを埋め、外科的イノベーションの翻訳価値を拡大するための標準化された生物学的関連アプローチを提供します。

Protocol

この研究は、認可された食肉処理場から死後に得られた子羊の心臓を使用して実施されました。イスタンブール大学-セラパシャ地方動物実験倫理委員会(2025/11)の決定によると、この作業はHADYEK指令の第8条(8-k1)に概説されている免除に該当するため、倫理的承認は必要ありませんでした。

1. 実験のセットアップ

1. 3Dモデリングソフトウェアを使用して、パルスデュプリケーターシステムの僧帽弁流入成分を複製します。既存のジオメトリのデジタル コピーを作成して、互換性を確保します。PLAフィラメントを使用して、3Dプリンターでデザインを印刷します。印刷された金型を使用して、シリコンインフローチャンバーを鋳造します。硬化後、シリコン部品をシステムに組み込み、しっかりとフィットし、適切なシールを維持していることを確認します(図1B、C)。
2. 近くの食肉処理場から子羊の心臓を調達し、心臓が死後に入手されて生理学的状態を維持していることを確認することにすぐに注意を払います。採取後は、心臓を-20°Cで別々に冷凍庫に保管して構造的完全性を維持するか、実験手順で速やかに使用してください。
   注:すべての実験は、適切な安全対策の下で行われました。手袋とフードは全体を通して使用され、すべての手術器具は使用するたびにアルコールで滅菌されました。

2.僧帽弁の採取

1. 右心室と心房の心室切開術と切除術
   1. 手術用ハサミを使用して、心臓の頂点に横切開を行います。切開部を心室間溝に沿って右心室に向かって上方向に伸ばします。.この解剖中に乳頭筋を傷つけないように注意してください。切開軌道と解剖学的ランドマークについては、図2A-Bを参照してください。
   2. 手術用ハサミを使用して右心室の自由壁を切除し、露出を延長します。続いて、右心房を 一括 して切除し、心室中隔を完全に露出させます。この曝露は、その後の弁下構造の解剖にとって重要です(図3A、B)。
2. 心室中隔(IVS)の切開
   1. 大動脈基部から左心室腔までの僧帽弁を視覚化します。大動脈弁面の下の向きに基づいて、前部弁尖を特定します。中隔切開の前にリーフレットが完全に露出していることを確認してください(図4A)。
   2. 細い手術用ハサミを使用して、僧帽弁前部の反対側の大動脈基部からIVSを切開します。切開部を中隔に沿って下向きに伸ばし、前に作成した頂端の切り口に向かって伸ばします。中隔を開いて、弁下構造を損傷することなく左心室腔を露出させます(図4B)。
3. 乳頭状筋解剖
   1. 左心室を露出させ、細いハサミを使用して乳頭状筋を切除します。僧帽弁の機能を維持するために、腱索を温存します(図4C)。
4. 左心房切除術
   1. 左心耳を円周方向に切除して、僧帽弁輪の上からの視覚化を改善します(図5A、B)。
   2. 乳頭筋を左心房を通って上方に移動させて僧帽弁を反転させ、切除のために心室表面から安全に露出させます(図6A)。
   3. 僧帽弁輪を囲む余分な組織を切除し、解剖学的完全性と機能を維持するために、少なくとも10 mmの組織が円周方向に保存されるようにします(図6B)。
5. 肺および大動脈組織の除去
   1. 大動脈と肺動脈から残っている組織をすべて取り除き、僧帽弁装置をシリコーン型に配置するのを妨げないようにします。

3.僧帽弁をシリコーン型に配置

1. 僧帽弁の測定
   1. 前後軸に沿った前部および後部僧帽弁尖の長さを測定して、弁尖の寸法を評価します(図7A、B)。
   2. 僧帽弁の長さを中外側軸に沿って記録し、その後の金型フィッティングと寸法解析で使用します(図7C)。
   3. 凝固帯の頭蓋尾筋の長さを、後葉の前後の長さの約 1/4^と 推定します。この距離を測定して、リーフレットのオーバーラップとシーリング容量を評価します。
   4. 測定された寸法を使用して、適切な環状保持マージンを計算します。僧帽弁器の最適なフィット感と安定性を確保するために、30mmのシリコーンモールドを選択します(図8A)。以下の式を使用してください。
      a = (30-x)/2
      ここで、a = 交連から離れるべき距離。x = 測定された内側外側の軸の長さ。
      b = (30 - z y) /2−推定ZC長
      ここで、b =は、前部と後部のリーフレットに残された残りの距離を表します。y = 後部のリーフレットの長さ;z = 前方のリーフレットの長さ。
   5. 測定後、すべての点を接続して、シリコンモールドに縫合する領域を表す連続した円形の輪郭を形成します(図8B)。
2. 組織マウントと脊索腱の付着
   1. 僧帽弁組織をシリコン型に取り付け、16本のU縫合糸を使用して輪を固定し、その解剖学的位置を維持します(図9A)。
   2. 2-0コーティングされた編組ポリエステル縫合糸を使用して、乳頭筋の挿入点で腱索を結びます。
   3. 縫合糸を心室室の基部にあるリリースホールに通し、生理学的乳頭筋の緊張をシミュレートするために縫合糸を固定します。リーフレットの張力は、リーフレットの端が環の平面と一直線に並び、その上に突き出ないように視覚的に調整されました。(図 9B)。
   4. 縫合糸をPDSの左心室穴路で最大張力で配置し、変位を誘発することなく僧帽弁の安定化を確保します(図10A、B)。

4. 初期テスト(ベースラインモデル)

1. 準備した僧帽弁モデルを拍動流シミュレータに配置して、ベースラインの血行動態試験を行います。システムを小児の生理学的条件に設定します:心拍数は毎分120拍、心拍出量は2.0 L / minです。
2. パルスデュプリケーターシステムに生理食塩水を充填し、回路全体に気泡がないようにして、正確な圧力と流量の測定を維持します。
3. 初期化前にパルスデュプリケータシステムをゼロにして、後続のすべての測定が正確であることを確認します。
4. システムを初期化し、目的の一回拍出量に達したら、[ キャプチャ ]をクリックして血行動態測定値を記録します。
5. 上部および透明な心房室からの心エコー画像を使用して僧帽弁の機能を評価し、伝達勾配や逆流の重症度などのパラメーターを評価し、弁モデルの包括的な機能評価を確保します(図10C)。

Results

ベースラインの血行動態データは、パルスデュプリケーターシステム内のカスタムシリコンホルダーに取り付けられたネイティブ僧帽弁を使用した5回の ex vivo 実験から得られました。モデルは、標準化された小児生理学的条件下で灌流されました(心拍出量:2 L / min;HR: 120 bpm)、および機能評価は、圧力トランスデューサーおよび心エコーイメージングを用いて実施された。

逆流率は15.9%から26.6%の範囲であり、平均は21.1%±5.3%でした。一回拍出量は検体によって大きく異なりました(平均:42.8 mL;SD:47.6 mL)、1つのバルブが100 mLを超える出力を示し、解剖学的に有能な構成と一致しています。ピーク流量は平均 154.4 mL/s(範囲:135.8-190.8 mL/s)で、すべてのサンプルで効果的なバルブ排出が実証されました。

透過勾配は、直接圧力測定と心エコー検査の2つの方法を使用して評価されました。計算された勾配は-1.95 mmHgから13.14 mmHgの範囲でした...

Discussion

この研究の目的は、小児の血行動態下で僧帽弁を再現するモデルを開発することであり、これにより、実験ベースとして子羊の心臓を使用するという選択が導きられました。この選択は、子羊の僧帽弁と小児患者の寸法がよく似ていることが要因でした。解剖学的には、子羊の心臓は、人間の心臓と比較して、その縦軸に沿ってより腹側に傾いた方向を示し、左心室8だけで構成された比較的鈍い頂点^{を持っています。}成人の心臓の重量対体重比は約5 g / kgと報告されていますが、この比率は子羊で3 g / kgです。この違いにもかかわらず、僧帽弁の血行動態の評価に大きな制限はありません。解剖学的なプロポーションと機能ダイナミクスの類似性により、子羊の心臓は 、ex vivo 環境での小児僧帽弁の状態をシミュレートおよび分析するための適切で信頼性の高いモデルになります。

僧帽弁の寸法を正確に測定することは、シリコーン型内の適切な位置合わせ、特に前後弁尖の長さ、両交連距離、および凝固帯の長さを確...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-0 コーティングされた編組ポリエステル縫合糸	Covidien	88863230-56	テスト中の乳頭筋の安定化
3Dプリンター	Ultimaker	Ultimaker S3	カスタムシリコーン金型の製造に使用
5-0 モノフィラメントポリプロピレン縫合糸、ダブルアーム	Covidien	VPF-720-X	シリコンモールドへのバルブ縫合
DeBakey 非外傷性鉗子	Aesculap	MB062R	解剖中の組織の取り扱い
フレッシュ ラム ハート	ライセンス 食肉処理場	—	天然の僧帽弁の供給源
メイヨー解剖ハサミ	Aesculap	BC252B	一般的な心臓解剖
マイクロニードルホルダー	Aesculap	FM538R	僧帽弁の縫合
ネルソン・メッツェンバウムはさみ	Aesculap	BC606R	縫合糸の切断に使用
パルスデュプリケーターシステム	ViVitro Labs	18363	バルブテストのための模擬生理学的流れ
シリコーンモールド	—	カスタムメイド	心室の形状を再現するために使用
滅菌生理食塩水 (0.9%)	Elabscience	PB180353	灌流回路用培地