ここでは、マウスとヒツジの着床前胚をガラス化するためのスパチュラモンテビデオプロトコルを紹介します。これは、自家製のヘラで構成され、自家製のソリューションを利用しています。胚を濃度を上げる2つの凍結保護溶液で迅速に平衡化し、スパチュラにロードし、液体窒素に浸漬し、最後に0.5mLストローで密封します。
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方法論記事
哺乳類胚のガラス化のためのスパチュラモンテビデオ
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
この研究では、スパチュラモンテビデオ(MVD)として知られるマウスとヒツジの胚凍結保存のための効率的で費用対効果の高いガラス固化法について説明しています。このプロトコルは、自家製のヘラをキャリアデバイスとして使用し、ゲルローダーチップで調製します。胚は、濃度が増加する2つの自家製凍結保護溶液で迅速に平衡化され、スパチュラにロードされ、次いで液体窒素に直接浸される。着床前段階のマウス胚約30〜40個をスパチュラにロードし、その後、0.5mLのストローで密封します。ガラス化した胚の保管によく使用されるクライオチューブの代わりにヘラを使用することで、液体窒素デュワーのスペースが最適化されます。さらに、温暖化プロセスでは、胚を再水和して形態を回復するために、濃度を低下させる自家製のショ糖溶液のみが必要です。当研究室では、10年以上にわたり、マウスやヒツジの着床前胚にスパチュラモンテビデオを使用し、成功を収めてきました。スパチュラモンテビデオは、マウス胚で平均84%の回復率(回収/ガラス化胚)と97%の生存率(生存/回収胚)を示しています。マウス胚のガラス化は、ゆっくりと凍結するよりも良い結果をもたらしましたが、生殖結果(妊娠、出産、出生率)に違いは観察されていません。ヒツジの胚では、市販のデバイスと比較して、スパチュラモンテビデオで同様の生存率と胚発生率が達成されています。妊娠率は商用デバイスの方が高かったが、子羊の生存率はデバイス間で有意差はなかった。スパチュラモンテビデオガラス固化法は、余剰胚の保存、遺伝子組み換えマウス系統やヒツジモデルのバックアップ、世界中の研究者間での交換の促進に使用できる簡単な凍結保存技術です。
概要
遺伝子組み換え(GM)動物の作製効率は、エンドヌクレアーゼベースの方法、特にCRISPR/Cas9の開発により大幅に向上しました。世界中の多くの研究室では、遺伝的浮動を防ぎ、元の表現型1の完全性を維持するために凍結保存すべきさまざまなGMマウスおよびラット系統を製造しています。さらに、アーカイブ化により、動物の数が過剰になることが多い継続的な繁殖の必要性がなくなります。一部の研究室では、GMマウス系統を凍結保存された胚または精子として国際的なリポジトリに送っており、生きた動物の輸送を避けながらこれらのモデルの交換を促進しています。これにより、同一のGM動物モデルを繰り返し生成することなく、ラインへのアクセスが保証されます2。これらの理由から、胚と精子の凍結保存は、どのGM動物施設でも最優先事項です。一般に、胚は修飾された完全な二倍体ゲノムを含み、胚移植によって容易に回復できるため、GM系統の保存には胚凍結保存が好ましい。
ガラス化は、細胞に入る水と細胞の周りに細胞外結晶を形成する水との間の不均衡を特徴とする非平衡プロセスです。この方法は、細胞内の氷の結晶の形成を防ぎ、緩慢凍結法(SLF)3 ( 図1を参照)とは区別されます。高濃度の凍結保護剤と液体窒素(LN2)との直接接触により、超急速冷却(~40°C/s)が可能になり、数秒でサンプルのガラス質状態を達成できます。さらに、ガラス化は、ゆっくりと凍結する4よりも速く、簡単で、安価です。必要なLN2 は最小限で、通常は商用購入または自家製のシンプルな 機器を使用します5 ( 図1を参照)。
さらに、温暖化プロセスは一般的に高速で再現可能です。凍結保護剤の毒性を回避し、硝子体状態を維持するために迅速に実施する必要があります3。胚を凍結する際、多くの研究室では、キャリアデバイスの利便性、信頼性、堅牢性、保持能力、およびコストを考慮します。
私たちは、ヘラモンテビデオ(MVD)デバイス6を使用した、羊とマウスの胚の日常的な凍結保存のための最小容量のスパチュラガラス化法を好みます。当初は緩急凍結法7 を採用していましたが、すぐにガラス固化に移行しました。LN2 デュワー用のよりシンプルでスペース効率の高いデバイスを作成するために、クライオチューブに差し込むTsang and Chow(2009)8の自家製スパチュラを改造して、0.5 mLのストローで密封するスパチュラMVDを開発しました( 材料の表を参照)。スパチュラはゲルローダーチップ( 材料の表を参照)を備えており、細い鉗子で先端を穏やかに溶かすことにより約1mm²のプラットフォームが形成され、胚をロードするための花びらのようなプレートが作成されます。このプラットフォームは、小さなガラス化液滴で最大40個のマウス胚を収容できます。識別プラグロッド( 材料の表を参照)は、ゲルローダーチップの開放端に挿入されます。
この方法の目的は、胚を簡単、迅速、安価な方法でガラス化することであり、さらに窒素デュワーのスペースを節約することです。このシステムは長年にわたって成功裏に使用されており、特にマウス胚において、優れた胚生存率(~97%)と生殖結果をもたらしています。スパチュラMVDは実験室で作製するため、市販の装置9に比べて低コストな方法である。さらに、それはクライオチューブ8,10の使用と比較して窒素デュワーのスペースを節約する。
図1:胚の凍結保存に使用される主な2つの技術の比較。 この図は、Crispo et al.1 の許可を得て変更されています。BioRender.com 年に作成されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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プロトコル
マウス胚を得るために使用された動物は、国内法18.611および国際動物管理ガイドライン11に従って飼育および取り扱われました。実験プロトコル(許可番号#007-18)は、モンテビデオ・パスツール研究所の動物管理・使用委員会によって適宜承認されました(書面による同意が得られました)。ヒツジの卵子/胚の実験プロトコルは、ARRIVEガイドライン12 に準拠し、国際動物管理ガイドライン11に従って実施された、Institutional Animal Care Committee Fundación IRAUy(プロトコル#001-2017)によって承認されました。
1. ガラス固化(図2)
- スパチュラMVDの準備
- ゲルローダーチップ( 材料表を参照)を短くして、最初の10 mmとチップコーンを切り取ります。
注:これにより、先端が短くまっすぐになり、0.5mLストローによる最終的なシーリングが容易になります( 材料の表を参照)。 - ジェルローダーの先端を時計職人の#5鉗子(材料表を参照)で先端から約1.0cmのところに持ちます。先端をブンゼンバーナーの炎にそっと置き(材料の表を参照)、8〜10秒間保持して、約1mm2の花びらのようなプラットフォームを形成します。
- 火から下ろし、鉗子で5秒間しっかりと保持します。
- 実体顕微鏡( 材料の表を参照)を使用して、花びらのようなプラットフォーム(~1 mm2)が形成され、遠位端が密閉されていることを確認します。
注:ガラス化中のLN2 の浸潤を防ぐために、プラットフォームは遠位端で閉じる必要があります。プラットフォームが清潔で、プラスチックの糸がないことを確認してください。小さすぎる場合や糸がついている場合は、先端をトリミングして手順を繰り返します。 - 手順1.1.1〜1.1.4を繰り返して、必要な数のヘラを準備します(1つのヘラ=最大40個のマウス胚)。
- 紫外線(UV)またはエチレンオキシドを使用してスパチュラを滅菌し、滅菌チューブまたはボックスに保管します。
- ガラス化の日には、ヘラを取り出し、プラットフォームの反対側の端から扱います。識別ロッド( 材料の表を参照)を各ヘラに挿入し、実体顕微鏡ベースに置きます。ロッドに油性マーカーまたは液体窒素耐性ステッカーラベルを貼ります。
注意: へらを取り扱うときは、常にプラットフォームに触れないでください。完全なデバイス(ヘラ+ 0.5 mLストロー+識別ロッド)の全長は、ゴブレットの長さの1 cmを超えてはなりません。
- ゲルローダーチップ( 材料表を参照)を短くして、最初の10 mmとチップコーンを切り取ります。
- ガラス固化液の調製
- FS溶液を調製する:1.5 gの密度勾配培地( 材料の表を参照)と0.85 gのスクロース( 材料の表を参照)を5 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS; 材料の表を参照)に溶解します。沸騰水浴で完全に溶解するまで加熱し、0.22 μmフィルターを使用して滅菌します( 材料の表を参照)。
注:この溶液は、4°Cで最大6ヶ月間保存できます。 - プレガラス化溶液(PV)を準備します:ガラス化の日に、10%エチレングリコール( 材料の表を参照)、10%のジメチルスルホキシド( 材料の表を参照)、および80%M2培地( 材料の表を参照)を混合します。5つのスパチュラに100μLの総容量が必要です。
- ガラス化溶液(V)を準備します:ガラス化の日に、15%エチレングリコール、15%ジメチルスルホキシド、10%M2培地、および60%FS溶液を組み合わせます。5回のスパチュラに合計100μLの容量が必要です。
- FS溶液を調製する:1.5 gの密度勾配培地( 材料の表を参照)と0.85 gのスクロース( 材料の表を参照)を5 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS; 材料の表を参照)に溶解します。沸騰水浴で完全に溶解するまで加熱し、0.22 μmフィルターを使用して滅菌します( 材料の表を参照)。
- 胚の脱水とガラス化プロセス
- LN2の準備:LN2 を適切な容器(例:10 cm x 30 cm x 20 cmの断熱ポリスチレン容器)に注ぎ、使用するヘラと同じ数の0.5 mLストローを置きます。
注:LN2の下での操作中にスパチュラプラットフォームの視覚化を容易にするために、コントラスト効果を作成するために色付きの底部断熱ポリスチレン容器を使用することをお勧めします。
注意: LN2を取り扱うときは、適切なゴーグルと手袋(材料の表を参照)を着用してください。 - 溶液の準備:100 mmのプラスチック製ペトリ皿( 材料の表を参照)に、各スパチュラに100 μLのM2、20 μLのPV溶液、および20 μLのV溶液を滴下します。
- 胚のガラス化:ガラス化する胚をM2ドロップに入れます。一度に30〜40個の胚を取り扱い、PV溶液滴下で30秒間インキュベートし、次に室温(RT)でさらに30秒間V溶液滴下でインキュベートします。
- プルドガラスキャピラリー( 材料の表を参照)とアスピレーターチューブアセンブリ( 材料の表を参照)を使用します。胚を配置する前に、キャピラリーに少なくとも1 μLのそれぞれの溶液をプレロードします。
注:胚は液滴内で異なる高さにあるため、実体顕微鏡マイクロメーターを調整して胚を特定します。残り10秒で各ドロップから胚を回収します。すべての胚操作は実体顕微鏡下で行わなければなりません。 - 胚をロードする:最小限のV溶液(~0.1 μLなど)を使用して胚を吸引し、スパチュラプラットフォームにすばやく配置します。
- LN2への浸漬:胚をロードした後、すぐにスパチュラプラットフォームをLN2 に5秒間浸します(スパチュラをロッドで手で保持します)。次に、ヘラをLN2 蒸気に保持しながら、長いステンレス鋼ピンセットを使用して0.5mLのストローで密封します( 材料の表を参照)。
注意: 温暖化中の膨張を防ぐために、密封する前にストローからLN2 を取り外してください。胚滴と藁壁が接触しないように、へらとわらが適切に位置合わせされていることを確認してください。便宜上、密封されたスパチュラは、すべてのスパチュラに胚がロードされるまでLN2 コンテナに残し、必要に応じてLN2 を補充することができます。 - 手順を繰り返す:新しいPVドロップとVドロップのペアを使用して、胚の各グループに対してステップ1.3.3から1.3.7を繰り返します。
- 保管:スパチュラをゴブレットに移し( 材料の表を参照)、次にLN2 ストレージデュワー( 材料の表を参照)に移します。
- LN2の準備:LN2 を適切な容器(例:10 cm x 30 cm x 20 cmの断熱ポリスチレン容器)に注ぎ、使用するヘラと同じ数の0.5 mLストローを置きます。
図2:スパチュラMVDを使用したガラス固化プロセスのスキーム。 詳細については、テキストを参照してください。BioRenderで作成。メイクル、M.(2025)https://BioRender.com/x96y902。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
2. 温暖化(図3)
- 溶液調製
- 1 Mショ糖溶液を調製し、0.85 gのスクロースを2.5 mLのM2培地に溶解します。0.22μmフィルターで溶液を滅菌します。
注:この溶液は調製し、4°Cで最大1週間保存できます。 - 0.5 Mおよび0.25 Mのスクロース溶液を調製するには、1 Mのスクロース溶液を適切な容量のM2培地で希釈します。
- スクロース溶液をホットプレート( 材料表を参照)で温暖化が始まるまで37°Cに維持します。
- 1 Mショ糖溶液を調製し、0.85 gのスクロースを2.5 mLのM2培地に溶解します。0.22μmフィルターで溶液を滅菌します。
- ウォーミングプレートの準備
- 100 mmのプラスチック製ペトリ皿に、温める各スパチュラに500 μLの0.5 Mスクロース、50 μLの0.5 Mスクロース、50 μLの0.25 Mスクロースを1滴ずつ溶液ドロップします。M2培地(各100μL)を3滴入れて洗浄します。
- 温暖化プロセス
注:加温プロセスは、室温、例えば実体顕微鏡のベースで20〜22°Cで行われます。- デュワーから密封されたヘラを回収します。LN2 を使用して適切なコンテナに入れます。 図 3 を参照してください。
- ウォーミングプレートを実体顕微鏡に置きます。一度に1つずつ、ステンレス鋼のピンセットでヘラの基部を持ち、手袋をはめた手で識別ロッドを引き出し、次にストローを引き出します。胚を含むプラットフォームを500 μLの0.5 Mショ糖滴にすばやく浸します。
- すべての胚がドロップに落ちたことを確認します。必要に応じて、へらをそっと動かして放出を助けます。胚を引っ張ったガラスキャピラリーにロードし、0.5 Mショ糖溶液の50 μL滴下に入れ、2分間インキュベートします。
- 胚を50 μL滴の0.25 Mショ糖溶液に入れ、さらに2分間インキュベートします。
注:胚を各溶液に入れる前に、使用する溶液をキャピラリーに事前にロードします。 - 最後に、胚をM2培地の異なる滴で3回洗浄して、スクロースを取り除きます。
- 使用前に、各種に適した条件下で胚を少なくとも1時間インキュベートします。
図3:スパチュラMVD温暖化プロセスのスキーム。詳細については、テキストを参照してください。 BioRenderで作成。メイクル、M.(2025)https://BioRender.com/k91k191。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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結果
当初は、プロピレングリコール溶液、ストロー、および速度制御凍結装置7に基づく従来の緩慢凍結法を使用しました。しかし、ガラス化法がより簡単で費用対効果の高い選択肢である可能性を検討した後、8細胞 in vivo 由来マウス胚と2細胞 in vitro 産生マウス胚13(表1および表2)において、従来の緩慢凍結(SLF)とスパチュラMVDの結果を比較する研究を実施しました。結果は、凍結保存された胚の総数に対する温暖化後にデバイスから回収された胚の数を定義する「回収率」の観点から提示されます。「生存率」とは、デバイスから回収された胚に対する生存可能な胚の数を指します。割球が無傷であれば、胚は生存可能と考えられていた(2細胞胚には2つの割球、8細胞胚には少なくとも4つの割球)
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ディスカッション
スパチュラMVDは、組み立てが簡単で、低コストで、最小容量のガラス固化装置で、高い胚保持能力と最適な液体窒素デュワー占有率を備えています。この方法は、簡単、迅速、堅牢であることが証明されています。平均して、ガラス化胚の高い胚回収率と生存率(~90%)だけでなく、マウスで胚移植を行った場合の良好な生殖結果(~80%の妊娠率と~30%の出生率)も達成しており、これは他の最小体積ガラス化法に匹敵します18,19,20。
スパチュラMVDガラス化法の重要なステップには、(i)スパチュラの準備が含まれます。この手法には、かなりの専門知識が必要です。鉗子で加熱してゲルローダーチップで製造されるプラットフォームは、~1 mm2 で、端部で閉じている必要があります。先端が開いたままの場合、温暖化プロセス中にヘラをショ糖滴に突...
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開示事項
著者は、利益相反を宣言しません。
謝辞
スパチュラMVDの開発に貢献してくれたアレホ・メンチャカに感謝します。GSは、バイオテクノロジー大学院プログラム-ファカルタッドデシエンシアス-レプブリカ大学(https://webmasterbiotecnol.wixsite.com/biotec1)(助成金番号:GS 2437 347)から資金提供を受けました。GS、MNM、MC は、FOCEM - Fondo para la Convergencia Estructural del Mercosur (https://focem.mercosur.int/es/) から資金提供を受けました (助成金番号: COF 03/11)。GSとMCは、ウルグアイのSistema Nacional de Investigadores, Agencia Nacional de Investigación e Innovaciónのフェローです。(https://www.anii.org.uy/)。資金提供者(バイオテクノロジー大学院プログラム-シエンシア学部-レプブリカ大学;FOCEM - Fondo para la Convergencia Estructural del Mercosur;Sistema Nacional de Investigadores, Agencia Nacional de Investigación e Innovación, Uruguay)は、研究デザイン、データ収集と分析、出版の決定、または原稿の準備に関与していませんでした。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 0.22 & マイクロ;m フィルター | ザルトリウス | 16534 | ミニサートシリンジフィルター0.2&マイクロ;L |
| 0.5mLストロー | ミニチューブ | 13408/0044 | フレンチタイプのミディアムパイエット |
| アスピレーターチューブアセンブリ | シグマ | A5177 | |
| ブンゼンバーナー | インデュラブ | 7000134 | |
| ジメチルスルホキシド | シグマ | D2650型 | |
| エチレングリコール | シグマ | 102466 | |
| フィコルPM70 | シグマ | F2878 | 密度勾配媒体 |
| ゲルローダーチップ | エッペンドルフ | 10411193 | |
| ガラスキャピラリー | マリエンフェルト | 2900000 | マイクロヘマトクリット毛細血管 |
| LN2ハンドリング用手袋 | テンプシールド | セ0338 | クライオグローブ |
| ゴブレット | ミニチューブ | 16913/1133 | |
| LN2ハンドリング用ゴーグル | 3メートル | 40661-00000-10 | 曇り止め、傷防止コーティング |
| ホットプレート | ラベック | LA-SH-II-5B | デジタルモデル |
| 識別ロッド | IMVテクノロジー | 6326 | 非滅菌 LG48 mm |
| 断熱発泡スチロール容器 | |||
| LN2 ストレージデュワー | テイラー・ウォートン | XT21-AI | クライオサイエンス |
| 長いステンレス鋼のピンセット | ファインサイエンスツール | 11000-25 | |
| M2 | シグマ | M7167 | |
| PBS | 自家製 | リン酸緩衝生理食塩水。通常、1 Lの濃縮5xバッファーを調製し、1xに希釈します。レシピ:塩化ナトリウム40 g、塩化カリウム1 g、無水リン酸二ナトリウム7.2 g、リン酸一カリウム1.2 g。蒸留水を加え、オートクレーブで滅菌します。 | |
| プラスチックペトリ皿 | 隼 | 351029 | TC処理されていない細菌学用ペトリ皿 |
| 実体顕微鏡 | オリンポス | SZ2-LGB型 | |
| ショ糖 | シグマ | S1888 | |
| 時計職人s #5鉗子 | ファインサイエンスツール | 11254-20 |
参考文献
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