キトサンナノ粒子カプセル化アデニンベースエディタープラスミドの骨内注入による遺伝子導入と発現の増強

サマリー

ここでは、ABEコーティングキトサンを骨髄に直接注入する遺伝子治療アプローチを紹介します。

要約

外因性プラスミドの実験動物への導入は、遺伝子機能の解明、疾患メカニズムの解明、薬効評価など、生物医学研究において非常に重要です。しかし、現行の方法のトランスフェクション効率は比較的低く、長期的な遺伝子発現のためのプラスミドの導入は免疫系の影響を受ける可能性があります。これらの制限に対処するために、キトサンを利用してアデニン塩基エディター(ABE)プラスミドをカプセル化し、骨内注射によってマウスの骨髄に直接複合体を送達する新しい方法を開発および研究しました。本研究では、破骨細胞の分化と密接な関係にある CaMK II δ 遺伝子を標的とするため、キトサンを用いてABE CaMK II δ プラスミドをカプセル化しました。骨内注射により、プラスミドカーゴを骨髄腔内に直接注入しました。その結果、レシピエントマウスのA1遺伝子座で14.27%、A2遺伝子座で10.69%という高い in vivo 編集効率が示されました。この新しい戦略は、破骨細胞の異常な機能によって引き起こされる疾患に特に適しているだけでなく、遺伝子治療の分野を進歩させる大きな可能性を秘めています。

概要

遺伝子治療は、生物医学研究の分野で有望なアプローチとして浮上しています^1,2。実験動物に外来プラスミドを導入して特定の遺伝子の発現を調節し、その治療効果を研究することで、さまざまな疾患を治療できる可能性を秘めています。しかし、従来の送達方法では、その有効性や安全性に限界を設ける問題がいくつか発生していました³。懸念事項には、トランスフェクション効率の低さ、生物学的損傷の高さ、遺伝子発現効率の低さなどがあります。そのため、これらの限界を克服できる新しい遺伝子治療の送達方法を確立する必要があります。

キトサンは、優れた生分解性と生体適合性^4,5,6を備えた天然の多糖類であり、深刻な生物学的毒性を引き起こすことなく動物の体内で容易に分解できます。薬物包埋率^7,8が高く、送達効率が向上し、動物への被害が少ないため、薬物送達に広く使用されています。

A-TからG-Cへの塩基対変換を直接可能とするABE遺伝子編集技術は、遺伝学や医学研究において有望視されています。現在の主流の遺伝子編集技術と比較して、ABE技術は正確な一塩基突然変異を達成できるため、非標的DNA配列の編集を減らし、オフターゲット効果^9,10を減らし、DNA二本鎖切断¹¹をゼロにし、遺伝子編集¹²のリスクを大幅に低減します。また、ABE技術は生体適合性が高く、疾患治療研究により適しています。

尾静脈注射は、特に遺伝子治療において、プラスミドのin vivo送達に使用される一般的な方法です。本研究の標的遺伝子はCaMK II δであり、これは破骨細胞の分化と密接に関連している^13,14。尾静脈の代わりに骨内注射を使用することで、編集されたプラスミドが骨髄に直接破骨細胞に入ることができます。この骨髄への直接的な伝達は、遺伝子発現の効率と安定性を高め、破骨細胞の機能不全に関連する疾患の治療に有利です。

ここでは、ABEプラスミドをキトサンでカプセル化し、骨内注射によりマウスに直接導入する新しい方法を紹介します。この方法により、生物に侵入する外来プラスミド、特に破骨細胞の機能障害に関連する疾患に対して、より効果的な遺伝子治療への道を開くことを目指します。

プロトコル

記載されているすべての動物実験は、動物の使用と世話に関する安徽大学の動物衛生委員会によって承認されました。本研究では、阿部はTian Chi教授(Shanghai University of Science and Technology, Shanghai, China; 図1D)。

1. ABEプラスミドの構造

1. GACがPAMを提示するTCCATGATGCACAGACAGGA配列でgRNAを設計します。
2. 同社のプライマーリストガイドに従って、プライマーを対応する容量のddH₂Oに添加して、100 μMの濃度を達成します。次に、振ってよく混ぜ、均一に分散させます。アニーリング反応は、新しい微量遠心チューブにストックプライマー溶液10μL、ddH2O90μLを加えて10μM溶液を調製し、よく混合します。
3. 5 μLのアップストリームプライマー、5 μLのダウンストリームプライマー、および40 μLのddH₂Oを微量遠心チューブに添加します。アニーリング反応を促進するために、沸騰したお湯で満たされた容器にチューブを5分間浸します。水がプライマーに侵入して汚染されるのを防ぐために、水位がチューブの開口部に達していないことを確認してください。室温まで冷却してアニール反応を完了します。
4. 2 μg の pLKO5.sgRNA.EFS.tRFP (図 1D)、1 μL の ESP3I、4 μL のバッファー、および 33 μL の ddH₂O を微量遠心チューブに加え、37 °C の恒温水浴で 45 分間反応させます。
5. アガロースゲル電気泳動を行います。0.5 gのアガロースを秤量して1%アガロースゲルを調製し、ガラス瓶に注ぎます。1x TAEバッファー50 mLをガラス瓶に加え、振とうしてアガロース粉末を溶解します。電子レンジで2分間、完全に溶けるまで加熱します。YeaRed Nucleic Acid Gel Stain 5 μL を加え、よく混ぜ合わせてゲル型に注ぎます。ゲルが固まったら、サンプルの添加を開始します。
   注:1xTAEを調製するには、 表1に記載されている試薬を使用してください。
6. 電気泳動タンクに1x TAEを加え、TAEに浸漬するアガロースゲルブロックに入れます。ステップ1.4の消化産物に5 μLの1xローディングバッファーを加え、混合します。サンプルをゲルに加えます。さらに、6 μLのマーカーもゲルに加えます。
7. 電気泳動プログラムを110Vの定電圧で35分間実行します。電気泳動後、マーカーに従ってサンプル中のバンドの位置を決定し、ゲルを回収するためにきれいなブレードでゲルストリップを切断します。
8. ゲルマキシ精製キットの指示に従って、ゲル回収操作を行います。ウォーターバスを50°Cに設定します。 キットに従って、カットされたゲルを含むチューブに対応する量のPN溶液を追加します。ピペットチップでゲルを突いて溶解を促進し、水浴に入れます。時々チューブを振って、ゲルブロックが完全に溶解するまで溶解プロセスを観察してください。
9. キットからスピンカラムCA3を取り出します。キットから500 μLのBL溶液をスピンカラムに加え、2,000 x g で1分間遠心分離してカラムを平衡化します。遠心分離後、収集チューブの底にある廃液を取り除き、吸着カラムを収集チューブに戻します。
10. 2,000 x g で1分間遠心分離を続けます。遠心分離管の底に廃液を捨て、600μLのPN溶液を加え、2,000 x g を30秒間遠心分離します。廃液は再度捨ててください。操作を繰り返して、廃液を再度廃棄します。
11. 遠心分離後、2 mLの採取チューブを新しい1.5 mLのチューブと交換します。カバーを開け、換気の良い場所で30分間乾燥させて、エタノールを完全に取り除きます。次に、予熱した40μLのddH₂Oを加え、遠心分離し、必要なDNAを溶出します。
    注:PNは、指示に従って無水エタノールで追加する必要があります。予熱水を使用すると、歩留まりを増やすことができます。
12. ステップ1.3のアニーリング産物7 μL、ステップ1.11のゲル回収産物3 μL、T4 DNAリガーゼ1 μL、10x T4 Ligase Buffer2 μL、ddH₂O7 μLを微量遠心チューブに加え、ライゲーション産物を得るために16°Cで一晩保持します。
13. ライゲーション産物10 μLとDH5α 70 μLを氷上の微量遠心チューブに30分間加えます。ウォーターバスを42°Cに設定します。 氷浴の後、チューブをウォーターバスに90秒間入れ、次に再び氷の上に2分間入れます。
14. 600 μLのLuria-Bertani(LB)液体培地をチューブに加え、シェーカーで30分間振とうします。同時に、LB固体中プレートを層流キャビネット内に30分間照射します。インキュベーション後、100 μLの溶液をプレート上に均等に分配します。コーティング後、プレートを逆さまにして37°Cの細菌インキュベーターに置き、培養します。
    注:DH5αは通常-80°Cで保存され、LB固体培地は 表2にリストされている試薬を使用して調製されます。LB液体培地は、 表3に示す試薬を使用して調製します。
15. 単一のコロニーを選択し、新しいプレート上で細菌コロニーを14時間拡大します。50 mLの遠心チューブに50 mLのLB液体培地を加え、50 μLのアンピシリンを1:1000の比率で加え、よく混ぜます。これを新しいチューブに15mL/チューブ分で分けます。
16. 培養プレートで、成長が良好な丸い白いコロニーがないか確認してください。これらを10μLピペットで選択し、LB培地に移します。これをシェーカーで12時間培養し、このサンプルをシーケンシングに送ります。
17. シーケンシング結果を標的gRNAと比較し、マッチング配列である Camk II δ-sgRNAを標的株とする菌株を同定し、プラスミドを抽出します。
18. ミニプラスミドキットの指示に従ってプラスミド抽出を行います。吸着カラムCP3にBL500μLを加え、2,000× gで1分間遠心分離し、廃液を捨てる。吸着カラムを収集チューブに戻します。500 μLの細菌溶液を加え、4,000 x g で10分間遠心分離します。
19. 流れを回収します。再度遠心分離を行い、上清を取り除いた後、細菌沈殿物のある遠心チューブにP1を250μL加え、その後、微量遠心チューブに移してボルテックスします。250μLのP2を加え、6x-8xで静かに反転します。350μLのP3を加え、再度6x-8xで穏やかに反転させます。白い凝集性の沈殿物が現れます。
20. 2,000 x gで10分間遠心分離します。上清を新しい吸着カラムCP3に移し、2,000 x g で30秒間遠心分離し、廃液を除去します。PWを600μL加え、再度2,000× g で30秒間遠心分離し、廃液を除去します。再度PW600μLを加え、2,000× g で30秒間遠心分離し、廃液を除去します。
21. 吸着カラムを収集チューブに入れ、2,000 x g で2分間遠心分離して残留PWを除去します。次に、吸着カラムを清潔な微量遠心チューブに入れ、30分間乾燥させ、35μLの予熱したddH₂Oを吸着フィルムの中央に加え、得られた製品を次のテストのために-20°Cで保存します。
    注:PWは、指示に従って無水エタノールで追加する必要があります。予熱水を使用すると、歩留まりを増やすことができます。

2. 骨髄細胞の抽出

1. 8〜9週齢、雄、体重約30gのKMマウスを選択します。マウスを頭を下にして左手に固定し、腹部側面から1%ペントバルビタールナトリウムを右手の注射器で150μL注入します。つま先をつまんで麻酔を確認します。
2. マウスの頸部脱臼を行い、手術用ハサミとピンセットで脛骨を切除し、周囲の余分な筋肉組織を剥ぎ取ります。取り除いた脛骨をPBSに浸して洗い、きれいな骨だけを残します。
3. シリンジにPBS1 mLを投入し、脛骨の一端から骨髄細胞を骨が白くなるまで洗い流します。
4. 細胞懸濁液を回収し、800 x g 、4°Cで5分間遠心分離します。上清を除去した後、500 μLの赤血球溶解物で赤血球を溶解します。1分後、1 mLの分離バッファーを添加して赤血球ライセートを終了します。800 x g 、4°Cで5分間遠心分離した後、上清を取り除き、細胞を氷上に置いて後で使用します。
   注:赤血球が完全に溶解すると、細胞は沈殿し、赤血球は見えません。赤血球がまだ見える場合は、再度溶解することができますが、他の細胞への損傷を避けるために、インキュベーション時間が長すぎないようにする必要があります。

3. キトサントランスフェクション

1. キトサン製剤:キトサン4 mgを秤量し、0.2 mg / mL酢酸溶液20 mLに溶解します。.10 M NaOHでpHを5.5に調整します。この溶液を500μL取り、個々の微量遠心チューブに加えます。
2. 2 μg、3 μg、4 μg、5 μgのABEプラスミドを個々のチューブに添加し、500 μLの30 mM Na₂SO 4に溶解します_。 500 μLのキトサン溶液と500 μLのプラスミドを混合します。
3. それらを50〜55°Cの水浴中で15分間インキュベートします。2つの溶液をよく混合した後、15〜30秒間ボルテックスし、30分間放置します。
4. キトサンの特性評価:動的光散乱(DLS)を使用してキトサンの直径とゼータ電位を分析し、キトサンの濃度をddH₂Oで0.1 mg / mLに維持します。
5. 0.1 mg/mLのサンプルをシリコンチップにキャストします。再懸濁したサンプル20 μLを200メッシュグリッドに加え、室温で10分間インキュベートします。グリッドを2%リンタングステン酸で3分間染色し、残りの液体を濾紙で取り除きます。透過型電子顕微鏡で観察します。
6. ナノ粒子のカプセル化効率:上清を0.1μmフィルターでろ過し、沈殿していない粒子を除去します。プラスミドをアップロードし、260 nmの分光光度計で濃度を測定します。ABEプラスミドとgRNAプラスミドの計算された効率は、それぞれ84%±0.37%、85%±0.53%でした。
7. プラスミドを包埋したキトサン100μLを骨髄腔を通してマウスに注入します(ステップ5)。注射の7日後、骨髄細胞を分離し、ステップ2で説明したように赤血球を溶解します。
8. 2 mLの血清含有DMEM培地を6ウェル細胞培養プレートに加え、500 μLの血清含有DMEM培地に懸濁した骨髄細胞(約1 x 10⁶)を加えます。蛍光顕微鏡で蛍光強度を測定します。 CaMK II δ-sgRNAプラスミドは、580 nmで励起するとTagRFP赤色蛍光を示します(図2B)。
   注:血清含有DMEM培地は、 表4に記載されている試薬を使用して調製します。

4. フローサイトメトリー

1. 2 μg、3 μg、4 μg、5 μgの異なる用量のABEプラスミドを調製し、ステップ3で説明したようにレシピエントマウスに送達します。7日後、ステップ3で説明したように、マウスから骨髄細胞を単離します。
2. 骨髄細胞を採取し、800 x g 、4°Cで5分間遠心分離します。上清を捨て、赤血球を500μLの赤血球溶解物で溶解します。1分後、1 mLの分離バッファーで反応を終了し、セルカウンターで細胞数をカウントします。
3. 1 x 10⁶ 細胞を新しい微量遠心チューブに移し、800 x g で4°Cで5分間遠心分離します。上清を除去した後、細胞を500μLのPBSで再懸濁し、フローチューブに移します。フローサイトメトリーで効率を測定します。ステップ2で説明したように、フローサイトメトリーコントロールグループを調製します。
   注:FSCシグナルが低く、FSC対SSC散布図の左下隅(400未満)にある細胞破片と死細胞は除外しました(図3)。プラスミドはTagRFP赤色蛍光を有するため、選別することができます。

5. 骨髄腔内注射

1. 8〜9週齢のKM雄マウスを選択、体重は約30g。150μLの1%ペントバルビタールナトリウムの腹腔内注射で麻酔をかけます(ステップ2.1)。つま先をつまんで麻酔の深さを確認します。
2. 麻酔をかけたマウスを手術台の仰臥位に固定し、マウスの前肢をテープで固定します。
3. マウスの後脛骨をアルコール綿棒で消毒します。1mLシリンジに注入するプラスミドに26Gの針を充填します。気泡を取り除き、注入の準備をします。
4. マウスのすねに触れ、マウスのすねを指で持ちます。脛骨シャフトがマウスの膝関節の脛骨プラトーから貫通するように、注射針の位置を決定します。注射針を脛骨と平行に回転させ、骨髄腔に突き刺し、マウスへのダメージを最小限にするためにゆっくりと(約3秒)注入します。
5. 注射後、針をゆっくりと引き出し(約3秒)、すぐにアルコール綿棒を使用して出血を止め、穿刺部位を消毒します。
6. マウスを暖かい環境(20〜26°C)に静かに置き、マウスが麻酔から回復するのを待ち、回復を観察します。

6. サンガーシーケンシング

1. 注射の7日後、ステップ2で説明したようにマウスの骨髄細胞を採取し、抽出キットを使用してゲノムDNAを単離します。細胞を2,000 x g で1分間遠心分離して回収します。上清を捨て、200 μLのGA溶液を加え、ボルテックスミキサーで振動させます。20 μLのProteinase Kと200 μLのGBを加えて混合し、70°Cの水浴に10分間入れます。
2. インキュベーション後、200μLの無水エタノールを加え、15秒間振とうした後、混合液を支持吸着カラムに入れます。2,500 x gで1分間遠心分離し、チューブの底にある廃液を捨て、500 μLのGD溶液を加えます。廃液を遠心分離して廃棄し、ペレットをPWで2回洗浄し、最後に乾燥させて40μLの純水で溶出させます。
   注:PWは、指示に従って無水エタノールで追加する必要があります。
3. フォワードプライマー配列gctaaggtgataaatgtggcactと逆プライマー配列ctagtgtgcggcagattcのリバースプライマー配列を用いて、標的遺伝子 CaMKIIδ をPCRで増幅します。25 μL の 2x バッファー、1 μL の dNTP Mix、2 μL のフォワードプライマー、2 μL のリバースプライマー、1 μL の DNA ポリメラーゼ、2 μL のテンプレート DNA、17 μL の ddH₂O を加えて PCR 反応液を調製します。95 °C で 3 分間、95 °C で 15 秒間、以下の PCR プログラムを実行します。 53.7°Cで30秒、72°Cで60秒、保温で12°C。
4. PCR後、1%アガロースゲルを調製し、110 Vで35分間アガロースゲル電気泳動を行います(ステップ1.5、ステップ1.6)。電気泳動後にターゲットゲル領域を切断し、サンガーシーケンシングに送ります(図4)。

結果

In vitro プラスミドを骨内注射によりマウスに注射しました (図1A)。ナノ粒子の平均粒子サイズは約202.9nm、電位は2.77mV、PDIは0.22でした(図1B)。 図1C は、電子顕微鏡で球状に観察されたナノ粒子の表面形状を示しています。 図1D は、ABEベクターのプラスミドマップとgRNAベクターのプラスミドマップを示しています。

プラスミド形質導入を蛍光顕微鏡で観察しました。 図2A は正常な骨髄細胞を示す。プラスミドをマウスに7日間導入した後、マウスの骨髄細胞を蛍光顕微鏡で観察しました。対照群と比較して、キトサントランスフェクション群のトランスフェクション効率は有意に改善されました...

ディスカッション

生物医学研究において、外因性プラスミドを動物に送達する際の課題は、送達および遺伝子発現の効率を改善すると同時に、動物への害を最小限に抑えて所望の治療効果を達成することである^15,16。私たちは、レシピエントマウスの骨髄細胞にキトサン媒介ABEプラスミド送達を骨内注射する新しい方法を提示します。この戦略により、プラスミドの送達効率と遺伝子発現が向上します。

まず、本研究では、非ウイルスベクターシステムとして提供されているキトサンをプラスミド送達の方法として用いた。従来法のトランスフェクション効率が比較的低いことが実証されているため、長期遺伝子発現のためのプラスミドの導入は、免疫系の影響を受け得る^17,18。天然の多糖類であるキトサンは、その優れた生体適合性、プラスミドカプセル化能力、お...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.2 ml PCRチューブ、フラットキャップ	ラボセレクト	PT-02-C
1mLシリンジ	安徽江南医療機器有限公司	/
1%ペントバルビタールナトリウム	/	/
1.5mlマイクロ遠心チューブ	ラボセレクト	MCT-001-150
10 & 回;DNAローディングバッファー	ヴァザイム	P022-01
10X T4 DNAリガーゼバッファー 1 ml	TaKaRa Biotechnology(Dalian)Co.,LTD	2011年
1250 & ムー;l ピペットチップ 102.1mm	ラボセレクト	電話番号-001-1250
200 & ムー;l ピペットチップ 50.55mm	ラボセレクト	T-001-200
2x ファンタ マックス バッファーa	ヴァザイム	P505-d1
4 ?遠心機	サーモフィッシャー	75002425
50ml遠心分離管	ラボセレクト	T-012-50
6ウェル細胞培養プレート	ラボセレクト	11110
寒天	サンゴンバイオテック	A505255-0250
アンプ	アビオウェル	/
キトサン	サンゴンバイオテック	A600614-0500
恒温培養シェーカー	上海志成分析機器製造有限公司	ZWY-200D
Countess 自動セルカウンター	サーモフィッシャーサイエンティフィック	伯爵夫人II/IIフロリダ州
Countess 細胞計数チャンバースライドおよびホルダー、使い捨て	サーモフィッシャーサイエンティフィック	C10228
CutSmart バッファ	ニューイングランドバイオラボ	B7204SVIAL
DH5&アルファ;	一般的なバイオシステムズ	CS01010
DMEMの	ギブコ	C11995500BT
dNTPミックス	ヴァザイム	P505-d1
Esp3I酵素	NEビオラボ	R0734S
エチレンジアミン四酢酸	VETEC(シグマアルドリッチ)	V900106
ウシ胎児血清	オリセル	FBSAD-01011-500
フローサイトメーター	BD FACSカリバー	342975
フローチューブ	ビヨタイム・バイオテクノロジー	FFC005-1袋
蛍光顕微鏡	ライカ	427019
ゲルマキシ精製キット	天玄	DP210
ゲノムDNA抽出キット	天玄	DP304
氷酢酸	中国製薬集団集団公司	10000218
ゴールドバンドDL2,000 DNAマーカー	イェセン	10501ES60
製氷機	上海正橋	BNS-30	研究室用予約済み
ImunoSep バッファー	プレシジョンバイオメディカルズ株式会社	604050
Megafuge 8 小型卓上遠心分離機シリーズ	サーモフィッシャーサイエンティフィック	75004250
MEMの	ライフテクノロジー	11140050
ナノドロップ2000	サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国
ナオウ	シガム	S5881-500G
PBSの	シジーン	XG3650
PCMV-SPRY-ABE8Eベクター	/	/
PCR増幅装置	サーモフィッシャー	AKC96300441
ペニシリン/ストレプトマイシン	ソーラービオ	P1400
ペプトン	サンゴンバイオテック	A505247-0500
ファンタマックススーパーフィデリティDNAポリメラーゼ	ヴァザイム	P505-d1
赤血球溶解物	ビヨタイム	C3702
塩化ナトリウム	中国製薬集団集団公司	10019318
硫酸ナトリウム	アラジン	S433911
T-001-10 10&ミュー;l ピペットチップ 31.65mm	ラボセレクト	T-001-10
T4 DNAリガーゼ	TaKaRa Biotechnology(Dalian)Co.,LTD	2011年
トリス	バイオフロックス	1115KG001
トリプトン	サンゴンバイオテック	A505250-0500
ボルテックスミキサー	シグマ	Z258423
ウォーターバス	上海一恒	DK-80
YeaRed 核酸ゲル染色	イェセン	10203ES76
酵母エキス	BBIの	A610961-0500
ゼータサイザーナノ	マルバーン・パナリティカル	ゼータサイザー ナノ ZS
&β;-メルカプトエタノール	シグマ	444203