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方法論記事

リアルタイムPCRを用いたSNPジェノタイピングによる 線虫減 数分裂におけるクロスオーバーの頻度と分布

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DOI:

10.3791/68183

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2025年7月11日

 ,  ,  , 
1Graduate School of Biology-Oriented Science and Technology, Kindai University, 2Department of Genetic Engineering, Faculty of Biology-Oriented Science and Technology, Kindai University, 3Graduate School of Frontier Biosciences, Osaka University

この記事について

サマリー

このプロトコルは、 線虫の減数分裂中のクロスオーバー周波数と分布を測定する方法を提供します。リアルタイムPCRによる一塩基多型ジェノタイピングを使用して、染色体の起源を決定しました。4ポイントマッピングにより、各染色体の左腕、中央、および右腕の領域の交差分布を決定することができました。

要約

Caenorhabditis elegansは 、減数分裂を研究するための優れたモデル生物です。生殖周期が短い、子孫が多い、イメージング用の透明な体などの一般的な利点に加えて、6対の相同ホロセントリック染色体があります。強いクロスオーバー干渉とクロスオーバー分布の規制があります。クロスオーバー頻度を測定するために、可視マーカーマッピング、snip-SNPマッピング、およびクロスオーバー形成の前駆体としての細胞学的マーカーの定量化が開発されました。ここでは、 C. elegans oogenesisのクロスオーバー周波数と分布を測定するための修正SNPジェノタイピング法を紹介します。この方法により、制限酵素処理やゲル電気泳動の面倒なステップを省略し、切断されていないDNAバンドの曖昧な判断を回避できます。一塩基多型(SNP)ジェノタイピングは、ブリストル/ハワイアンハイブリッド株を用いて行います。雌雄同体とmyo-3p::GFP発現オスを交配することで、卵形成に焦点を当てることができます。1つの線虫溶解物は、6つの染色体すべてに十分なDNAテンプレートを生成します。5' エキソヌクレアーゼベースの TaqMan ケミストリーおよび SNP 特異的マイナーグルーブバインダー(MGB)プローブにより、約 97.7% のジェノタイピング率で SNP を精密に検出できます。SNPの正確な検出を利用して、 C.エレガンスのクロスオーバー周波数を測定します。この方法は、男性またはクロスオーバー欠損変異体におけるクロスオーバー頻度の決定、およびより特異的な染色体間隔にも適用できます。

概要

相同染色体間のクロスオーバー形成は、染色体の適切な分離と遺伝的多様性の生成に不可欠です1。クロスオーバー形成のエラーは異数性を引き起こし、不妊症、流産、先天性欠損症につながる可能性があります2。クロスオーバー頻度は、染色体領域、変異体の種類、年齢、性別によって異なり、これらの各条件でクロスオーバー頻度を正確に測定する必要性を強調しています3,4,5。この方法の全体的な目標は、各染色体ドメインのクロスオーバー周波数を正確に測定し、それによってC.エレガンス染色体の全長にわたるクロスオーバーの分布を正確に決定することです。

従来、形態学的マーカーを使用した2点マッピングは、交差周波数6,7,8,9,10を測定するために使用されてきました。C.エレガンスでは、染色体マップを作成するために、ダンピー、ショート、ファットボディ(Dpy)および非協調運動(Unc)の表現型がよく使用されます6。この方法の利点は、低コストで多くの子孫を解析できることです。これらの方法の欠点には、関心のある遺伝子座を選択する制限や、表現型が見えないために致死的な子孫を使用できないことが含まれます。部位選択の不便さを克服するために、Tc1トランスポゾンは、多型配列タグ付き部位(STS)11,12のマーカーとして使用されてきた。Tc1sは、PCRおよび電気泳動を使用して検出できます。標準的なブリストルN2株は30コピーのTc1トランスポゾンを持っていましたが、フランスのベルジュラックから分離されたC.エレガンス株(RW7000およびDP13)は500コピーのTc1を持っていました。したがって、Tc1トランスポゾンの数と分布は分離株間で異なり、これはPCRによって分離株間のハイブリッドワームの子孫の染色体を分析するために使用されます。その後、SNPはクロスオーバー周波数と分布の測定にも使用されました13,14。ブリストルN2株とハワイアンCB4856株の間のSNPは、1,000 bpごとに現れました15,16。SNPは、PCR、制限酵素処理、および電気泳動を使用して、制限フラグメント長多型(RFLP)として検出されます。最近、ブリストルN2とハワイアンCB4856との間のSNPと同様に、小さな挿入/欠失(InDel)部位がより効率的なマーカーとして提案されている17。しかし、Tc1、RFLP、InDelを用いたクロスオーバー周波数の測定には、PCR、制限酵素処理、電気泳動などの労働集約的なプロセスが必要です。大規模な解析で各プロセスを最適化しないと、PCRの精度、使用する制限酵素の種類、DNA切断の効率、電気泳動時のバンドの明瞭さと分離などの要因により、結果が誤って解釈される可能性があります。これに対し、提案手法では、リアルタイムPCRによるSNPジェノタイピングを利用して、正確かつ精密な定量化を容易にしています。

クロスオーバーは染色体に沿ってランダムに分布しているわけではありません。C.エレガンスでは、単一のクロスオーバーは腕でより頻繁に形成される傾向があり、中央で抑制されます3,5。形態学的2点マッピングでは、マーカー遺伝子の外側でクロスオーバーが発生する場所を特定できません。逆に、SNPマッピングはマーカーの増加を可能にし、染色体5,14,18全体に沿ったクロスオーバーの正確な領域の決定を容易にすることが示されています。本研究では、RockmanとKruyglyak5が提唱した染色体ドメイン境界を採用し、染色体の両端と中心/腕境界の両端の4つのSNPを解析対象として選択しました。

従来の方法の利点を活かし、TaqMan, 5' nuclease19を用いたリアルタイムPCRにより、各染色体の左腕、中央腕、右腕のクロスオーバーを測定するための正確かつ迅速なSNP検出法を提案しました。先行研究20,21,22と比較した、他の技術に対する我々の方法の利点は、精度と単純さである。この方法は、線虫のqPCRを適用したクロスオーバー解析法であり、減数分裂を研究する研究者に広く適しています。

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プロトコル

1.最初の遺伝的交配

  1. 35 mmディッシュに小さなOP50スポット(~5 mm直径)を持つ通常の線虫増殖培地(NGM)プレートを含む嵌合プレートを調製します。
  2. ブリストルN2系統の3匹のL4雌雄同体(またはブリストルの背景を持つ変異体)とハワイアンCB4856株の9匹の若年成人オスを交配プレート上に加える(図1A)。
    注:胚致死率の高い突然変異体を解析するには、この交配でブリストルとハワイの両方の背景を持つバランスの取れた突然変異体を使用する必要があります。ハワイの背景を持つ突然変異体を得るためには、ブリストルの変異体をハワイの株と少なくとも6回交配し、関心のあるすべてのSNPサイトがハワイの背景を持つ必要があります。その結果、ハワイアン変異体は変異領域とバランサー染色体にのみブリストル背景を含んでいます。
  3. プレートを20°Cで1.5日間インキュベートし、2つの菌株を交配させます。各雌雄同体をOP50を搭載した新しい個別のNGMプレートに移します。
  4. プレートを20°Cのインキュベーターに1日間置き、受精卵を産むことができるようにします。各雌雄同体をOP50を搭載した新しい個別のNGMプレートに移します。
  5. プレートを20°Cのインキュベーターに1日間置き、受精卵を再び産むことができるようにします。雌雄同体を削除します。プレートを20°Cのインキュベーターで0.5〜1日間保管し、子孫をL4に成長させます。

2.セカンドクロス

  1. 6匹の交配L4雌雄同体(ブリストル/ハワイ雑種)と12-15 ccIs4251[(pSAK2) myo-3p::GFP::LacZ::NLS + (pSAK4) myo-3p::mitochondrial GFP + dpy-20(+)] I (TTS24) ブリストル雄を新しい交配板に選びます(図1B)。
    注:ccIs4251挿入株はCaenorhabditis Genetics Centerから入手し、野生型N2株と6回以上交配する必要があります。
  2. プレートをインキュベーターで20°Cに1.5日間保管して交配させます。各雌雄同体をOP50で新しいNGMプレートに移します。
  3. プレートを20°Cのインキュベーターに1日間置き、受精卵を産むことができるようにします。各雌雄同体をOP50を搭載した新しい個別のNGMプレートに移します。
  4. プレートを20°Cのインキュベーターに1日間保管し、再び受精卵を産ませます。各親雌雄同体を3 μLの溶解バッファーを入れたPCRチューブに移し、最初の交差が成功したかどうかを確認します。
  5. V染色体の領域でPCRにより、ブリストル/ハワイアンハイブリッドとして両親の遺伝子型を確認します。
    1. SNP(WBVar01973670)では、ブリストルゲノムからのPCRアンプリコンの長さは220 bp、ハワイアンゲノムからのPCRアンプリコンの長さは196 bpです。PCRの結果が両親がブリストルホモ接合体であることを示している場合、これは最初の交配の自家受精によるものです。これらのワームの子孫をさらなる分析に使用しないでください。

3. サンプリング

  1. 50 mM KCL、10 mM Tris pH 8.2、2.5 mM MgCl2、0.45% IGEPAL CA-630 (NP-40)、0.45% Tween 20、0.01% ゼラチンのように、線虫溶解バッファーを調製します。ろ過により滅菌し、室温で保存してください。使用直前に、20 mg/mL プロテイナーゼ K (H2O 中) 3 μL を 1 mL の溶解バッファーに加え、-20 °C でアリコートで保存します。
  2. 2回目の交配の子孫の体壁筋でのGFPの発現を蛍光解剖顕微鏡で確認してから、個々のPCRチューブに線虫を添加します。倍率は6.1〜55倍で、使用される波長は440〜460nmです。
  3. GFP陽性の1つのワームを選択し、3 μLのワーム溶解バッファーを含む各PCRチューブに添加します(図1C)。合計 360 個 (90 x 4 生物学的複製) の成人オスの交配子孫を 360 本の PCR チューブのそれぞれに収集します。
    注:自家受精した子孫を選ばないように、GFP陽性の寄生虫をサンプリングに選択する必要があります。L4より若い未交配雌雄同体も常染色体の解析に利用できますが、X染色体の数が異なるため、L4に成長した後に雄と雌雄同体を特定し、X染色体を解析する際にサンプリングする必要があります。
  4. サンプルを-80°Cの冷凍庫に5分間置きます。サンプルは、溶解が始まるまで-80°Cで保存できます。
  5. 胚致死率の高い変異体を解析する場合は、生きた幼虫ではなく死んだ胚を採取すると、偏りのない結果が得られます。胚を採取するには、0.5 μLのキチナーゼ溶液(20 mg/mLキチナーゼ、50 mM NaCl、70 mM KCl、2.5 mM MgCl2、2.5 mM CaCl2)を入れたピペットチップを使用します。産卵後4時間以内に胚を採取します。
    注:4時間以上前に産卵された死んだ胚は、おそらくゲノムDNAの分解により、PCR分析には適していません。

4. サンプル溶解

  1. サーマルサイクラーのPCRチューブを60°Cで1時間、続いて95°Cで15分間セットします。各チューブに100μLのヌクレアーゼフリー水を加え、よく混ぜます。
  2. リアルタイムPCRによるSNPジェノタイピングを開始するまで、サンプルを-20°Cで保存します。

5. SNPジェノタイピング

  1. 次のように混合物を作ります(図2)。1.5 mLのチューブに、125 μLのMaster Mix、6 μLのSNP Genotyping Assay(40x)、280 μLの蒸留水(DW)、フォワードプライマー(450 nM)、リバースプライマー(450 nM)、プローブ1(100 nM)、プローブ2(100 nM)を加えます。
    注:プローブとプライマーを 表1に示します。
  2. ピペッティングを数回行って十分に混合し、濃度が均一になるようにします。12チャンネルマイクロピペットでサポートベース上の96ウェルPCRプレートの各ウェルに4 μLの混合物を加えます。
  3. 各ゲノムDNAを含むライセート1 μLを各ウェルに加え、数回ピペッティングして混合します。
  4. ポジティブコントロール、すなわちブリストルホモ接合体、ハワイアンホモ接合体、およびブリストル/ハワイアンハイブリッド、およびネガティブコントロールとして3つのテンプレートなしコントロールを準備します(図3A)。
  5. プレートを光学接着フィルムでシールします。アプリケーターを使用して、各ウェルの縁に焦点を合わせてフィルムを押します。
  6. プレートを短時間遠心分離して、底部に液体を集め、液体から気泡を取り除きます。
  7. プレートをリアルタイムPCR装置にロードします。ソフトウェアの [新しい実験の作成 ]ボタンをクリックします。
  8. 「Properties」設定で、「Instrument type」を「QuantStudio 1 System」に、「Block type」を「96-well 0.2 mL Block」に、「Experimental type」を「Genotyping」に、「Chemistry」を「TaqMan Reagents」に、「Run mode」を「Fast」に設定します。
  9. Method設定で、Volumeを5 μL(正しい反応量がセットアップと一致することを確認します)、Cycle Countを40サイクル(デフォルト)に設定します。温度と時間の設定を次のように設定します:Pre-Readステージを25°Cで30秒間、Holdステージ(酵素活性化、ホットスタート)を95°Cで20秒間、PCRステージを95°Cで1秒間、60°Cで20秒間、Post-Readステージを25°Cで30秒間設定します。
  10. プレート設定で、サンプルとコントロールの位置をソフトウェア画面上の各ウェルに一致させます。
  11. 実験をUSBデバイスに保存し、リアルタイムPCR装置にロードして、 Run ボタンをクリックします。

6. データ分析

  1. 結果をUSBに保存し、データを分析するためにコンピューターに転送します。
  2. Rn(正規化レポーター)はレポーター色素VICおよびFAMからの蛍光シグナルであり、パッシブリファレンス色素ROXの蛍光シグナルで除して正規化された、以下の式を使用してリアルタイムデルタRn(dRn)データを分析します。
    dRn = Rn - ベースライン
  3. 対立遺伝子識別プロットを確認します。
  4. クラスターの分離を確認します(図3B)。対立遺伝子識別プロットでは、ブリストルホモ接合体は右下隅に、ブリストル/ハワイアンハイブリッドは右上隅に、ハワイアンホモ接合体は左上隅にグループ化され、ネガティブコントロールは左下隅にグループ化されています。次のカラーコードを使用します。
    赤:ブリストル対立遺伝子
    青:ハワイ対立遺伝子
    緑:ヘテロ接合体
    黒:ネガティブコントロール
  5. 結果をスプレッドシートファイルにエクスポートし、4つのSNP位置すべてからジェノタイピングデータを組み立てます。4 つの連続した位置に未決定のコールがある場合は、N 値からデータを除外します。分析にはプレートあたり90サンプルを使用します。
    1. 位置 #1 の SNP がブリストル/ハワイアン ハイブリッドで、ポジション #2-#4 がすべてブリストル ホモ接合体 [B/H]-[B/B]-[B/B]-[B/B] または位置 #1 がブリストル ホモ接合体で、位置 #2-#4 がすべてブリストル/ハワイアン ハイブリッド [B/B]-[B/H]-[B/H]である場合、 これらの結果は、位置#1と#2(染色体の左腕のどこか)の間の単一の交差を示しています。同様に、[B/H]-[B/H]-[B/B]-[B/B]または[B/B]-[B/B]-[B/B]-[B/H]-[B/H]の場合、#2と#3の間(染色体中央領域のどこか)で1回のクロスオーバーが発生し、[B/H]-[B/H]-[B/H]-[B/B]または[B/B]-[B/B]-[B/B]-[B/H]の場合、 #3と#4(染色体の右腕のどこか)の間で単一のクロスオーバーが発生します。
      注:ダブルクロスオーバーには6つのパターンがあります。左右:[B/B]-[B/H]-[B/H]-[B/B]と[B/H]-[B/B]-[B/B]-[B/H]、左と中央:[B/B]-[B/H]-[B/B]-[B/B]と[B/H]-[B/B]-[B/H]-[B/H]、中央と右:[B/B]-[B/B]-[B/B]と[B/H]-[B/H]-[B/B]-[B/H]-[B/B]-[B/H]。

7. 統計解析

  1. SPSS Statistics ソフトウェア (IBM) に値を挿入します。染色体の左腕、中央領域、右腕でのクロスオーバー分布を比較するには、左腕にクロスオーバーのある染色体を82本、中央領域にクロスオーバーのある染色体を20本、右腕にクロスオーバーのある染色体を68本挿入します。
  2. ANOVA補正とBonferroni補正を実行し、両側のp値を使用して統計的有意性を決定します。左腕と中央、WT と変異体など、必要な数の比較を実行します。

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結果

我々は、 C.エレガンス(C. elegans) の染色体II上の4つのSNP部位をSNPジェノタイピングアッセイにより検出し、染色体の全長、左腕、中央領域、および右腕におけるクロスオーバー形成を定量化した。SNPの検出は、製造元の指示に従って行われます。マスターミックスには、Taq DNAポリメラーゼ、熱に不安定なウラシル-N-グリコシラーゼ(UNG)、dNTPとdUTP、およびパッシブリファレンスROX色素が含まれています。Taq DNAポリメラーゼは95°Cで活性化されるため、低温での非特異的増幅を阻害できます。UNGおよびdUTPは、以前に増幅されたPCR産物の分解を可能にし、キャリーオーバー汚染および潜在的な偽陽性を防止する23。

SNP特異的プローブとPCRプライマーセットは、SNP部位を含む1 kbのゲノムDNA配列に基づいて、サーモフィッシャーサイエンティフィックによって作成されました(表1)。ブリストルプローブの5'末端はVIC色素で標識され、3'末端は非蛍光クエン...

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ディスカッション

ここでは、ブリストル/ハワイの雑種からの交配子孫のSNPジェノタイピングに基づいて、C.elegans減数分裂の交叉頻度と分布を測定する方法を紹介しました。従来のsnip-SNP法(RFLP)では、PCR後にゲル電気泳動が必要であり、DNAバンドの検出にはゲルドキュメンテーションシステムが必要です14,18が、リアルタイムPCRを用いた5'ヌクレアーゼアッセイによるSNPジェノタイピングでは、面倒な電気泳動手順は必要ありません。

メソッドの重要なステップ
このプロトコルには、いくつかの重要な手順が含まれます。解析対象の変異体がブリストル株で作成されている場合、そのSNPはハワイの背景に置き換える必要があります。通常、ブリストルの突然変異体とハワイの野生型を6回以上交配すると、背景を完全に置き換えるのに役立ちます。正確な遺伝的交配は、交叉の検出...

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開示事項

著者は、利益相反を宣言しません。

謝辞

この株は、NIH研究インフラストラクチャープログラム局(P40 OD010440)の資金提供を受けて 、Caenorhabditis Genetics Center(CGC)から提供されました。この研究について有益な議論をしてくださった齋藤研究室のメンバーに感謝いたします。本研究は、日本学術振興会(JSPS)のTTS科学研究費助成JP23K05868の支援を受けて行われました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
101-1000&ミュー;l ピペットチップQSPの111-N-Q
0.5mol/I-EDTA溶液(pH 8.0)ナカライテスク14347-21
10mol/I-水酸化ナトリウム溶液ナカライテスク94611-45
10X DreamTaqグリーンバッファーサーモフィッシャーサイエンティフィック EP0713
10&ミュー;L、ロングチップ、グランド深江香生 ワトソン110-207C
200&ミュー;L、標準チップ、目盛り付き深江香生 ワトソン110-705C
寒天粉末ナカライテスク01028-14
アガロースPHジャパンPH108
オートクレーブ TOMY型 ES-215 高圧蒸気滅菌器トミーセイコーES-215
タンパク質のバクトペプトン酵素消化サーモフィッシャーサイエンティフィック 211677
ホウ酸ナカライテスク05215-05
Caenorhabditis elegans ブリストル野生型 Caenorhabditis 遺伝学センターN2
Caenorhabditis elegansハワイアン野生型Caenorhabditis 遺伝学センターCB4856
塩化カルシウムナカライテスク06729-55
ccIs4251 [(pSAK2) myo-3p::GFP::LacZ::NLS + (pSAK4) myo-3p::ミトコンドリア GFP + dpy-20(+)] I斎藤研究室TTS24元々はPD4251から
コレステロールナカライテスク08721-62
カスタムTaqMan SNPジェノタイピングアッセイサーモフィッシャーサイエンティフィック 4332077
デオキシヌクレオチド(dNTP)溶液混合物ニューイングランドバイオラボN04470
DigPrint Docタブレット DP-T130zバイオツールDP-T130z型
リン酸水素二カリウムナカライテスク28726-05
解剖顕微鏡ニコンSMZ-745 C-DS
Dream Taq DNAポリメラーゼサーモフィッシャーサイエンティフィック EP0713
臭化エチジウム溶液ナカライテスク14631-94
WBVar01973670のフォワードプライマーIDTの103988736atgtctcacccaaggttgaa
ゼラチンナカライテスク166-31
ギルソンPIPETMANクラシックピペットサーモフィッシャーサイエンティフィック 
イゲパル CA-630シグマ・アルドリッチ18896
硫酸マグネシウム七水和物ナカライテスク21003-75
MicroAmp Optical 96ウェルリアクトンプレートサーモフィッシャーサイエンティフィック N8010560
MicroAmp 光学接着フィルムサーモフィッシャーサイエンティフィック 4311971
ミニアンプ サーマルサイクラーサーモフィッシャーサイエンティフィック ミニアンプ
Mini-Sub Cell GT 水平電気泳動システム、7 x 10 cm トレイバイオ・ラッド研究所1704466
ニチペットEXIIニチリョウ00-NPX2-2
ニチペット EXII MULTIニチリョウ00-NPM-12VP型
ピペットメイトNEOニチリョウ午後00時ネオ
塩化カリウムナカライテスク285-38
リン酸二水素カリウムナカライテスク28720-65
プロテイナーゼKサーモフィッシャーサイエンティフィック EO0491
QuantStudio 1 リアルタイム PCR システム、96 ウェル、0.2 mLサーモフィッシャーサイエンティフィック A40426
クイックロード パープル 1kb プラス DNA ラダーニューイングランドバイオラボN0550S
WBVar01973670のリバースプライマーIDTの103988737tggctactcctagtcactga
塩化ナトリウムナカライテスク31319-45
TaqPath ProAmp マスターミックスサーモフィッシャーサイエンティフィック A30866
TCディッシュ35、標準ザルシュテット83.3900
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンナカライテスク35406-75
トリズマベースシグマ・アルドリッチ T1503-1KG
トゥイーン20米山試薬03706
ワームスタッフワームピックジェネシーサイエンティフィック59-AWP
WormStuff ウォームピックチップ(90/10% Pt/Ir、30ゲージ)ジェネシーサイエンティフィック59-30PI36

参考文献

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