マウスにおける軟髄膜転移研究のための低侵襲槽マグナ注射モデル

サマリー

このプロトコルは、マウスの軟髄膜転移を強力に誘導し、外傷および頭蓋外腫瘍の負担を軽減する経皮的穿刺経路を通じて腫瘍細胞を大槽に注入する方法を説明しています。

要約

軟髄膜転移(LM)は、がん細胞が脳脊髄液(CSF)で満たされた軟髄膜に広がることであり、進行性固形腫瘍のまれでありながら壊滅的な合併症です。LMの患者はしばしば予後が不良で、生存率は数週間から数か月で測定されます。LMの複雑さを正確に再現する in vivo モデルの開発は、LMの細胞および病理学的メカニズムを理解し、潜在的な治療法を評価するために不可欠です。マウスLMモデルは、通常、腫瘍細胞の心臓内、頸動脈、または大槽への注射によって作成されます。しかし、心臓内注射や頸動脈注射は、しばしば頭蓋外腫瘍や脳腫瘍にかなりの負荷をもたらし、生物発光イメージングを複雑にし、LMとは無関係の死亡率につながります。一方、従来の大槽注射は、皮膚の切開や筋肉の解剖などの侵襲的な処置が必要であり、外傷性であり、リソースを大量に消費します。ここでは、皮膚切開を必要とせずに大槽を介して軟髄膜腔に腫瘍細胞を注入するための低侵襲手術について説明します。このアプローチは、他の外科的方法と比較して、頭蓋外腫瘍の形成を減らし、外科的外傷を最小限に抑え、必要な時間と術後ケアを短縮します。重要なことに、それは一貫して最小限の脳実質浸潤でLMを誘導します、これは2光子顕微鏡と組織学的分析によって確認されています。この合理化されたアプローチは、前臨床研究におけるLMの研究のための効率的で信頼性の高いモデルを提供します。

概要

転移性疾患は、進行がん患者にとって依然として最大の課題です。軟髄膜転移(LM)とは、がん細胞が軟膜、くも膜下、くも膜下腔に広がることを指します。固形腫瘍由来の月濤腫は、肺がん(9%-25%)、乳がん(5%-20%)、黒色腫(6%-18%)^1,2でますます一般的になってきていますが、これは主に生存期間の延長と診断技術の向上によるものです。がん細胞は、1)硬膜、骨、神経などの末梢構造を介した直接浸潤を含む、複数の経路で軟髄膜腔に侵入する可能性があります。2)静脈系を介した血行性の広がり。3)動脈循環からの侵入、がん細胞は開窓のある血管を通って脈絡叢に入り、続いて脳脊髄液で満たされた心室に滑り込みます^3,4,5。軟髄膜腔に侵入する腫瘍細胞は、成長因子の欠乏、代謝中間体の制限、低酸素状態など、複数の課題に直面します⁶。しかし、適切なツールや技術がないため、腫瘍細胞がどのようにしてこれらの経路をナビゲートし、人を寄せ付けない条件を克服して軟髄膜腔にコロニーを形成するのかはよくわかっていません。放射線療法、全身治療、髄腔内注射療法などの集学的治療の進歩にもかかわらず、LM患者の予後は依然として不良であり、生存期間は通常2〜4か月の範囲です3,7,8,9。したがって、現在の治療法を改善し、新しい標的療法を開発するためには、軟髄膜転移の生物学をより深く理解することが急務です。これを達成するためには、LMの複雑な特徴を再現したin vivoモデルの開発が必要です。

肝臓、骨、脳などの臓器への転移とは異なり、LMは通常、原発腫瘍の診断から数年後に発症します10,11,12。同様に、自然転移のあるマウスモデルでは、LMは発生率が低く、マウスは通常他の部位での転移に屈するという事実からまれです。実験的なマウスLMモデルは、心臓内、頸動脈内、または大槽または脳室への直接注射など、さまざまな方法で作成できます。がん細胞の心臓内注射は広く使用されています^が9、多くの場合、頭蓋外腫瘍に大きな負担がかかり、LMとは無関係の死亡率を引き起こします。頸動脈^13,14を通じて腫瘍細胞を注入するなどの代替的アプローチは、広範な専門的資源を必要とし、大きな外科的切開を生じさせ、これは外傷性である。さらに、この方法は、軟髄膜ではなく、主に脳組織自体の内部での転移を引き起こし、LMモデルの確立には時間がかかり、非効率的である¹⁵。大槽への注射により、腫瘍細胞を軟髄膜腔に直接送達することができます。いくつかの研究では、このアプローチを使用してLMメカニズムを調査し、新しい治療法を評価しています^6,16,17。

この原稿では、LMで大量のマウスを迅速かつ安定して生成するための直接経皮的穿刺を含む便利な経槽マグナ注射プロトコルを紹介します。この方法は脳血液関門をバイパスするため、軟髄膜腔内の腫瘍細胞の効率的な異種移植が可能になります。また、外科的外傷と処置時間を大幅に短縮し、マウスにLMを確実に誘導します。脳実質への浸潤が最小限のLMの発生を確認し、2光子顕微鏡と組織学的解析によって確認されました。したがって、結果として得られるモデルは、LMの複雑な微小環境を忠実に再現し、疾患に関連する細胞および病理学的メカニズムを研究し、潜在的な治療法を評価するための貴重なツールを提供します。

プロトコル

この原稿のすべての動物手順は、ZJU-Laboratory Animal Welfare and Ethics Review Committee(ZJU20230155)によって審査され、承認されました。C57BL/6JおよびNSGマウスをZJU実験動物センターで特定病原体フリー条件下で取得し、飼育しました。このプロトコルは、マウス肺がん細胞株であるLewis lung cancer(LLC1)とヒト肺がん細胞株A549を使用し、どちらもGFPおよびホタルルシフェラーゼで標識されています。どちらの細胞株も、Dr. Xiang H. F. Zhang(Baylor College of Medicine, USA)のご厚意により提供されました¹⁸。ここでは、例としてLLC1セルを使用します。A549細胞の注入手順は、6 x 10⁴ 個のA549細胞をNSGマウスに注入したことを除いて、ほぼ同じです。

1. がん細胞の注射用調製

1. 10% ウシ胎児血清 (FBS) と 0.1 mg/mL ペニシリン-ストレプトマイシンを添加した DMEM で 1.0 x 10⁶ LLC1 細胞を 5% CO₂ インキュベーターで 37 °C で培養します。細胞が70%〜90%の密度に達したら、2mLの0.25%トリプシン/ EDTA溶液を使用して1分間トリプシン化します。細胞を300 x g で3分間遠心分離し、氷冷PBSで2回洗浄し、1 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に再懸濁します。
2. Trypan Blue溶液と血球計算盤¹⁹を使用して、生存細胞の濃度を評価します。細胞生存率が90%を超え、細胞の大部分が単一であることを確認してください。氷冷PBS中で細胞濃度を2 x 10⁶ 細胞/mLに調整します。
3. 細胞懸濁液50 μLを別々の微量遠心チューブに分注して、ピペッティングを繰り返さないようにします。
4. 注射の準備ができるまで、細胞懸濁液を氷上に置いておきます。このプロトコルでは、マウスあたり10μLのGFPルシフェラーゼ標識LLC1細胞を注入し、これはマウスあたり2 x 10⁴ 細胞に相当します。
   注:注入した細胞株の転移速度に基づいて、必要に応じて細胞数を調整します。

2.マウスの準備

注:この研究では、6〜8週齢の雄のC57BL / 6Jマウスが使用されました。

1. すべての手術器具と手術用ドレープが詰まった手袋をオートクレーブします。ベンチトップと非外科用機器を75%エタノールで消毒し、作業エリアを防水ドレープで覆います。
2. 処置後の回復のために、清潔な動物用ケージと保温パッドを準備します。
3. 2%トリブロモエタノール(200 mg / kg)を皮下注射することにより、マウスに麻酔をかけます。先に進む前に、ピンチテストを使用して麻酔の深さを確認してください。マウスに麻酔をかけた後、角膜の損傷から目を保護するために滅菌眼軟膏を塗布します。
4. バリカンを使用して後頭部から毛皮を剃り、続いて脱毛クリームを塗布して同じ領域の毛皮を完全に取り除きます。
5. マウスをうつ伏せにして置き、マウスの首を15 mLの遠心分離チューブにかぶせます。頭と腰をテープで固定し、後頭部とC1椎骨の間のスペースを人差し指で触診します(図1)。
6. 75%エタノールに浸した滅菌綿棒で3回拭き、続いてベタジン外科用スクラブで後頭部を消毒します。.動物の非滅菌部分を滅菌ドレープで覆います。

3.大槽注射

注:次の手順には、個人用保護具や滅菌手袋の使用など、無菌技術が必要です。

1. 細胞懸濁液を静かにピペットで取り、31G、8 mmインスリンシリンジで注射するために10 μLを吸引します。
2. マウスの後頭部とC1の間の領域を人差し指で触診し、後頭蓋骨の中央下縁にある正確な穿刺部位を特定します。必要に応じて、このサイトをマークします。
3. 特定された穿刺部位から大槽に45°〜50°の角度で針を挿入し、4mmの深さまで進めます。はっきりとした画期的な感覚は、針が大槽に正常に入ったことを示しています。
   1. 穿刺部位が見つけにくい場合は、耳の高さで3〜5 mmの小さな切開を行い、後部の正中線を露出させます。外科的切開が必要な場合は、手術の1時間前にメロキシカム(5 mg / kg /日)とブプレノルフィン(0.1 mg / kg)を皮下投与します。.
4. シリンジプランジャーを進めて細胞懸濁液をゆっくりと注入し、手をテーブルに置いた状態でシリンジを安定させます。
5. 接種後、シリンジをさらに10秒間所定の位置に保持して、頭蓋内圧を平衡化させます。.次に、針を引き出し、滅菌綿棒で穿刺部位を1〜2分間押します。

4. 注射後のケア

1. 動物を加熱パッドの上の清潔なケージに移し、完全に回復するまで注意深く監視します。
   1. 切開した場合は、ティッシュ接着剤とクリップを使用して傷口を閉じます。手術後2〜3日間、痛みを抑えて回復を助けるために、追加の鎮痛剤を投与します。
2. 処置後7日間はマウスを綿密に観察し、動物の身体活動や注射部位の周囲の様子を毎日チェックしてください。

5. 軟髄膜腫瘍の増殖評価

1. 生物発光イメージング
   1. マウスに麻酔をかけ、眼窩後静脈にD-ルシフェリン(150μg/g)を投与します。マウスをイメージングチャンバーに置き、麻酔マニホールド上の指定されたノーズコーンにマウスを配置します。動物間ではライトバッフルを使用して、信号の干渉を最小限に抑えます。
   2. IVISシステムを使用して、0.5秒から2分の間の露光時間で動物をすぐに画像化します⁶。軟髄膜腔での腫瘍細胞接種が成功したことを、頭部と脊髄を横切る分散型生物発光シグナルにより確認します(図2A)。
   3. 4日ごとに生物発光イメージングによりLMの進行を監視します。腫瘍の成長速度に基づいてイメージング間隔を調整します。
2. 組織学的解析
   1. マウスの活動性が著しく低下したか、体重が20%減少した場合はマウスに麻酔をかけ、皮膚と肋骨を切開して胸腔を露出させます。先端が鈍いカニューレを左心室に慎重に挿入し、カニューレを上行大動脈に進めます。カニューレを通して動物に20mLのPBSをゆっくりと灌流します。
   2. ハサミを使って頭を取り出し、頭蓋骨を露出させるために頭皮の正中線を切開します。周囲の軟部組織を切除します。眼窩隆起に沿って切り込み、ハサミを大孔に挿入し、組織の損傷を避けるために上向きの圧力で頭蓋骨の内面に沿って慎重に進めます。
   3. 頭蓋骨を切除し、脳をそっと取り出します。脳を4%パラホルムアルデヒドで4°Cで24時間固定し、次に15%ショ糖PBS溶液に24時間平衡化し、続いて30%スクロースPBS溶液に4°Cでさらに24時間平衡化します。
   4. 組織を最適切断温度(OCT)化合物で満たされたクライオモールドに入れ、ドライアイスで30分間²⁰保存します。
   5. OCTに埋め込まれた脳をクライオスタットを使用して厚さ10μmに切断します。切片は、さらに塗布するまで-80°Cの冷凍庫に保管してください。
   6. 脳スライド²¹でヘマトキシリン/エオシン(H&E)染色を行う。脳の端に腫瘍細胞が存在することは、転移が軟髄膜腔でのみ発生することを示しています(図3 および 表1)。
3. 2光子顕微鏡
   1. LMでマウスを麻酔します。背側の頭蓋骨表面を覆っている頭皮を鉗子とハサミで取り除きます。メスの刃を使用して、頭蓋骨の表面から細い骨膜を取り除きます。
   2. 薄くなった頭蓋骨を通してピアル血管が見えるまで、研磨ドリルで頭蓋骨を薄くします。組織接着剤^22,23で固定された三角形のヘッドピースでマウス頭部の観察領域を安定させる。
   3. 0.025mLの5%(w / v)TRITC-デキストランを眼窩下静脈に投与して、血管^{を標識します22}。
   4. イメージングウィンドウを通じて2光子顕微鏡検査を行い、軟髄膜空間を再構築します(図4)。450 nmの発光と900 nmの励起²⁴で第2高調波蛍光によって骨を検出します。507 nmおよび572 nmの蛍光シグナルをそれぞれ900 nmおよび1000 nmの励起で収集することにより、GFP標識腫瘍細胞およびデキストラン標識血管を可視化します。
4. 実体蛍光顕微鏡
   1. マウスの脳を取り出し、実体顕微鏡の下に置きます。GFP特異的フィルターセットを使用して、GFP標識細胞を可視化します(図5)。

結果

図1は、注入用のマウスの配置と穿刺部位を側面図と正面図から示しています。 図2 は、さまざまなアプローチでLMを生成するために試験された動物の代表的な in vivo 生物発光画像を示しています。GFPルシフェラーゼ標識LLC1細胞を異なる経路で動物に注入し、続いて生物発光イメージングを行った。 図2Aに示すように、大槽内注射の10日後、生物発光シグナルはマウスの脳に存在し、脊髄に沿って分布し、軟髄腔への腫瘍細胞の生着が成功したことを示しています。対照的に、腫瘍細胞の頸動脈内注射は、主に脳実質転移を生じさせ、注射後21日で軟髄膜に有意な関与はありませんでした(図2B)。心臓内注射法では、仰臥位からの生物発光イメージングでは、ほとんどの転移が頭蓋外臓器に増殖していることが示され(左)、腹臥位からの画像では、3匹のマウスともLMを発症していないことが確認...

ディスカッション

LMは攻撃的で致命的な状態です。腫瘍細胞が脳脊髄液で満たされた空間に転移すると、腫瘍細胞は中枢神経系全体に急速に播種する²⁵。これらの細胞は定着し、脳、脊髄、脳神経、および脊髄神経に侵入し、最終的には急速な神経学的悪化と最終的には死に至ります¹⁷。根底にある病態生理学的メカニズムをよりよく理解し、潜在的な治療戦略を評価するためには、軟髄膜転移における転移過程と周囲の微小環境を再現する効率的な in vivo モデルを開発することが重要です。

以前の報告では、LMは腫瘍細胞を右小脳半球に直接注入することにより、マウスモデルで誘導できることが示されている¹⁵。ただし、このアプローチでは、一部の被験者では前頭下領域または遠位脊髄に転移を生じさせないことがよくあります。最近の研究では、変異した小細胞肺がん細胞に由来する腫瘍が皮下に移植されると、潜伏期間が長くなった...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1.5mlエッペンドルフチューブ	バイオシャープ	BS-15-M-S
15ml遠心分離管	ラボセレクト	CT-002-15A
31G×8mmインスリン注射器(0.3ml)	約束された	/
研磨ドリル	グローバレビオ	GEGZ-AM1
動物用ヒートマット	ウォギー	/
クライオモールド	スーピン	SP-AB-7 x 7 x 5
脱毛クリーム	ナイル	1.00023E+11
D-ルシフェリン	ゴールドバイオロジー	ラック-1G
DMEMの	ギブコ	C11995500CP
FBSの	ギブコ	10270-106
IVISスペクトラム	キャリパー	/
ケタミン	江蘇恒瑞製薬有限公司	H20193336
最適な切削温度	さくら	4583-1
パラホルムアルデヒド	SCRの	80096618
PBSの	サービスバイオ	G4202-500MLの
ペン/連鎖球菌アムホテリシンB	ギブコ	15140122
シェーバー	ヒピドッグ	2103CGMJ3373-GQ22N526
実体蛍光顕微鏡	オリンポス	/
ストレート鉗子	ビヨタイム	FS019	オートクレーブ滅菌が必要
手術用ハサミ	ビヨタイム	FS001	オートクレーブ滅菌が必要
三角形のマウス固定ヘッドピース	超越的なビボスコープ	TVS-FDM-027
TRITC-デキストラン、MW 70000	メドケムエクスプレス	HY-158082C
トリプシン/EDTA溶液	ギブコ	25200056
二光子レーザー走査型顕微鏡	オリンポス	/
Vetbond ティッシュ接着剤	3メートル	1469SBの
キシラジン	シグマ	X1126