このプロトコルは、マウスの軟髄膜転移を強力に誘導し、外傷および頭蓋外腫瘍の負担を軽減する経皮的穿刺経路を通じて腫瘍細胞を大槽に注入する方法を説明しています。
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この記事について
サマリー
要約
軟髄膜転移(LM)は、がん細胞が脳脊髄液(CSF)で満たされた軟髄膜に広がることであり、進行性固形腫瘍のまれでありながら壊滅的な合併症です。LMの患者はしばしば予後が不良で、生存率は数週間から数か月で測定されます。LMの複雑さを正確に再現する in vivo モデルの開発は、LMの細胞および病理学的メカニズムを理解し、潜在的な治療法を評価するために不可欠です。マウスLMモデルは、通常、腫瘍細胞の心臓内、頸動脈、または大槽への注射によって作成されます。しかし、心臓内注射や頸動脈注射は、しばしば頭蓋外腫瘍や脳腫瘍にかなりの負荷をもたらし、生物発光イメージングを複雑にし、LMとは無関係の死亡率につながります。一方、従来の大槽注射は、皮膚の切開や筋肉の解剖などの侵襲的な処置が必要であり、外傷性であり、リソースを大量に消費します。ここでは、皮膚切開を必要とせずに大槽を介して軟髄膜腔に腫瘍細胞を注入するための低侵襲手術について説明します。このアプローチは、他の外科的方法と比較して、頭蓋外腫瘍の形成を減らし、外科的外傷を最小限に抑え、必要な時間と術後ケアを短縮します。重要なことに、それは一貫して最小限の脳実質浸潤でLMを誘導します、これは2光子顕微鏡と組織学的分析によって確認されています。この合理化されたアプローチは、前臨床研究におけるLMの研究のための効率的で信頼性の高いモデルを提供します。
概要
転移性疾患は、進行がん患者にとって依然として最大の課題です。軟髄膜転移(LM)とは、がん細胞が軟膜、くも膜下、くも膜下腔に広がることを指します。固形腫瘍由来の月濤腫は、肺がん(9%-25%)、乳がん(5%-20%)、黒色腫(6%-18%)1,2でますます一般的になってきていますが、これは主に生存期間の延長と診断技術の向上によるものです。がん細胞は、1)硬膜、骨、神経などの末梢構造を介した直接浸潤を含む、複数の経路で軟髄膜腔に侵入する可能性があります。2)静脈系を介した血行性の広がり。3)動脈循環からの侵入、がん細胞は開窓のある血管を通って脈絡叢に入り、続いて脳脊髄液で満たされた心室に滑り込みます3,4,5。軟髄膜腔に侵入する腫瘍細胞は、成長因子の欠乏、代謝中間体の制限、低酸素状態など、複数の課題に直面します6。しかし、適切なツールや技術がないため、腫瘍細胞がどのようにしてこれらの経路をナビゲートし、人を寄せ付けない条件を克服して軟髄膜腔にコロニーを形成するのかはよくわかっていません。放射線療法、全身治療、髄腔内注射療....
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プロトコル
この原稿のすべての動物手順は、ZJU-Laboratory Animal Welfare and Ethics Review Committee(ZJU20230155)によって審査され、承認されました。C57BL/6JおよびNSGマウスをZJU実験動物センターで特定病原体フリー条件下で取得し、飼育しました。このプロトコルは、マウス肺がん細胞株であるLewis lung cancer(LLC1)とヒト肺がん細胞株A549を使用し、どちらもGFPおよびホタルルシフェラーゼで標識されています。どちらの細胞株も、Dr. Xiang H. F. Zhang(Baylor College of Medicine, USA)のご厚意により提供されました18。ここでは、例としてLLC1セルを使用します。A549細胞の注入手順は、6 x 104 個のA549細胞をNSGマウスに注入したことを除いて、ほぼ同じです。
1. がん細胞の注射用調製
- 10% ウシ胎児血清 (FBS) と 0.1 mg/mL ペニシリン-ストレプトマイシンを添加した DMEM で 1.0 x 106 LLC1 細胞を 5% CO2 インキュベーターで 37 °C で培養します。細胞が....
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結果
図1は、注入用のマウスの配置と穿刺部位を側面図と正面図から示しています。 図2 は、さまざまなアプローチでLMを生成するために試験された動物の代表的な in vivo 生物発光画像を示しています。GFPルシフェラーゼ標識LLC1細胞を異なる経路で動物に注入し、続いて生物発光イメージングを行った。 図2Aに示すように、大槽内注射の10日後、生物発光シグナルはマウスの脳に存在し、脊髄に沿って分布し、軟髄腔への腫瘍細胞の生着が成功したことを示しています。対照的に、腫瘍細胞の頸動脈内注射は、主に脳実質転移を生じさせ、注射後21日で軟髄膜に有意な関与はありませんでした(図2B)。心臓内注射法では、仰臥位からの生物発光イメージングでは、ほとんどの転移が頭蓋外臓器に増殖していることが示され(左)、腹臥位からの画像では、3匹のマウスともLMを発症していないことが確認.......
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ディスカッション
LMは攻撃的で致命的な状態です。腫瘍細胞が脳脊髄液で満たされた空間に転移すると、腫瘍細胞は中枢神経系全体に急速に播種する25。これらの細胞は定着し、脳、脊髄、脳神経、および脊髄神経に侵入し、最終的には急速な神経学的悪化と最終的には死に至ります17。根底にある病態生理学的メカニズムをよりよく理解し、潜在的な治療戦略を評価するためには、軟髄膜転移における転移過程と周囲の微小環境を再現する効率的な in vivo モデルを開発することが重要です。
以前の報告では、LMは腫瘍細胞を右小脳半球に直接注入することにより、マウスモデルで誘導できることが示されている15。ただし、このアプローチでは、一部の被験者では前頭下領域または遠位脊髄に転移を生じさせないことがよくあります。最近の研究では、変異した小細胞肺がん細胞に由来する腫瘍が皮下に移植されると、潜伏期間が長くなった.......
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開示事項
著者は、利益相反を宣言しません。
謝辞
著者らは、この研究を通じて貴重な議論と支援を提供してくれたZhang研究室のメンバーに感謝します。W.Z.は、浙江省大学の基礎研究基金(2023QZJH60)、中国国家自然科学基金会の著名な若手研究者のための科学基金プログラム(588020-X42306/041)、および浙江大学生命科学研究所のスタートアップ基金によってサポートされています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1.5mlエッペンドルフチューブ | バイオシャープ | BS-15-M-S | |
| 15ml遠心分離管 | ラボセレクト | CT-002-15A | |
| 31G×8mmインスリン注射器(0.3ml) | 約束された | / | |
| 研磨ドリル | グローバレビオ | GEGZ-AM1 | |
| 動物用ヒートマット | ウォギー | / | |
| クライオモールド | スーピン | SP-AB-7 x 7 x 5 | |
| 脱毛クリーム | ナイル | 1.00023E+11 | |
| D-ルシフェリン | ゴールドバイオロジー | ラック-1G | |
| DMEMの | ギブコ | C11995500CP | |
| FBSの | ギブコ | 10270-106 | |
| IVISスペクトラム | キャリパー | / | |
| ケタミン | 江蘇恒瑞製薬有限公司 | H20193336 | |
| 最適な切削温度 | さくら | 4583-1 | |
| パラホルムアルデヒド | SCRの | 80096618 | |
| PBSの | サービスバイオ | G4202-500MLの | |
| ペン/連鎖球菌アムホテリシンB | ギブコ | 15140122 | |
| シェーバー | ヒピドッグ | 2103CGMJ3373-GQ22N526 | |
| 実体蛍光顕微鏡 | オリンポス | / | |
| ストレート鉗子 | ビヨタイム | FS019 | オートクレーブ滅菌が必要 |
| 手術用ハサミ | ビヨタイム | FS001 | オートクレーブ滅菌が必要 |
| 三角形のマウス固定ヘッドピース | 超越的なビボスコープ | TVS-FDM-027 | |
| TRITC-デキストラン、MW 70000 | メドケムエクスプレス | HY-158082C | |
| トリプシン/EDTA溶液 | ギブコ | 25200056 | |
| 二光子レーザー走査型顕微鏡 | オリンポス | / | |
| Vetbond ティッシュ接着剤 | 3メートル | 1469SBの | |
| キシラジン | シグマ | X1126 |
参考文献
- Wilcox, J. A., et al. Leptomeningeal metastases from solid tumors: A Society for Neuro-Oncology and American Society of Clinical Oncology consensus review on clinical management and future directions. Neuro Oncol. 26 (10), 1781-1804 (2024).
- Wasserstrom, W. R., Glass, J. P., Posner, J. B.
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再版と許可
