げっ歯類の対立的追跡行動を研究するためのリアルタイム対話システム

サマリー

ここでは、マウスモデルにおける捕食追跡行動を検出し、定量化するためのプロトコルを紹介します。このプラットフォームは、マウスの捕食性追跡行動のダイナミクスと神経メカニズムを研究するための新しい研究パラダイムを提供し、追跡行動を研究するための標準化されたプラットフォームを提供します。

要約

捕食追跡行動には、動物が獲物を捕らえるために重要な移動、学習、意思決定などの一連の重要な生理学的プロセスが含まれます。しかし、実験室で捕食追跡行動を研究するための方法とシステムはほとんどなく、特に一般的に使用される哺乳類モデルであるマウスで研究されています。この研究を制限する主な要因は、生きた獲物(コオロギなど)の制御不能性と、実験基準の調和の課題です。この研究の目標は、ロボット餌を装着したマウスの捕食追跡行動を検出および定量化するためのインタラクティブなプラットフォームを開発することでした。このプラットフォームは、コンピュータービジョンを使用してマウスとロボットベイトの相対位置をリアルタイムで監視し、ロボットベイトの動きパターンをプログラムし、インタラクティブな2次元スライダーがロボットベイトの動きを磁気的に制御してクローズドループシステムを実現します。ロボット餌は、近づいてくる空腹のマウスをリアルタイムで回避することができ、その脱出速度と方向は、さまざまな状況で捕食的な追跡プロセスを模倣するように調整できます。短期間の教師なしトレーニング(2週間未満)の後、マウスは比較的高い効率(15秒未満)で捕食タスクを実行することができました。ロボットベイトとマウスの速度や軌道などの運動学的パラメータを記録することで、さまざまな条件下での追跡プロセスを定量化することができました。結論として、この方法は捕食行動の研究に新しいパラダイムを提供し、捕食追跡行動のダイナミクスと神経メカニズムをさらに調査するために使用できます。

概要

捕食者による獲物の追跡は、生存のための闘争の鮮明なデモンストレーションであるだけでなく、種の進化の主要な推進力でもあり、自然界の生態学的バランスとエネルギーの流れを維持します^1,2。捕食者にとって、獲物を追いかける活動は、さまざまな生理学的プロセスを含む洗練された努力です。これらの過程には、捕食者を狩猟に駆り立てる動機付け^状態3、獲物を検出して追跡することを可能にする知覚能力^4,5,6、狩猟の進路を指示する意思決定能力⁷、身体的な追跡を可能にする自発運動機能^8,9、および狩猟戦略を経時的に洗練させる学習メカニズム^{10が含まれる。11}.そのため、捕食的追跡は重要かつ複雑な行動モデルとして近年注目されています。

実験室で広く使用されている哺乳類モデルとして、マウスは自然の生息地と実験室での研究の両方でコオロギを狩ることが記録されています¹²。しかし、捕食者の追跡行動を定量化する際の生きた獲物の多様性と制御不能性は、実験の再現性だけでなく、異なる実験室間での比較の交換も制限します¹³。まず、コオロギの系統は研究室によって異なる可能性があり、その結果、獲物の特性に違いが生じ、追跡行動に影響を与える可能性があります。第二に、個々のコオロギは、捕食性相互作用の結果に影響を与える可能性のある独自の特性を持っています¹⁴。たとえば、各クリケットの脱出速度が異なる場合があり、追跡ダイナミクスにばらつきが生じる可能性があります。さらに、一部のコオロギは警告距離が短い場合があり、捕食者が追跡に従事する機会がない場合があるため、追跡プロセスの欠如につながる可能性があります。最後に、一部のコオロギは、ストレスを受けると防御的で攻撃的な行動を示す可能性があり、実験データの解釈を複雑にします¹⁵。捕食者の行動の変化が獲物の防御戦略によるものなのか、それとも捕食者の行動パターンに固有のものなのかを判断することは困難です。このように、獲物の防御戦略と捕食者戦略の境界線が曖昧なため、捕食者の追跡の研究にさらなる複雑さが加わります。

これらの限界を認識した研究者たちは、実験条件を制御し標準化する手段として人工被食物に目を向けた^16,17。マウスを含む7種のげっ歯類は、人工被食者に対して有意な捕食行動を示すことが示されています¹³。したがって、制御可能なロボット餌は、捕食追跡行動の研究において実現可能かもしれません。異なる人工被食物を設計することにより、研究者は実験条件に対してある程度の制御を行うことができるが、これは生きた獲物では不可能である^18,19。さらに、少数の先行研究では、人工的に制御されたロボット魚または被食動物を使用して、魚の群れ行動と捕食を研究している15,17,19。これらの研究は、実験的研究に一貫性があり、再現性があり、操作可能な刺激を提供するというロボットシステムの価値を強調していますが、これらの進歩にもかかわらず、特にマウスのげっ歯類の行動の分野には、ロボット餌を使用して捕食者の追跡行動を検出および定量化するための専用のプラットフォームがありません。

上記の理由に基づいて、マウスの捕食追跡行動を研究するためのオープンソースのリアルタイムインタラクティブプラットフォームを設計しました。プラットフォーム内のロボット餌はリアルタイムでマウスから逃げることができ、ロボット餌は高度に制御可能なため、さまざまな脱出方向や速度を設定して、さまざまな捕食シナリオをシミュレートできます。コンピュータ上のPythonプログラムを使用して、ロボットの獲物のモーションパラメータを生成し、STM32マイクロコントローラと組み合わせてサーボモータを駆動し、ロボットのデコイの動きを制御しました。モジュール式のハードウェアシステムは、特定の実験室環境にリアルタイムで適応させることができ、ソフトウェアシステムは、実験ニーズに応じて研究目的により適したシステムや指標の難易度を調整することができます。この軽量化により、システムの有効性と携帯性の向上に不可欠なコンピュータ処理時間を大幅に短縮することができます。このプラットフォームは、次の技術的特徴をサポートしています:柔軟性と制御可能な人工獲物により、簡単な繰り返しとモデリングが可能です。自然環境での狩猟プロセスの最大限のシミュレーション。リアルタイムのインタラクションと低システム遅延。ハードウェアとソフトウェアのスケーラビリティ、およびスケーラビリティ。費用対効果と使いやすさ。このプラットフォームを用いて、マウスが様々な条件下で捕食行動を行う訓練に成功し、捕食追跡時の軌道、速度、相対距離などのパラメータを定量化することができました。このプラットフォームは、捕食的追跡の背後にある神経メカニズムをさらに調査するための捕食的追跡パラダイムを確立するための迅速な方法を提供します。

プロトコル

成体C57BL/6Jマウス(雄、6-8週齢)は、陸軍医科大学実験動物センターから提供されています。すべての実験手順は、施設の動物福祉ガイドラインに従って実施され、陸軍医科大学の動物管理および使用委員会によって承認されています。AMUWEC20210251)。マウスは、温度制御された条件(22-25°C)で飼育され、12時間の逆光/暗転サイクル(20:00-8:00の照明)と餌と水への自由なアクセスがあります。

1. リアルタイムインタラクティブプラットフォームのためのハードウェア準備

1. プラットフォーム全体の上のクロスバーにWebカメラを取り付けて、下のアリーナのマウスとロボットベイトの位置をリアルタイムで監視し、画像をコンピューターに送信します(図1A)。
2. 下部に正方形のアクリルパネル、境界としてアクリルチューブで構成される大きな円形アリーナ(直径800mm、高さ300mm)を設計します。アリーナの内壁に 4 つのアイコン (正方形、三角形、円、十字) を等間隔に配置して、視覚的な手がかりとして機能します (図 1B)。
   注意: アクリルチューブの内壁と正方形のアクリル板の表面は、不透明なステッカーで覆う必要があります。
3. 丸いネオジム磁石(直径40 mm、高さ10 mm、コオロギの長さは約2〜4 cm、長さ^4,22)と食物ペレット(5 × 0.2 mg)をロボット餌として使用します。磁石の表面に青いステッカーを貼り付けて、識別と位置を特定します。
4. アリーナの下に2次元スライダー(有効移動量1000mm)を取り付けます。別のネオジム磁石を引っ張り磁石としてキャリアに取り付けて、ロボットの餌を磁気的かつ遠隔で引っ張ります。
5. STM32ボードとスイッチング回路によって制御されるサーボモータによってプーラー磁石を駆動します。速度方向モードを使用してサーボモータを駆動すると(16,000パルスあたり75mm)、STM32ボードの出力ポートでのPWM波の周波数が速度をエンコードし、ハイレベルまたはローレベル(3.3Vまたは0V)が順方向または逆方向をエンコードします(図1C)。
   注意: スイッチング回路は 補足図1に示されており、一方のスライドの移動ともう一方のスライドの制御を同じ方法で行うために必要な速度と方向の信号接続図のみを示しています。2つのスライド制御回路のアース線は、互いに接続することができます。

2. リアルタイムインタラクティブプラットフォームのソフトウェア設計

1. メインプログラムを使用して、マウスとロボットベイトの相対位置を検出し、ロボットベイトのモーション信号をSTM32マイクロコントローラに送信します(図1D)。
2. コンピューターが Web カメラから画像を受信したら、Python 環境でフレームを処理します。
3. OpenCV²⁰ モジュール (cv2.cvtColor) を使用して、各フレームを RGB カラー モデルから HSV カラー モデルに変換します。
   注:マウスは夜行性の採餌者であり、同定の安定性のために、実験は低照度で安定した条件下で実施し、アリーナ内の一貫した照明条件を確保し、部分的な影を避ける必要があります。この実験の照度は約95ルクスでした。
4. マウスとロボットベイトのマスクイメージを、それぞれ HSV カラーモデル (cv2.inRange) の色範囲に基づいて取得します。
5. マスク画像にメディアンフィルタリングを適用して、マウスとロボットベイトの輪郭をより明確で安定させます(cv2.medianBlur)。
6. 輪郭検出機能(cv2.findContours)を使用してマウスとロボット餌の輪郭情報を取得し、輪郭領域をカバーできる最小の長方形を見つけます。この長方形の中心座標をそれぞれマウスとロボットの餌の位置として使用し、それらをTXTファイルとして保存します。
7. 各フレームのマウスとロボットベイトの位置情報をもとに、マウスの速度とロボットベイトとの相対距離を計算し、これらのパラメータをTXTファイルとして保存します。
   注:画像処理に関連する計算の時間コストを考慮すると、スクリプトの実際の処理速度は約41 fpsであり、システムはマウスとロボットの餌の動きを約24ミリ秒で検出できることを意味します。モーションコマンドの送信とモーションの検出との間のシステム遅延は59.4±7.3ミリ秒(n=8)であるため、マウスの動きとマウスによってトリガーされる獲物の動きとの間の遅延は約83ミリ秒です(コオロギの反応時間は250ミリ秒未満です²²)。
8. マウスとロボットベイトとの間の相対距離、およびアリーナ内のそれぞれの位置に応じて、ロボットベイト^21、22、23の脱出戦略を決定する。
   注意: マウスがロボット餌から比較的離れている場合(>250 mm)、ロボット餌は安全ゾーンにあると見なされます。マウスがロボットベイトに十分近いと仮定します(<80 mm、この方法の相対距離はマウスとロボットルアーの中心に基づいて決定されるため、マウスの体長(約11 cm)とルアーの直径(4 cm)に基づいてこのしきい値距離を調整しました)。その場合、捕獲が成功したと見なされ、ロボット餌は停止し、マウスは餌の餌を消費できるようになります(図2A)。直線脱出戦略では、餌がアリーナの中央領域(境界までの距離>75mm)にあり、すべての脱出方向に十分なスペースがある場合、マウスが自分自身に向かって移動している方向に移動します。逆に、餌が周囲で示されているようにアリーナの壁に近い場合(境界までの距離≤75 mm)、連続的な移動にはスペースが不足していることを意味し、アリーナの境界までの距離が長い側に90°回転します(利用可能なスペースが多い、 図2B)。ターンベースのエスケープ戦略では、ロボットベイトは90秒間隔で判断して、逃げるためのスペースを増やして横に回転します(図2C)。
9. エスケープ戦略を決定したら、Pythonスクリプトで速度信号と方向信号を別々にエンコードし、シリアルポート(ser.port = 'COM3')を介して115200ビットレートでSTM32に送信します。
   注:STM32のスクリプトはC環境でコンパイルされます。速度信号を受信すると、水晶発振器の周波数分周器によって対応する周波数のPWM波に変換され、出力されます(STM32水晶周波数は72000000です)。方向信号を受信した後、出力ポートの電圧(0または3.3V)をプルアップまたはプルダウンしてデジタル信号に変換します。
10. シリアルポートバーナーを使用して、コンパイルされたCプログラムをSTM32に書き込みます。
11. リセットプログラムを使用して、ロボットベイトをアリーナの中央に移動します。
    注:アリーナ内のロボットベイトの位置を検出することにより、ロボットベイトは中央位置(5cm / s)に向かって連続的に駆動され、センターポジションから<20 mmの距離が検出されると、アリーナの中心に到達したと見なされ、動きが停止します。メインプログラムを実行する前に、リセットプログラムを実行してください。

3. 慣れ(図2D)

1. マウスを12時間固定して、動物の体重を通常の90〜95%に減らし、この期間中は水に自由にアクセスできます。
2. まず、リセットプログラムを実行してロボットベイトをアリーナの中央に移動し、次に空腹のマウスをバッフルでアリーナの端に隔離します。
3. メインプログラムでファイルの保存パスとロボット餌の移動速度(5cm / s)を設定します。次に、[ 実行]をクリックし、ポップアップビデオウィンドウでマウスとロボットのおとりが安定して認識されるかどうかを確認します。
4. バッフルを取り外してタイマーを開始し、マウスの捕食行動を20分間観察し、マウスが最初にロボット餌から餌のペレットを取った時間を記録します。マウスがそうしないと、餌を止めて、餌をマウスの隣に置きます。
5. マウスをケージに戻し、24時間の回復期間を設け、餌と水に無料でアクセスできます。そして、慣れを繰り返します。同じ動物群内での2つの連続した試験間で最初の食物回収までの時間に有意差がない場合、慣れは完了したと考えてください。この期間は通常、3〜5回の試行が必要です。
6. 各慣れの後、75%のアルコールと水でアリーナを適切に清掃してください。

4. 捕食課題(図2D)

1. 慣れの直後に捕食タスクを開始します。
2. マウスを12時間固定して、動物の体重を通常の90〜95%に減らし、この期間中は水に自由にアクセスできます。
3. まず、リセットプログラムを実行してロボットベイトをアリーナの中央に移動し、次に空腹のマウスをアリーナの端にバッフルで隔離します。
4. メインプログラムで、ファイルの保存パスとロボット餌の移動速度(0〜60 cm / s、実験ニーズに応じてさまざまな速度を設定できます)を設定します。次に、[ 実行]をクリックし、ポップアップビデオウィンドウでマウスとロボットベイトが安定して検出されるかどうかを確認します。
5. バッフルを取り外し、タイマーを開始して、マウスの捕食行動を60秒間観察します。
   1. マウスが60秒以内にロボット餌を捕獲した場合は、メインプログラムを閉じ、マウスがケージに戻す前にすべての餌のペレットを食べられるようにします。
   2. マウスが60秒以内にロボットの餌を捕らえない場合は、報酬や罰なしにマウスを直接ケージに戻します。
6. 4時間後に2回目の捕食タスクを実行し、手順4.3〜4.5を繰り返します。
7. マウスに24時間の回復期間を与え、餌と水に無料でアクセスできます。次に、捕食タスクを繰り返します。マウスの80%以上が2回連続した試行で15秒未満しか費やさない場合、マウスは熟練した捕食者と見なされます。
8. 各捕食タスクの後、75%のアルコールと水でアリーナを適切に清掃します。

結果

捕食者から逃れるために、獲物はしばしば、脱出速度の変更や予測不可能な方向への逃走など、柔軟で可変的な逃避戦略を採用する21,22,23。本研究では、ロボットベイトの移動パターンを速度と方向に柔軟に制御することで、逃げ方向とロボットベイトの速度をそれぞれ変更し、異なる条件下での捕食課題をシミュレートすることができます。

まず、プラットフォームのコントロールの信頼性をテストし、脱出速度は0〜60 cm / sの範囲で調整可能です(コオロギの脱出速度は0〜60 cm / sの範囲と推定されました²²)。実際の速度はウェブカメラで監視し、設定速度と実際の速度の差は2%未満でした(表1)。次に、ロボットベイトの異なる脱出戦略を持ついくつかの捕食タスクを設計しました。

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ディスカッション

このプロトコルでは、低システム遅延でリアルタイム制御を実現するために、軽量で効率的なコンピュータビジョンライブラリであるOpnenCVと、マウスとロボットのおとりの位置を特定するためのカラーモデルを使用します。これには、アリーナの照明が比較的安定しており、黒いマウスの検出に干渉しないように、アリーナの影をできるだけ避ける必要があります。比較的安定した輪郭検出を得るために、実験開始前に、ロボットデコイを使用したマウスの色範囲をフィールド内のいくつかの場所でキャプチャします。さらに、マウスとロボット餌の色の範囲は、BALB/c(白色)などの他のマウス系統の研究、または捕食行動に対する食品着色料の影響での研究を満たすために変更することができます。

また、低遅延を実現するためには、結果ウィンドウを表示するだけで、保存機能がないため、ユーザーは他の画面録画ソフトを使って実験的なビデオをオフライン版に保存する必要があるという点も特筆すべき点です。キーポイントの識別には、オフライン処理バージョンのDeepLabCutを使用するこ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アクリルシリンダー	SENTAI	PMMA	直径 800 mm 高さ 300 mm 厚さ 8 mm
防振テーブル	VEOO	カスタムメイド	長さ 1500 mm 幅 1500 mm 高さ 750 mm
カメラ	JIERUIWEITONG	HF868SS	ピクセル サイズ 3 &m´3 & マイクロ;m 480P: 120 fps
カメラサポートフレーム	RUITU	カスタムメイド	最大幅 3300 mm 最大高さ 2600 mm
回路基板	WXRKDZ	カスタムメイド	長さ 60 mm 幅 40 mm 穴間隔 2.54 mm
コンピューター	DELL	Precision 5820 タワー	Inter(R) Xeon(R) W-2155 CPU NVIDIA GeForce RTX 2080Ti
DuPont Line	TELESKY	カスタムメイド	30 cm
フードペレット	Bio-serve	F07595	20 mg
プラットフォームサポートフレーム	HENGDONG	OB3030	長さ 1600 mm 高さ 900 mm 幅 800 mm
安定化電源	ZHAOXIN	PS-3005D	出力電圧: 0-30 V 出力電流: 0-3 A
丸型磁気ブロック	YPE	YPE-230213-5	直径 40 mm 厚さ 10 mm
サーボモータードライバー	FEREME	FCS860P	0.1 kw-5.5 kw SVPWM 220 VAC+10% ~-15% RS-485
スライドレール	JUXIANG	JX45	長さ 1000 mm 幅 1000 mm
角アクリル板	SENTAI	PMMA	長さ 800 mm 幅 800 mm 厚さ 10 mm
角磁気ブロック	RUITONG	N35	長さ 100 mm 幅 50 mm 厚さ 20 mm
Stm32	ZHENGDIANYUANZI	F103	STM32F103ZET6 72 MHz クロック
トランジスタ	Semtech	C118536	2N2222A、NPN