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方法論記事

インビボTurboIDに基づく近接ラベリングのDrosophila melanogasterへの応用

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DOI:

10.3791/68193

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2025年6月13日

 , 
1Soonchunhyang Institute of Medi-bio-Science, Soonchunhyang University, 2Department of Integrated Biomedical Science, Soonchunhyang University

この記事について

サマリー

この研究では、ビオチン補給や卵巣解剖から、質量分析のためのビオチン化ペプチドの導入遺伝子発現検証や濃縮までのステップをカバーする、 D. melanogaster 卵巣におけるTurboIDベースの近接標識(PL)の詳細なプロトコルを確立します。

要約

近接ラベリング(PL)は、タンパク質間相互作用ネットワークをマッピングするための強力な方法です。酵素の標識、特にTurboIDの進歩により、その使用は生物学的システム全体に広がっています。TurboIDは、その堅牢性、非毒性、および使いやすさにより、 in vivo アプリケーションにとって特に有利です。この酵素は、ビオチンの存在下で、タンパク質や核酸などの近くの生体分子を約10 nmの範囲で無差別にビオチン化します。この手法を応用して、 Drosophila melanogaster 卵巣の生殖細胞における外ミトコンドリア膜(OMM)上のpiwi相互作用RNA(piRNA)生合成の重要な因子であるズッキーニ(Zuc)のインタラクトームを調査しました。Zuc-TurboIDを生殖細胞で発現させ、ビオチンを補給することで、Zuc近位タンパク質のビオチン化を誘導しました。ビオチン化ペプチドの濃縮後の質量分析により、piRNA生合成におけるよく知られた相互作用者を含む、Zucに近接するタンパク質が同定されました。興味深いことに、タンパク質のフォールディング、膜組織化、および小胞輸送に関与するZucの新規相互作用を発見しました。

概要

アフィニティー精製質量分析(AP-MS)や酵母-2-ハイブリッド(Y2H)システムなどの従来のタンパク質-タンパク質相互作用(PPI)マッピング法では、低存在量、一過性に発現するタンパク質、または膜結合タンパク質を捕捉できないことがよくあります。この制限は、彼らが生細胞1,2,3の本来の生理学的条件を再現できないことから生じます。これらの課題を克服するために、PLは、in vivoのサブオルガネラレベルでの高解像度プロテオームマッピングのための強力な技術として浮上しています。PLは、無差別酵素とベイトタンパク質との融合を利用し、酵素が短寿命の反応性分子の形成を触媒することを可能にします1。ビオチンなどのこれらの反応性分子は、融合タンパク質4から数ナノメートル以内のタンパク質を共有結合的に標識します。その後、ビオチン化タンパク質を単離し、質量分析法で分析することで、大規模なタンパク質同定を促進します5,6。

過去数年にわたり、PL技術を進歩させるために、さまざまな無差別酵素が開発されてきました。広く使用されている2つの酵素は、大腸菌由来のR118G変異ビオチンリガーゼ(BioID)とエンドウ豆由来のアスコルビン酸ペルオキシダーゼ酵素2(APEX2)です。BioIDは、ビオチンとATPをビオチン-5'-アデニル酸(bioAMP)に変換します1。この反応性分子は、半径10 nm以内の近くのタンパク質のリジン残基±共有結合します。BioIDベースのPLの主な利点は、ビオチンの使用です。これは、生体内に天然に存在する非毒性の生体分子であり、安全なin vivo標識を可能にします6。ただし、BioIDには、標識速度が遅い(18-24時間)ことや、最適な触媒活性を得るために高温(37°C)が必要であることなど、制限があります4。これらの特性は、動的な生物学的プロセスの研究におけるその応用を妨げる可能性があります。一方、APEX2は、ビオチンフェノールおよび過酸化水素(H2O2)の存在下でビオチンフェノキシル基の形成を触媒する7。これらのラジカルは、主にチロシンのような電子が豊富なアミノ酸の側鎖と反応し、システイン、ヒスチジン、トリプトファン8にも結合することができます。ペルオキシダーゼ酵素の迅速な標識機能(< 1分)は、動的および一過性のPPIの捕捉に適しています9。さらに、ビオチンリガーゼよりも検出範囲が広く(最大20 nm)、優れています。しかし、APEX2ベースのPLには、毒性酸化剤であるH2O 2が必要であることや、ビオチンフェノールの透過性が低いことなど、欠点があり、in vivo10の適用性が制限されています。

2018年、Branonらは、BirA(大腸菌に含まれるビオチンリガーゼ)の35 kD変異型であるTurboIDと呼ばれる新しいビオチンリガーゼを開発しました4。この酵素は、R118位(R118S)の変異と、BirAに関連する他の15の変異を組み込んでいます。BioIDよりも2倍高い触媒活性を示します。TurboIDで誘導されたビオチン化を10分で行うと、BioIDによる18時間の標識に匹敵するサイズと特異性を持つプロテオミクスデータが得られます。さらに、30°C4で優れた標識活性を示します。したがって、TurboIDは、ショウジョウバエや線虫などの生物への適用により適しており、これらは一般的にそれぞれ25°Cと20°Cで飼育されます。

本研究では、TurboIDを用いたPLをショウジョウバエ卵巣のインタラクトーム研究に活用することを目指しています。ここで説明するプロトコルは、生殖細胞内のZucのインタラクトームをマッピングするために使用されます。Zucは、外ミトコンドリア膜(OMM)に局在するエンドヌクレアーゼであり、ゲノムの完全性の維持に重要な小さなノンコーディングRNAであるpiRNAの生合成を媒介します11,12,13。Zuc-TurboID解析で同定されたビオチン化タンパク質を、NES-TurboIDおよびTom20-TurboIDの2つの追加コントロールのタンパク質と比較することにより、Zucと相互作用する異なる候補を定義しました。

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プロトコル

大人のフライでの1. PL

  1. ビオチン食品の調製
    1. 10 M NaOHストックを三重蒸留水(TDW)で希釈することにより、1 M NaOH溶液を調製します。室温(RT)で保存してください。0.0049 gのビオチン粉末を20 mLのTDWに溶解して、1 Mビオチンストック溶液を調製します。1 M NaOHを150-200 μL添加して、ビオチンの溶解度を高めます。ボルテックスで溶液を均質化します。ビオチンストック溶液は4°Cで保存してください。
    2. バイアルからフライフードを取り出し、溶けるまで2分間電子レンジで加熱します。
      注:標準的なフライフードには、5%のコーンミール、3%の酵母、10%のスクロース、1%の寒天、0.3%のプロピオン酸、および0.3%の4-ヒドロキシ安息香酸メチルが含まれています13。
    3. 溶かした食品にビオチンストックを最終濃度100μMで加え、ボルテックスして混合します。ビオチンを添加した食品4.5 mLを、血清学的ピペットを使用して、各空のバイアルに直ちに分注します。30分間冷まし、バイアルにコットンキャップをかぶせ、ビオチン食品を4°Cで保存します。
      注:ビオチンは、食品が冷えて固まる前に添加する必要があります。
  2. ビオチンの供給
    1. TurboID融合タンパク質を過剰発現するトランスジェニックフライを組織または細胞特異的GAL4フライ14,15,16と交配します。ネガティブコントロールとして、GAL4ドライバーフライとクロスワイルドタイプのフライは、ビオチン化誘導がないことを確認します。
    2. 渡河後10日ほどで、子孫が孵化し始めます。ドライイーストパウダーをTDWに溶かし、攪拌して滑らかなペースト状にします。新しいバイアルの壁にラボスプーン一杯の酵母ペーストを塗ります。新しく孵化したハエが入った古いバイアルをそっと軽くたたいて、下部のハエを収集します。古いバイアルを酵母ペーストが入った新しいバイアルに反転させ、ハエが逃げないように両方のバイアルの縁が揃っていることを確認します。
    3. これらのバイアルを一緒にタップダウンして、古いバイアルから新しいバイアルの底部分にハエを移します。ハエが移されたら、新しいバイアルと古いバイアルの両方に綿のキャップをしっかりと戻します。3日間待ちます。イーストペーストはRTで数日間保存できます。
      注:ハエの転送は、ハエが一時的に気絶するだけなので、できるだけ早く行う必要があります。
    4. 250 μLのプロピオン酸ストックを50 mL TDWで希釈して、0.5%プロピオン酸溶液を調製します。RTで保管してください。
    5. 3日目 に、1 MビオチンストックをTDWで希釈して100 μMビオチンワーキング溶液を調製し、0.5%プロピオン酸500 μLを加えます。ビオチン作業溶液とドライイーストパウダーを混合し、ペースト状になるまで攪拌します。ビオチン食品バイアルの壁にラボスプーン一杯のビオチン酵母ペーストを加えます。ビオチン酵母ペーストは、RTで数日間保存することができます。
    6. ハエを2つのグループに分けます。一方のグループをコントロールとして通常の食品バイアルに保持し、もう一方のグループをビオチン食品バイアル(ビオチン酵母ペーストを添加)に移してビオチン化を開始します。ビオチン化の16時間後、移し替えはニューノーマルフードバイアルに飛んでいきます。
      注:以前にビオチン供給試験を4時間、8時間、および16時間実施しました。ビオチン化シグナルは16時間の摂食後に最も強くなったため、サブシーケンシャル実験ではこの時点を選択しました。
  3. ショウジョウバエ 卵巣コレクション
    1. ハエをCO2 フライパッドに入れ、メスを飼い、オスを捨てます。ハエが適切に麻酔された後(動かなくなった後)、冷たいGraceの昆虫培地1mLを解剖皿にピペットで移します。
    2. 先端の細い鉗子を使用して解剖皿にフライを取り、培地に浸します。ハエの胸部を鉗子で持ち、体をつぶさないように注意してください。次に、別の鉗子を使用して、後腹部(生殖器部分が位置する場所)の先端をそっと取り外します。
    3. 鉗子を使用して、卵巣をゆっくりと絞り出します(上腹部から下に向かって)。
    4. それらが出たら、卵巣を囲む筋肉ネットやその他の組織を取り除きます。卵巣を傷つけないように注意してください。
    5. 鉗子を使用して、清潔な卵巣を1.7mLのチューブに慎重に移します。チューブを氷の上に保ちます。次のハエについて手順1.3.2〜1.3.4を繰り返します。
    6. チューブを3,500 x g で4°Cで30秒間スピンダウンし、マイクロピペットチップを使用して残りの培地を取り出します。卵巣に触れないように注意してください。
    7. チューブを液体窒素で急速冷凍し、卵巣を-80°Cで保存します。 卵巣サンプルは1年間安定です。

2. ウェスタンブロットアッセイによる導入遺伝子発現とビオチン化タンパク質の検出

注:ウェスタンブロットアッセイでは、サンプルごとに約5つの卵巣ペアを収集します。

  1. 組織溶解
    1. 凍結した卵巣組織を解凍します。50 μL の RIPA 溶解バッファー (50 mM Tris-HCl pH 8、150 mM NaCl、0.1% ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)、0.5% デオキシコール酸ナトリウム、1% Triton X-100) を添加し、1x プロテアーゼ阻害剤 (PI) カクテルと 1 mM フェニルメタンスルホニルフッ化物 (PMSF) を添加します。RIPA溶解バッファー(1x PIカクテルおよび1 mM PMSFを含まない)を4°Cで保存します。
      注:PIカクテルとPMSFは、実験の直前にのみ追加する必要があります。
    2. ハンドヘルドホモジナイザーとプラスチック乳棒を組み合わせて卵巣を切断します(チューブあたり1分)。完全な溶解とそれに続く均質化を確実にするためには、氷上での10分間の組織溶解プロセスが必要です。
    3. 13,500 x g で4°Cで10分間遠心分離し、破片からタンパク質溶解物を分離します。
    4. 透明なタンパク質ライセートを新しい1.7 mLチューブにピペットで移し(上部に脂質層を取らないように)、ライセートを-20°Cで保存します。
  2. ビシンコニン酸(BCA)アッセイによるタンパク質濃度測定
    1. ビシンコニン酸(BCA)作動試薬(WR)を調製するには、試薬Aと試薬Bを50:1の比率で混合します。1 μL のライセートまたは希釈した BSA 標準試料を 200 μL の WR と 96 ウェルプレートで混合し (2 枚)、プレートを 37 °C で 30 分間インキュベートします。
      1. 次の式を使用して、必要な WR の量を計算します。
        (#標準 + #サンプル) × (#反復) × (サンプルあたりのWR量)
        タンパク質スタンダードのセットを調製するには、最終濃度が0、25、125、250、500、750、1000、1500、および2000 μg/mLのRIPA溶解バッファー(PIカクテルおよびPMSFを含まない)に2 mg/mLのウシ血清アルブミン(BSA)を数回希釈して調製します。
    2. マイクロプレートリーダーを使用して、波長495nmの吸光度を測定します。BSA吸光度値から標準曲線を作成し、タンパク質濃度を決定します。
  3. ウェスタンブロットアッセイ
    1. 電気泳動
      1. 30-50 μgのタンパク質ライセートを2x SDSローディングバッファーに加えます。TDW(必要な場合)を添加して、タンパク質濃度を2 μg/μLに、SDSの最終濃度を1倍にした後、サンプルを95°Cで10分間煮沸します。
      2. 25 mLの20x MOPSバッファーと500 mLのTDWを混合してランニングバッファーを調製し、1倍の濃度のランニングバッファーを調製します。RTで保管してください。
      3. Bis-Trisゲルのウェルを1 mLのランニングバッファー(3x)で洗い流し、Bis-Trisゲルを電気泳動チャンバーに入れます。すべてのウェルが水没するまで(± 250 mL)、チャンバーの前面を新しいランニングバッファーで満たします。チャンバーの裏側に使用済みのランニングバッファーを充填します(新しく使用したランニングバッファーの半分の容量で十分です)。
      4. サンプルをBis-Trisゲルにロードし、4 μLの染色済みタンパク質ラダーをマーカーとして使用します。電気泳動(200V、30分)を行います。カセットからゲルを取り出し、TDWですすいでください。
    2. メンブレンブロッティング
      1. 20 mLの転写バッファー(25倍ストック)と50 mLのメタノールを430 mLのTDWに加えて、転写バッファーを作製します。
      2. ブロッティングパッド、フィルターペーパー、ゲル、ニトロセルロースメンブレンからなるサンドイッチをブロットモジュールに並べます。新しいレイヤーを積み重ねる前に、ローラーを使用して気泡を取り除きます。
      3. ブロットモジュールをトランスファーチャンバーに取り付け、チャンバーに500 mLのトランスファーバッファーを充填します。タンパク質を175mAで1時間移動させます。
        注:転写バッファーは、実験前に新たに調製する必要があります。
    3. ブロッキング
      1. 5 mLのTween20ストックを45 mLのTDWに加えて、10%Tween20ストック溶液を調製します。2つのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)錠剤を400 mLのTDWに溶解します。4 mLの溶液を取り出し、10% Tween20(最終濃度0.1%)を4 mL加えて1x PBST溶液を調製します。RTで保管してください。
      2. ブロットしたメンブレンをトランスファーチャンバーから取り除き、1x PBSTですすいでください。
        注:メンブレンを異なる抗体とインキュベートする必要がある場合は、ブロッキングステップを実行する前に、予想されるタンパク質サイズに応じて清潔なステンレス鋼のブレードでメンブレンを切断してください。
      3. 遺伝子発現を調べるには、ブロッキングステップ(1時間、RT)に1x PBSTで2% BSAを使用します。1x PBSTの50 mLに1 gのBSAを加えて、2% BSA溶液を調製します。ビオチン化タンパク質の検出には、1x PBST(一晩、4°C)で3% BSAを使用してブロッキングを行います。1.5 gのBSA粉末を50 mLの1x PBSTに溶解して、3% BSA溶液を調製します。ブロッキング溶液は4°Cで保存してください。
        注:使用されるBSAは、BCAアッセイで使用されるものとは異なります。BCAアッセイ用のBSAは、BCAキットの一部です。
    4. 一次抗体のインキュベーション
      1. α-V5 1 μL を 2% BSA (1:10,000) 10 mL で希釈し、ハウスキーピング遺伝子 α-HSP90 10 μL を 2% BSA (1:1,000) で希釈します。2.7 μL のストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート (SA-HRP) を 9 mL の 1x PBST 溶液に添加して、0.3 μg/mL の SA-HRP 溶液を調製します。
      2. 遺伝子発現を調べるには、メンブレンを一次抗体と4°Cで一晩インキュベートします。 ビオチン化タンパク質を検出するには、メンブレンを4°Cで1時間インキュベートします。 一次抗体は4°Cで保存してください。 複数回使用できます。
      3. メンブレンを1x PBSTで3回、RTでそれぞれ15分間洗浄します。
    5. 二次抗体インキュベーション
      1. 2% BSA(1:5,000)10 mLにヤギ抗ウサギまたは抗マウスIgG(西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合)のいずれかを2 μL加えて、二次抗体溶液を調製します。
        注:SA-HRPの場合、二次抗体は必要ありません。視覚化の手順に直接進みます。二次抗体は、実験前に新たに希釈する必要があります。
      2. 二次抗体溶液中でメンブレンを室温で40分間インキュベートし、メンブレンを1x PBSTで洗浄し、室温で3回、各15分間洗浄します。
    6. Enhanced Chemiluminescence(ECL)法によるタンパク質検出
      1. 750 μLのルミノールと750 μLのHRP溶液を混合します(1:1の比率)。混合物を調製している間、メンブレンは洗浄バッファー内で湿らせてください。
        注:この混合物は、実験前に新たに調製する必要があります。化学物質は光に弱いため、日光やその他の強い光源から遠ざけてください(実験室の照明に短時間さらされても問題ありません)。
      2. メンブレンを溶液に30秒間浸し、透明なプラスチックシートの間に置きます。ケミドック装置でブロットしたタンパク質バンドを観察します。

3. 免疫蛍光染色による導入遺伝子の発現と局在化の検証

注:遺伝子発現と局在を確認するために、酵母ペーストを与えられた2日齢の雌からのサンプルごとに約5つの卵巣ペアを解剖します。若い卵巣は主に初期段階の卵室を含んでおり、ナース細胞(生殖細胞)が豊富にあり、それらの比較的透過性のある膜17のために免疫蛍光染色に理想的です。卵室の後期は、ステージ918から始まる卵殻複合体の形成により、より硬く浸透しにくくなります。タンパク質ビオチン化試験では、ステップ1.2で説明したように、ビオチンを与えられた生後4日目の雌からのサンプルあたり約5つの卵巣ペアを解剖します。

  1. サンプル調製
    1. 鉗子を使用して、解剖した卵巣の後部を所定の位置に保持します。別の鉗子を使用して、卵巣を個々の卵室にそっと引き離します。卵室が破裂しないように注意して作業してください。卵室単離プロトコルは、19で詳細に説明されています。卵チャンバーを1.7 mLのチューブに慎重にピペットで移し、1 mLの1x PBS(RT)で洗浄します。ピペッティングする前にピペットチップの端をカットして、卵室がチップに詰まらないようにしてください。
      注:ステージ≤9の卵室(透明なもの)のみを使用してください。成熟卵子と後期卵室を10≥捨てます。ピペッティングを行うと、卵室が溶液中に浮遊します。したがって、次のステップに進む前に、卵室を底に落ち着かせます(5分間)。
  2. 固定
    1. 3.125 mLの16%ホルムアルデヒド(FA)ストックを6.875 mLの1x PBSで希釈し、5% FA溶液を調製します。RTで保管してください。
      注意: FAは光に敏感ですので、光から遠ざけてください。
    2. 5%ホルムアルデヒド(FA)1mLを卵子の入ったチューブにピペットで入れます。チューブをマルチローテーターに置き、卵子を30分間固定します。
      注:固定から核染色ステップまで、実験は緩やかに回転するマルチローテーターで行われます。
    3. 10 mLの10% Triton X-100ストックを1x PBSの190 mLに加え、1x PBS(1x PBT)中の0.5% Triton X-100を洗浄溶液として調製します。RTで保管してください。
    4. 固定卵室を1回すすぎ、続いてRTで3回10分間洗浄します。1x PBTを1 mLをすすぎと洗浄の両方のステップに使用します。
  3. ブロッキング
    1. 1x PBTの4.75 mLに250 μLのFBSストックを加えて、5%ウシ胎児血清(FBS)を調製します。
      注:この溶液は、実験前に新たに作る必要があります。
    2. 1 mLの5% FBSをチューブに加え、RTでブロッキングステップを1時間実行します。
  4. 一次抗体のインキュベーション
    1. 導入遺伝子の発現と局在を確認するには、2 μL の α-V5 と 2 μL の α-ATP5A または α-Tom20 (ミトコンドリアマーカーとして) を 1x PBT 400 μL (1:200 比) で希釈します。
      注:2つの抗体を一緒に使用して1つのサンプルを染色することもできますが、それらの宿主は異なる必要があります。これは、その後の二次抗体の結合が重複しないようにするためです。
    2. 卵チャンバーを400 μLの希釈した一次抗体溶液でインキュベートします(一晩、4°C)。
      注:ウェスタンブロットアッセイと同様に、一次抗体は免疫染色に複数回使用できます。抗体溶液を保管する前に、卵室が含まれていないことを確認してください。
    3. 卵室を1回すすぎ、続いてRTで3回10分間洗浄します。
  5. 二次抗体インキュベーション
    1. 2 μL の Goat α-Rb IgG Alexa Fluor 488 と 2 μL の Goat α-M IgG Alexa Fluor 594 を 1x PBT (1:200 比) の 400 μL に希釈します。卵チャンバーを希釈した二次抗体溶液400 μLと室温で2時間インキュベートします。ビオチン化を検出するには、ストレプトアビジン標識Alexa Fluor 594 2 μLを1x PBT(1:200の比率)に添加し、二次抗体と一緒にインキュベートします。
      注意: このステップから、サンプルを光から保護します。二次抗体は、実験前に新たに希釈する必要があります。複数の二次抗体を併用することもできますが、シグナルの重複を避けるために、各一次抗体は異なる宿主に由来する異なる蛍光色素にも割り当てる必要があります。たとえば、488 Goat α-Rb はウサギ α-V5 に結合します。マウスα-ATP5Aについては、594 Goat α-Mを補完的な二次抗体として用いています。ビオチン化検出の場合、ストレプトアビジンコンジュゲートと同じ波長の他の色素の使用を省略する必要があります。
    2. 卵室を1回すすぎ、続いてRTで3回10分間洗浄します。
  6. 核染色
    1. 1 μL の DAPIを 1x PBS 1 mL (1:1,000 の比率) で希釈します。卵チャンバーを1 mLの希釈DAPI溶液と共に室温で5分間インキュベートします。
      注:DAPIは、実験前に新たに希釈する必要があります。
    2. 卵室を1回すすぎ、続いてRTで3回10分間洗浄します。
      注:エッグチャンバーは、マウントする前に4°Cの1x PBS溶液に数時間保存できますが、できるだけ早く進めることをお勧めします。
  7. スライド取付
    1. 糸くずの出ないティッシュでスライドガラスを拭き取り、サンプル情報を書き留めます。チューブから1x PBSを取り出しますが、乾燥を防ぐために少量残します。
    2. マイクロピペットの先端の端を切り取り、卵室をスライドガラスに慎重にピペットで移します。鉗子を使用して、スライドガラス上に卵室を慎重に分散させ、固まらないようにします。顕微鏡でスライドを観察し(2倍の倍率で十分)、卵室が均等に分布していることを確認します。
    3. マイクロピペットを使用してスライドガラスから残りのPBSを取り出します。15〜30μLの退色防止剤(感光性)をスライドガラスにピペットで移し、すべての卵室に接触することを確認します。
    4. 鉗子を使用してスライドカバーの端を保持し、スライドガラスの上に置きます(一方の端からもう一方の端に向かって)、卵室を覆うようにします。泡を避けるためにゆっくりと行ってください。余分な溶液を糸くずの出ないティッシュで拭き取り、マニキュアでカバースリップの端を密封します。マニキュアを適切に乾かします(±5分)。
    5. 共焦点顕微鏡でスライドを画像化します。スライドは-20°Cで保存してください。

4. 質量分析のためのビオチン化ペプチド濃縮

注:質量分析サンプルには約3 mgのタンパク質が必要です。したがって、約100個の卵巣ペアを解剖して、その量を求めます。

  1. 組織溶解
    1. 凍結した卵巣組織を解凍します。その間、1x Tris緩衝生理食塩水(TBS)を調製するには、1TBS錠剤を500 mLのTDWに溶解します。10% SDSストック4 mLを1x TBS16 mLの1x TBSで希釈し、溶解バッファーとして1x TBS中の2% SDSを調製します。RTで保存します。
    2. 卵巣を含むチューブに、1x TBS(1x PIカクテルを添加)中の2%SDS500μLを添加します。細胞が溶解され、溶液が粘着性に変わるまで数分待ちます。
    3. 適応焦点音響(AFA)繊維を含む1mLサイズのミリチューブにピペットで溶解します。使用前にピペットチップをカットしてください。効率的な超音波処理を確実にするために、チューブあたり最大500μLのライセートを移します。
    4. 次の条件で超音波処理を実行します:ピーク入射電力75 W、デューティ係数10%、バーストあたりのサイクル数200、時間180秒、温度6°C。
      注:サンプルを複数回超音波処理する必要がある場合は、過剰な熱が発生しないように、間隔を空けてください。
  2. アセトン沈殿物
    1. ライセートを5 mLの低結合チューブに移し、サンプル量の6倍で冷アセトンをチューブに加えます。例えば、500 μL のライセートに 3 mL のアセトンを加えます。
      注:アセトンは、使用前に-20°Cで事前に冷却する必要があります。
    2. ボルテックスチューブをマルチローテーターにロードし、-20°Cで一晩(±16時間)インキュベートします。
      注:これは停止点であり、この手順の後に実験を一時的に一時停止できることを意味します。
    3. タンパク質を15,000 x g で4°C、15分間ペレット沈殿させました。 上清を捨て、チューブを4°Cでスピンダウンします。
    4. 90%の冷たいアセトンと10%の1x TBSからなる混合溶液を2mL加え、上下に動かすようにピペットでペレットと溶液を混合します。使用前にピペットチップをカットしてください。
    5. ボルテックスチューブをボルテックスチューブにロードし、マルチローテーターにロードし、-20°Cで2時間インキュベートします。
    6. タンパク質を15,000 x g で4°Cで15分間ペレット化します。 上清を捨て、チューブを4°Cでスピンダウンします。 チューブを開き、ペレットを10分間風乾します。
      注:ペレットは後で再懸濁するのが難しくなるため、過度に乾燥させないでください。
    7. 0.7906 g ABCを20 mLのTDWに溶解して、500 mM重炭酸アンモニウム(ABC)原液を調製します。500 mM ABCストック溶液3 mLを27 mLのTDWで希釈して、50 mM ABCワーキング溶液を調製します。
    8. 50 mM ABC1 mLに0.4805 gの尿素を加えて、8 M尿素溶液を調製します。
      注:尿素溶液は、実験前に新たに調製する必要があります。
    9. タンパク質ペレットを500 μLの8 M尿素に再懸濁します。8 M尿素の量を減らすことで、タンパク質濃度を高めることができます。
    10. 再懸濁したタンパク質をAFA繊維を含む1mLサイズのミリチューブに移し、ステップ4.1.4で説明したのと同じ条件で超音波処理を行います。
    11. BCAアッセイを実施して、タンパク質濃度を決定します。このステップはストップポイントです。タンパク質サンプルは、さらに使用するまで4°Cで保存してください。
  3. トリプシン消化
    1. 5 mLの低結合チューブで3 mgのタンパク質とTDW(必要な場合)を混合し、合計500 μLの溶液を調製します。
    2. サーモブロックを使用して、450 rpmで37°Cで1時間タンパク質を変性させます。
    3. 1 M DTT(TDWに溶解)を5 μLをチューブに加えて最終濃度を10 mM DTTにした後、サーモブロックを使用して450 rpmで37°Cで1時間タンパク質を還元します。
    4. 0.0111 gのヨードアセトアミドを150 μLのABCに溶解して、400 mMのヨードアセトアミドを調製します。55 μLの400 mMヨードアセトアミドをチューブに加え(最終濃度40 mM)、サーモブロックを使用して450 rpmで37°C、1時間、タンパク質をアルキル化します。
      注:ヨードアセトアミドは光に敏感であり、すべてのヨードアセトアミド溶液は実験前に新たに調製する必要があります。
    5. 50 mM ABC溶液を加えて、総容量が4 mLに達するまでサンプルを希釈します。希釈後、溶液中の尿素濃度は約1 Mです。
    6. 1.1098 g CaCl2を10 mLのTDWに溶解して、1 M CaCl2ストック溶液を調製します。1 M CaCl2ストック4 μLをチューブに加えて最終濃度1 mMにした後、ピペットで上下させて溶液を均質化します。
    7. 1 mLのABCに0.001 gのトリプシンを加えて、1 mg / mLのトリプシンストック溶液を調製します。.150 μLのトリプシンをチューブに加えます(トリプシン:サンプル= 1:20の比率)。サーモブロックを使用して、450 rpm、37°C、16時間、タンパク質を消化します。
      注:トリプシンは実験前に新たに溶解する必要があります。このステップはストップポイントです。消化したペプチドは、さらに使用するまで4°Cで保存してください。
  4. ビオチン化ペプチド濃縮
    注:洗浄バッファーと溶出バッファーは、実験前に新たに調製する必要があります。
    1. 1x TBS溶液中に2 M尿素を調製するには、1x TBS溶液10 mLに1.2012 gの尿素を加えます。
    2. サンプル3 mgあたり150 μLのストレプトアビジン標識磁気ビーズを使用してください。ストレプトアビジンビーズを1 mLの2 M尿素1 mLで1x TBSで洗浄し、この手順を4回繰り返します。各洗浄後、チューブを磁気ラックに1分間置き、洗浄バッファーを廃棄します。
      注:Pierce Streptavidin Magnetic Beadsは、質量分析結果におけるPEG様のバックグラウンドシグナルを最小限に抑えるため、推奨されます。
    3. 消化したペプチド1 mLをビーズ含有チューブにピペットで移し、穏やかに混合した後、5 mLの低結合チューブで残りのサンプルと混合します。チューブをマルチローテーターに置き、RTで1時間インキュベートします。
    4. 混合物1 mLを1.5 mLチューブに移し、磁気ラックに1分間置きます。上清を捨てます。すべてのビーズが収集されるまで、この手順を繰り返します。
    5. 0.7207 g の尿素を 6 mL の 50 mM ABC に溶解して、2 M 尿素を 50 mM ABC に調製します。ビーズを1 mLの2 M尿素で50 mM 2xで洗浄し、1 mLのTDWで1回洗浄します。各洗浄後、チューブを磁気ラックに1分間置き、洗浄バッファーを廃棄します。
    6. 10%ギ酸原液を調製するには、1 mLのギ酸を9 mLのTDWに溶解します。TDW中に80%アセトニトリルと0.1%ギ酸からなる溶出バッファーを調製します。例えば、アセトニトリル 1.2 mL、10% ギ酸ストック 15 μL、TDW 285 μL を混合して、1.5 mL の溶出バッファーを作製します。
      注意:アセトニトリルとギ酸は揮発性があるため有害ですので、マスクを着用し、取り扱いには注意してください。
    7. 100 μLの溶出バッファーをチューブにピペットで注入し、穏やかにホモジナイズした後、サーモブロックを使用して300 rpm、60°C、5分間ペプチドを溶出します。 溶出後、チューブを磁気ラックに置き、溶出液を新しい1.5 mLチューブに移します。溶出液を移すときはビーズの採取を避けてください。この手順を5回繰り返します。
    8. 500 μL の溶出液が入ったチューブを磁気ラックに 5 分間置き、新しい 1.5 mL チューブに移してビーズを完全に除去します。溶出されたサンプルは乾燥させ、質量分析に使用することができます。
    9. 濃縮ペプチドサンプルの LC-MS/MS 分析および MS データ解析の詳細については、Nguyen et al.20 を参照してください。

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結果

出力例は、 図1、 図2、 図3、 図4 に示されており、以前にNguyenらによって公開されました20。 図1 は、 ショウジョウバエ 卵巣におけるTurboIDベースのPLの実験手順を示しています。まず、ZucとTurboIDを組み合わせたコンストラクト(Zuc-V5-TurboID)を生成しました。よく知られた明確なサブオルガネラ居住者、すなわち核輸出シグナル(NES)とトランスロカーゼ外ミトコンドリア膜(Tom20)もTurboID(NES-V5-TurboIDおよびTom20-V5-TurboID)と融合しました。NES-V5-TurboIDは、細胞質タンパク質のビオチン化に使用され、ネガティブコントロ...

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ディスカッション

ここでは、 ショウジョウバエ の卵巣におけるTurboIDベースの近接標識(PL)の包括的な手順を、さまざまな課題を克服するための広範なトラブルシューティングを通じて開発しました。重要な問題の1つは遺伝的構築物に関するもので、異なる融合レイアウトがタンパク質の発現とビオチン化効率に大きな影響を与えました。例えば、NES-V5-TurboIDは、他の導入遺伝子と比較して発現とビオチン化が弱く、下流のアッセイの解釈を複雑にすることがありました。しかし、NESをTurboIDのC末端に融合させた改良型コンストラクト(V5-TurboID-NES)では、発現効率とビオチン化効率が大幅に高いことが示されました。これらの知見は、効果的な細胞発現を達成するために、研究プロセスの早い段階で目的遺伝子(GOI)の配置を最適化することの重要性を強調しています。利用可能なバイオインフォマティクスツールを実装して、標的タンパク質とTurboID構造適合性を予測できます。あるいは、複数の導入遺伝子構成(N末端融合遺伝子とC末端融合遺伝子など)を生成して比較することも推奨されます...

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開示事項

著者は、利益相反を宣言しません。

謝辞

研究室のメンバーの議論と協力に感謝します。この研究は、韓国政府(MSIT)が資金提供する国立研究財団(NRF)の支援を受けました(RS-2024-00345327 to M.L.;RS-2023-00219563 から M.L.)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
抗体
ヤギ抗マウスIgG(H+L)二次抗体、HRPInvitrogen31430グレード、光感受性
ヤギ抗ウサギIgG(H+L)高度交差吸着二次抗体、alexa fluor plus 488InvitrogenA32731分析グレード、光感受性
ヤギ抗ウサギIgG(H+L)二次抗体、HRPInvitrogen31460分析グレード、光感受性
HSP90 抗体 (ウサギ)細胞シグナル伝達技術4874ポリクローナル抗体
Pierce ストレプトアビジンタンパク質、HRPThermo Fisher Scientific21126分析グレード
ストレプトアビジン、Alexa Fluor 594 コンジュゲートInvitrogenS11227感光性、分析グレード
V5タグ抗体(マウス)InvitrogenR960-25クローナル抗体
V5タグ抗体(ウサギ)(D3H8Q)Cell Signaling Technology13202クローナル抗体
Fly LinesstrongCompanyカタログ番号コメント/説明
pUASp Tom20 V5-TurboID/TM3韓国ショウジョウバエストックセンター2373-2フライストック
pUASp ズッキーニ V5-TurboID/Cyo韓国ショウジョウバエストックセンター2188フライストック
pUASP_attB_V5-TurboID-NES/Cyo韓国ショウジョウバエストックセンター2635-4フライストック
w[*];P{w[+mC]=matalpha4-GAL-VP16}V2HBloomington Drosophila Stock Center7062ハエストック
機器および消耗品会社カタログ番号コメント/説明
分析天びんトラー・トレドME2040.1 mg の可読性
Amersham Protran 0.45 NC ニトロセルロース ウェスタンブロッティングメンブレン (300 mm & 4 m)Cytiva
10600002-Axygen 1.7 mL MaxyClear Snaplock マイクロ遠心分離管CorningMCT-175-Cコポリマー
BRAND カバーガラス(22 mm x 22 mm)Sigma-AldrichBR470055ホウケイ酸ガラス
バルクピペットチップ(10 & micro;L)Vertex4110N00ピレン
バルクピペットチップ(1000µL)Vertex4330N00ピレン
バルクピペットチップ(200µL)Vertex4230N00プロピレン
細胞培養プレート(96ウェル)SPL300096ポリスチレン平底型
心分離機(1.5-2 mLチューブサイズローター付き)エッペンドルフ5424 R固定角冷
蔵遠心分離機(5 mLチューブサイズローター付き)エッペンドルフ5425 R角冷蔵
ケミカルスプーンステンレス製
ChemiDoc イメージングシステムBiorad12003153ウェスタンブロットイメージングシステム
CO2 フライパッド-麻酔ボード
CO2 タンク&レギュレーター-高圧ガスとめまいの注意
インキュベーターJSR JSGI-10T高の注意温度
焦点レーザー走査顕微鏡ZeissLSM 710強力なレーザービームの注意
コニカルチューブ(15 mL)SPL50015ポリプロピレン/高密度ポリエチレン 
コニカルチューブ(50mL)SPL50050プロピレン/高密度ポリエチレン 
デジタル天びん--
デジタルタイマー--
皿--シリコン
デュモン #5SF 鉗子 ファインサイエンスツール11252-00微細チップ、鋭利な物体への注意
DynaMag-2磁石Invitrogen12321D1.5-2mLサイズのマイクロ遠心分離管用
Fisherbrand スーパーフロストプラス顕微鏡スライド(25 mm x 75 mm)フィッシャーサイエンティフィ12-550-15利な物体の注意
ボトル(紙プラグ付き)ハンソルテックFFB-21010-
フライフードバイアル(コットンキャップ付き)ハンソルテックFFV-11010-
集束超音波装置CovarisM220
ルナイフInvitrogenEI9010プラスチックハンドル付きステンレス鋼
グレード 3MM Chr あぶらとら紙 (46 cm & 57 cm)Cytiva3030-917Whatmann 紙
ハンドヘルドホモジナイザーとプラスチック乳棒キンブル749540-0000コードレスモーター
ヒートブロックファインPCRALB6400高温の注意
糸くずのないティッシュYuhan-Kimberly41112-
液体窒素-傷や火傷への注意
マイクロプレート分光光度計Agilent TechnologiesEpochモノクロメーターベースの光学系
マイクロ波--高温への注意
milliTUBE 1 mL AFA ファイバーCovarisPN 520135Glass
ミニゲルタンクThermo Fisher ScientificA25977高温の注意
NuPAGE Bis-tris ミニプロテインゲル、4–12%、1.0–1.5 mm、10ウェルInvitrogenNP0323BOXポリアクリルアミドを含む、毒性注意
NuPAGE Bis-trisミニプロテインゲル、4–12%、1.0–1.5 mm、15ウェルInvitrogenNP0321BOXポリアクリルアミドを含み、毒性の注意
トブラシ (Ø 1.8 mm)Hwa hong791240-Pipetman
L (P1000L)GilsonFA10006M金属エジェクター付きシングルチャンネルマイクロピペット
Pipetman L (P200L)GilsonFA10005M金属エジェクター付きシングルチャンネルマイクロピペット
Pipetman L (P20L)GilsonFA10003M金属エジェクター付きシングルチャンネルマイクロピペット
Pipetman L (P2L)GilsonFA10001M金属エジェクター付きシングルチャンネルマイクロピペット
電源メジャーサイエンMP-310高電圧電気の注意
プログラマブルローテーターBiosanRS-24-Protein
LoBind チューブエッペンドルフ30108302-
カミソリの刃Dorco304020ステンレス鋼、鋭利な物体への注意
ローラー--
血清ピペット (10 mL)SPL91010ポリスチレン
血清ピペット (25 mL)SPL91025ポリスチレン
血清ピペット (5 mL)SPL91005ポリスチレン
血清ピペット (50 mL)SPL91050ポリスチレン
スナップ キャップ低保持マイクロ遠心チューブ (1.5 mL)Thermo Scientific3451PKポリプロピレン
スポンジ パッドInvitrogenEI9052-
実体顕微鏡ZeissStemi 508-
実体顕微鏡 ライカ
サーモミキサー CEppendorf53820000151.5 mL および 5 mL サイズのブロック付き
ピンセットAven Tools18526プラスチック、フラットチップ
ボルテックスミキサーScientific IndustriesSI-0236-XCell
II ブロットモジュールInvitrogenEI9051高温への注意
XCell SureLock ミニセルInvitrogenEI0001高温注意
化学薬品会社カタログ番号コメント/説明
セトンシグマ アルドリッチ650501分析グレード
アセトニトリルSupelco1.00029.1000LC-MSグレード、吸入毒性および可燃性
ブミン標準アンプル(0.9%生理食塩水および0.05%アジ化ナトリウムに2 mg/mLのウシ血清アルブミン(BSA)を含む)Thermo Scientific23209Pierce BCAプロテインアッセイキットの一部(Thermo Scientific、23225)
ブミン、ウシ血清BioshopALB001グレード
炭酸アンモニウムSigma-Aldrich09830分析グレードの
ビオチン Sigma-AldrichB4639細胞および組織培養グレード
塩化カルシウム (CaCl2)Sigma-AldrichC5670細胞培養グレード
Clarity ウェスタン ECL 基質Biorad1705060分析グレード
DAPISigma-AldrichMBD0015感光性、分析グレード
ジチオスレイトール (DTT)サーモフィッシャーサイエンティフィR0861分析グレード
ウシ胎児血清コーニング35-015-CV細胞培養グレード
ギ酸シグマ-アルドリッチF0507試薬グレード、吸入毒性の注意
グレース昆虫培地ギブコ11595030細胞培養グレード
インスタントドライイーストブランドなしN1019-
ヨードアセトアミドSigma-AldrichI1149感光性分析グレード
ノールCarlo Erba41484分析グレード
ニキュア-クリアタイプ
Novex Tris-glycine SDS サンプルバッファー (2X)InvitrogenLC2676分析グレード
NuPAGE MOPS SDS ランニングバッファー (20X)InvitrogenNP0001分析グレード
PageRuler 染色済みタンパク質ラダーThermo Fisher Scientific26616分析グレード
フェニルメタンスルホニルフッ化物 Thermo Fisher Scientific36978分析グレード
リン酸塩緩衝液生理食塩水Sigma-AldrichP4417分析グレード
Pierce 16% ホルムアルデヒド (w/v)ThermoFisher Scientific28908分析グレード、感光性
Pierce BCA タンパク質アッセイキットThermo Scientific23225分析グレード
Pierce BCA試薬A(炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、ビシンコニン酸、酒石酸ナトリウムを0.1 M水酸化ナトリウムに含む)Thermo Scientific23228Pierce BCAプロテインアッセイキットの一部(Thermo Scientific、23225)
Pierce BCA試薬B(4%硫酸第二銅を含む)Thermo Scientific1859078Pierce BCAプロテインアッセイキットの一部(Thermo Scientific、23225)
プロピオン酸Sigma-Aldrich402907ACS グレード
プロテアーゼ阻害剤 カクテル セット IIIカルビオケム539134細胞および組織培養グレード
スローフェード ゴールド 退色防止マウント剤InvitrogenS36936感光性
塩化ナトリウム (NaCl)BioneerC-9025分析グレード
デオキシコール酸ナトリウムシグマ・アルドリッチD6750分析グレード
ドデシル硫酸ナトリウムSigma-Aldrich71736分子グレード
水酸化ナトリウム (NaOH)BiosesangSR2018-100-00分析グレード
トリプル蒸留水-超高純度 (タイプ 1)
トリス緩衝生理食塩水Sigma-Aldrich94158分析グレード
トリスグリシン移送緩衝液Koma BiotechK0341001分析グレード
Tris-HCl、pH 8BioneerC-9006分析グレード
Triton x-100Sigma-Aldrich93443分子グレード
トリプシンThermo Fisher Scientific20233細胞培養グレード
Tween 20Sigma-AldrichP9416分子グレード
UreaSigma-AldrichU5378分子&細胞培養グレード
分析モノモノメプロプロ遠 固定 コンパクト共ポリ解剖超ック鋭フライフード超音波ゲの注意-凍 ペインス アアルアル分析重のック メタマ

参考文献

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