以下に記載するプロトコルは、特異的なレチノイド自家蛍光を利用し、蛍光活性化細胞ソーティングを採用することにより、非常に不均一な肺細胞集団からレチノイド含有細胞を単離する簡単で効果的な方法です。
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この記事について
サマリー
要約
レチノイド(ビタミンAとその代謝物)は、肺胞微小環境の必須脂質成分であり、細胞型特異的なレチノイド代謝は、発育中および成人の肺の機能的健康を維持するために必要です。肺細胞は特定の経路を利用するため、血液中の循環レチノイドをレチノール(ROH)として効率的に取り込み、その後、ROHを細胞内で段階的に転写活性なレチノイド種であるオールトランスレチノイン酸(ATRA)に変換することができます。ATRAを介した(またはレチノイドを介した)シグナル伝達は、肺胞形成、界面活性剤産生、血管新生、透過性、および免疫の調節に重要です。重要なことは、線維芽細胞を含む特定の肺細胞は、レチニルエステル(RE)の形でレチノイドを蓄積する可能性があり、それを保存したり、必要に応じてROHとしてさらに動員して隣接する細胞に移すことができます。肺レチノイド含有細胞は、レチノイド自家蛍光(350 nmでの励起に対して455 nmでの発光)を利用し、蛍光活性化セルソーティング(FACS)を使用することにより、消化された肺の単一細胞懸濁液から単離および収集できます。赤色蛍光タンパク質による肺細胞の細胞特異的 なin vivo 標識により、特定のレチノイド含有肺細胞集団を単離および収集することができます。採取した細胞は、細胞の形態、遺伝子発現、薬理学的操作に対する応答性をさらに解析するために、直接解析または培養することができます。この単離と応用の技術は、肺の健康と肺損傷の動物モデル研究にとって重要であり、肺のレチノイド代謝と脂質媒介性細胞通信の細胞的側面についてより深い洞察を得ることができます。
概要
レチノイド(ビタミンAとその代謝産物)は、肺胞微小環境の必須脂質成分であり、細胞型特異的なレチノイド代謝とシグナル伝達は、発生中および成人の肺の機能的健康を維持するために必要である1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 、12、13、14。肺細胞は特定の経路を利用し、血中循環する食事由来のレチノイドをレチノール(
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プロトコル
マウスを含むすべての記載された手順および実験は、全米科学アカデミーが作成した実験動物のケアおよび使用に関するガイド55に概説されている基準に従って、ラトガース大学の動物管理および使用委員会(IACUC)(IACUC ID:PROTO202200111)の承認を得て実施されました。
1. 実験の検討事項と準備
- 畜産と操作
注:生後3か月(10〜12週齢)の雄マウスと雌マウスを研究に使用できます。記載された実験では、C57BL/6J遺伝的背景を持つレシチン:レチノールアシルトランスフェラーゼ欠損マウス(Lrat欠損、Lrat-/-マウス56)および年齢一致同腹仔(野生型、Lrat+/+マウス)を用いた。tdTomatoレポーターカセット(B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J, Jackson Lab strain #007914) とCol1a2-CreERマウス (B6.Cg-Tg(Col1A2-Cre/ERT,-ALPP)7Cpd/2J, ジャクソンラボ株 #029....
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結果
肺レチノイド含有細胞の単離
マウス肺(Lrat+/+およびLrat-/-由来)マウスを酵素的に消化し、上記で概説した手順に従って単一細胞懸濁液を調製し、FACSに供した。細胞のソーティングとデータ取得は、SpectroFlo CSソフトウェアバージョン1.3.0で操作するCytek Aurora™セルソーターシステムで、100 μmのノズルと15 psiの圧力を使用して実行しました。まず、前方散乱光のプロット(前方散乱光の高さ/FSC-H 対前方散乱領域/FSC-A)を単一細胞(シングレット)の選択とゲートに適用し、続いて側方散乱光とSYTOX Green染色によるデッドセルの識別を行いました(図2)。最後に、レチノイド含有細胞の標的集団を選別するために、λ = 455 nmで高い自家蛍光を有する生細胞の単一細胞の異なる集団を選択しました(
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ディスカッション
ヒトおよび動物の組織におけるビタミンA検出の能力と、蛍光顕微鏡を用いたその組織学的可視化は、1940年代に初めて報告された59,60。その後、レチノイド自家蛍光の現象は、in vitroで組織中の高濃度のビタミンAの位置を特定することを目的とした研究に首尾よく適用され61、蛍光顕微鏡を用いて動物胚組織62の形態形成を特徴付けることを目的とした研究に成功した。後に観察され、実験的に確認されたのは、細胞性レチノイドの特有の自家蛍光(λ=350nmでの励起とλ=455nmでの特徴的な青緑色発光)が特定の細胞型と関連しており、したがって、これらの細胞63,64,65を単
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開示事項
著者は何も開示していません。
謝辞
この研究は、国立衛生研究所/国立心臓・肺・血液研究所 (NIH/NHLBI) R01 HL171112 (I.S.) からの助成金、ラトガース大学環境曝露・疾患センターからのキャリア開発賞 (I.S.) の資金提供を受けた国立衛生研究所/国立環境衛生科学研究所 (NIH/NIEHS) P30 ES005022 によって資金提供されました。 ラトガース大学、ニュージャージー州立大学(ISへ)からのスタートアップ資金。著者らは、Rutgers Cancer InstituteのImmune Monitoring and Flow Cytometry Shared Resource(一部はNCI-CCSG P30CA072770-5920からの資金提供を受けています)のスタッフに対し、本稿で紹介した研究への貢献に感謝の意を表したいと思います。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 10 mL血清ピペット | Avantor/VWR | 76452-284 | |
| 100 & micro;Mストレーナー  | Greiner Bio-One | 542000 | |
| 15 mL ファルコンチューブ | Corning | 352099 | |
| 40 & micro;Mストレーナー  | Greiner Bio-One | 542040 | |
| 50 mL ファルコンチューブ | Corning | 352070 | |
| 細胞培養皿、35 mm & 急性;10 mm | Corning | 430165 | |
| 細胞選別培地 | Gibco | A59688DJ | |
| コラゲナーゼタイプ IV | ワージントン生化学コーポレーション | LS004188 | |
| Cytek Aurora セルソーターシステム | Cytek Biosciences | ||
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Falcon ブランド 5 ml ポリプロピレン丸底チューブ、12 mm & 75 mm | Corning | 352063 | |
| Falcon ブランド 5 ml ポリスチレン丸底チューブ、セルストレーナーキャップ付き、12 mm &急性、75 mm | Corning | 352235 | |
| FlowJoソフトウェア | Becton Dickinson | フローサイトメトリーソフトウェア | |
| HBSS Ca2+/Mg2+ | Gibco | 14925-092 | |
| Ca2+/Mg2+ | Gibco | 14175-095 | |
| Nalgene Rapid-Flow 滅菌使い捨てボトルトップフィルター付き | ThermoFisher | 595-3320 | |
| 赤血球溶解バッファー | Sigma-Aldrich | R7757 | |
| SpectroFlo CS ソフトウェア | Cytek Biosciences | バージョン 1.3.0 | |
| サージカルデザインRoyaltekステンレス鋼外科用メスの刃フィ | ッシャーサイエンティフィック | 22-079-683 | |
| SYTOXグリーン死細胞染色 | Invitrogen | S34860 | |
| モキシフェン | マアルドリッチ | T2859 |
参考文献
- Shmarakov, I. O., et al. Retinoids stored locally in the lung are required to attenuate the severity of acute lung injury in male mice. Nat Commun. 14 (1), 851(2023).
- Bogue, C. W., Jacobs, H. C., Dynia, D. W., Wilson, C. M., Gross, I.
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再版と許可
