酵母表面表示タンパク質の酵素修飾およびフローサイトメトリー評価

サマリー

ここでは、酵母表面表示基質を酵素修飾アッセイに使用するためのプロトコールを紹介します。このプラットフォームは、代表的な酵素修飾アッセイとして、チロシンホスファターゼSHP-2の基質の1つに対する脱リン酸化活性の分析を使用して実証されました。

要約

酵母表面ディスプレイは、タンパク質機能のハイスループットスクリーニングを可能にする遺伝子型-表現型連鎖戦略です。従来、酵母表面ディスプレイは、新しい結合タンパク質の進化に適用され、フローサイトメトリーを使用して結合強度のレベルを評価し、分類してきました。最近では、基質変異体の酵素修飾をスクリーニングするために酵母表面ディスプレイを適用することへの関心が高まっています。これには、フローサイトメトリーで読み取り可能な表現型を提供する相加的(リン酸化など)または減法的(タンパク質分解など)修飾があります。このような修飾は、細胞内共局在を用いて定期的に適用されますが、表示された基質の細胞外酵素修飾を達成する能力は、さらに多くの反応を研究に引き出す可能性があります。ここでは、酵母表面に表示された候補基質に対する細胞外酵素修飾のスクリーニングアッセイを設計および適用し、その後フローサイトメトリー分析を使用して評価するための技術について説明します。これらのプロトコルは、ホスファターゼ、脱リン酸化酵母、リン酸化チロシン残基を含むディスプレイ基質のコンテキストで提供し、この適用されたフレームワークを他の酵素-基質ペアのスクリーニングアッセイの開発にどのように適応できるかについてコメントします。

概要

酵素とその標的との間の相互作用の理解は、細胞の恒常性と疾患発症を制御する経路の生物学的特性評価に必要であるため、ますます興味深い研究分野になっています^1,2。酵素は、生物学的生命を維持する多くの反応の触媒作用に関与しており、細胞代謝^3,4、シグナル伝達⁵、さらにはゲノム修復^6,7などの基本的なプロセスを制御する。これらのプロセスにおけるそれらの役割のために、それらの相互作用はまた、それらの活性の逸脱が細胞活動の深刻な調節不全を引き起こし、アポトーシスまたは有害な癌細胞の増殖を引き起こす可能性があるため、多くの疾患の発症にも役割を果たします²。酵素活性の研究は、新しい治療法^8,9の開発において重要な応用があり、各特定の酵素-基質相互作用¹⁰に合わせたアッセイが必要とされている。これらの相互作用の評価と特性評価のための標準プロトコルとして、複数の酵素アッセイが確立されています。酵素的相互作用を解析するために開発されたアッセイは、活性化/阻害のための結合をモニターする検出アッセイ¹¹または酵素による基質修飾をモニターするアッセイ¹²に分類される。

酵素の主要な役割の1つは、細胞の振る舞いを調節することです。シグナル伝達、すなわち細胞外^{トリガー13}に対する細胞の細胞内応答は、細胞の生存と機能に関与している。細胞の増殖、分化、その他多くの機能プロセスはすべて、それらを支配する酵素的相互作用を伴うシグナル伝達経路に関与しています^14,15。酵素は翻訳後修飾を触媒し、細胞外メッセージの正しい伝達に関与する大規模なシグナル伝達ネットワークをしばしば調節する¹⁶。タンパク質のリン酸化は、最も一般的な翻訳後修飾であり、細胞シグナル伝達や他の複数の細胞経路に遍在しています。その結果、プロテインキナーゼは、その重要な調節的役割により、潜在的な治療標的のかなりの割合として浮上しています¹⁷。ホスファターゼは、リン酸ベースの細胞シグナル伝達複合体^18,19の天然調節分子であり、標的タンパク質²⁰からリン酸残基を除去する能力を有する。過去10年間で、ホスファターゼは、複数の細胞型における下流のシグナル伝達経路の調節に関与していることから、がん治療²¹および炎症性疾患²²の主要な治療標的となった。プロテインキナーゼとホスファターゼは、共に幅広い相互作用を提供し、特定の酵素アッセイプロトコルの開発を通じて研究することができます。

酵母表面ディスプレイは、酵素活性^23,24の特性評価および評価のためのツールとして使用されてきた。これは、小胞体隔離戦略^25,26と組み合わせた場合の翻訳後修飾プロセスのスクリーニングのためのハイスループットプラットフォームを提供する。これにより、キナーゼ-基質ペアは、KDEL受容体²⁷への結合を通じて小胞体内で共局在し、保持することができ、キナーゼとその標的との間の近接性により、基質のリン酸化が増加する速度で起こり得る。KDEL受容体の結合は、C末端FEHDEL小胞体保持配列によって媒介され、他のHDEL配列^25,28よりも強い保持能力を有することが示されている。次いで、リン酸化基質を酵母表面に固定し、その後のフローサイトメト^リー29による評価を行う。現在、酵母表面上に示される基質の酵素修飾について確立された一般化可能なプロトコルはありません。私たちは、細胞外に発現するリン酸化基質変異体を利用し、既知のホスファターゼによる脱リン酸化によってそれらを修飾することにより、酵母表面ディスプレイの能力を拡大します。フローサイトメトリー解析は、既知のホスファターゼとのインキュベーションの結果としてのリン酸化中央値の変化を測定することにより、前述の基質の表現型評価のためのプラットフォームを提供します。これにより、表面ディスプレイタンパク質の翻訳後修飾に適応可能な方法を提供すると同時に、酵母表面ディスプレイプラットフォームを使用する際の相互作用の酵素修飾分析の方法も提供されます。

酵母表面ディスプレイプラットフォームへのキナーゼ-基質相互作用の導入、発現したリン酸化基質と組換えホスファターゼとの共インキュベーション、およびその後のフローサイトメトリーによる脱リン酸化活性の解析を説明する酵素修飾アッセイの開発と応用のための技術を紹介します。本報告では、酵母小胞体においてCD28の細胞質ドメインをリンパ球キナーゼ(LCK)と共局在化し、続いて酵母表面にリン酸化CD28を表示し、その後、Srcホモロジー領域2ドメイン含有ホスファターゼ-2(SHP-2)による脱リン酸化を行うことで、これを達成した。さまざまなペプチド配列中のリン酸化チロシン残基を検出するPAN抗ホスホチロシン抗体(本研究では4G10)を用いて、ホスファターゼ処理の関数としてのリン酸化レベルの定量化を行います。詳細なプロセスは、酵素と基質の相互作用を調査するための一般化可能なアプローチを提供します。精製された方法で酵素と基質を研究する将来の方法。

プロトコル

1. プラスミドを保有する酵母の細胞増殖とタンパク質発現誘導

1. 表1に記載されているレシピに従って、非プラスミド含有酵母(YPD)、プラスミド含有酵母細胞増殖(SD-CAA)、タンパク質発現誘導(SRG-CAA)、およびSD-CAAプレートの増殖に必要な培地を調製します。
2. キナーゼ-基質ペアを含む酵母ディスプレイプラスミドDNAを、リチウムカチオンベースの方法^30,31を通じてEBY-100酵母細胞に形質転換します。これは、さまざまなメーカーの酵母形質転換キットで一般的に採用されています。
   注:エレクトロポレーション³² または他の好ましい酵母プラスミド形質転換技術は、形質転換されるプラスミドコンストラクトに応じて使用することができる。
3. 10 mLのYPD培地を含む14 mLの培養チューブを調製します。EBY-100細胞を接種し、30°C、300rpmの振とうインキュベーターで培養物が0.8-1.0(8 x 10⁶- 1 x 10⁷細胞/mL)の光学密度(OD_600nm)に達するまで増殖させます。
   注:OD_600nm は、それぞれの培地に酵母培養物の1:10希釈液を含む3mLサンプルキュベットと、サンプル希釈に使用する培地を含む3mLブランクキュベットを調製することによって測定されます。分光光度計のOD_600nm プログラムは、最初にブランクキュベットを測定し、次に各サンプルに対応する希釈を設定して各サンプルキュベットを測定するために使用されます。1 OD_600nm は1 ×^{10 7} 酵母/ mLに相当します。
4. 培養物を1,000 x g で3分間遠心分離して細胞を回収し、酵母形質転換キットに付属の1^回目の 洗浄液、またはTE(10 mM Tris-HClおよび1.0 mM EDTA)³¹で洗浄します。
5. 細胞を再び1,000 x g で3分間ペレット化し、酵母形質転換キットに付属の形質転換バッファー1 mLまたは滅菌水に再懸濁します。細胞は50μLのアリコートに分注し、-80°Cで最大6ヶ月間保存することができます。
6. プラスミド形質転換では、プラスミド1個につき1アリコートを調製し、氷上で解凍した後、酵母ディスプレイコンストラクトを含む0.5〜1.5μgのプラスミドDNAを細胞に直接添加します。酵母形質転換キットで提供される0.5mLの形質転換溶液、または滅菌50%ポリエチレングリコールおよび0.1MLiOAc溶液³¹の0.5mLを添加する。細胞、プラスミドDNA、形質転換溶液の混合物をピペッティングで完全に混合します。
7. 形質転換混合物を30°Cで30〜60分間静的にインキュベートし、ボルテックス混合物を15分間隔でインキュベートします。1,000 g× gで3分間遠心分離して細胞を回収します。
8. 4.5 mLのSD-CAA培地を含む14 mLの培養チューブを調製します。目的のプラスミドを含む細胞を500 μLのSD-CAAに再懸濁し、調製した4.5 mLを接種します。
9. 寒天に穴を開けないように注意しながら、接種した培養液50 μLを5 mLをSD-CAAプレートに分配し、30°Cで48時間静的にインキュベートして、形質転換効率を決定します。
10. 5 mLのSD-CAA細胞培養液を振盪インキュベーターで30°C、300 rpmで少なくとも18時間インキュベートします。16時間後および20時間後の光学密度(OD_600nm)を監視します。サンプルが6を超えない十分な光学密度まで成長したら、培養物を2,500 × gで3分間遠心分離します。酵母ペレットを乱さずに上清を捨てます。
11. SRG-CAA中の酵母ペレットを最終外径_600nm (<1 ×^{10 7} 酵母/mL)未満に再懸濁します。
12. 酵母培養物を30°C、300rpmの振盪インキュベーターで少なくとも8時間、24時間以内でインキュベートします。
    注:酵母細胞におけるタンパク質発現の誘導は、20-37°Cの範囲で変化させることができる。30°Cはキナーゼ/基質対^29,33の合成に適しているが、研究対象の特定のタンパク質に必要と思われる場合は調整することができる。
13. 外径_600nm を測定して、細胞密度を決定します。
    注:この時点で、酵母培養物を4°Cで保存することにより、プロトコールを停止することができます。

2. 4G10抗ホスホチロシン抗体のビオチン化

1. PEG4-NHS-ビオチンの2 mgバイアルを、滅菌PBS680 μLを加えて最終濃度5 mMに再懸濁します。
   注:PEG4-NHS-ビオチンの再懸濁は、ビオチン化反応が行われる直前に新たに行う必要があります。NHSは水溶液中で加水分解します。滅菌PBSおよびバイアルの使用は、長期保存用の試薬の調製や、試薬の生存率や実施される高感度アッセイに対する汚染物質の潜在的な影響を軽減するための細胞ベースのアッセイでの使用に重要です。
2. 4G10抗体濃度に基づいて、100 μgの抗体を滅菌済みの1.7 mLバイアルに加えます。
3. ステップ2.1で調製した5 mM PEG4-NHS-ビオチン100 μgを保持したバイアルに1 μLを添加し、ビオチンと抗体のモル比を7.5:1にします。混合物を穏やかにピペットで動かして、反応を均質化します。
4. 反応を室温で少なくとも2時間一定回転させてインキュベートします。
5. 0.5 mL スピン脱塩カラムの製造元のプロトコルに従って、ビオチン化 4G10(B-4G10)のバッファーを PBS に交換します。
   注:分子量カットオフ(MWCO)が7 kDaの脱塩カラムは、抗体のビオチン化に一般的に使用され、未反応のビオチンやその他の低分子を除去しながら、より大きな抗体を保持することができます。
6. B-4G10抗体をPBSA(PBSと1 g/Lウシ血清アルブミン)で最終濃度1 μMに希釈します。B-4G10抗体を少量に分注して、凍結融解サイクルの繰り返しを防ぎます。
   注:ビオチン化抗体は、4°Cで保存し、最大3ヶ月間毎日使用できますが、効率を大幅に損なうことはありません。使用しない残りのアリコートは、-20°Cで最大2年間保管してください。

3. 酵母細胞表面に発現する基質の脱リン酸化

1. 文献³⁴に前述したように、2倍作業緩衝液を調製する。
   注:必要な成分の測定を容易にするために、2倍をお勧めします。
2. ステップ 3.1 1:2 で調製した 2x バッファー溶液を脱イオン水で希釈することにより、1.7 mL バイアル中のサンプル用のワーキングバッファーを調製します。
   注:各サンプルの総反応量は20μLで、各サンプルには10μLから18μLの作業バッファーが必要です。すべてのサンプルまたはコントロールに十分な作業バッファーを準備します。
3. 表2に記載されている推奨サンプル調製に従って、1.7 mLバイアルに対応するコントロール名またはサンプル名をラベル付けします。
4. ステップ1.9で測定したOD_600nm に基づいて、各サンプルの対応する酵母培養物から200万個(2 × 10⁶)酵母細胞を回収するために必要な培養量を計算します。
5. 前のステップで計算した酵母培養液の量を、各サンプルの1.7 mLバイアルに加えます。
6. バイアルを4,500 × gで1分間遠心分離します。マイクロピペットで上澄みを丁寧に取り除き、バイオハザード廃棄物として捨ててください。
7. ペレット化した細胞を1 mLのPBSAに再懸濁し、 ステップ3.6を繰り返します。
   注:ペレット化された細胞を乱さずに、できるだけ多くの上清を除去することが重要です。
8. そのストック濃度に基づいて、20 μLの総反応容量で最終濃度が1,000 nMになるために必要な組換えヒトSHP-2の容量を計算します。
   注:組換えSHP-2は、各アッセイで使用されるタンパク質が2回以上の凍結融解サイクルを経ないように、少量で分注する必要があります。アッセイのためにすべてのサンプルが準備された後にアリコートから残ったSHP-2は廃棄する必要があります。
   組換え酵素のストック濃度は、ロット番号によって異なります。組換えSHP-2は、通常、0.2〜0.4 mg / mLのストック濃度で調製されます。SHP-2のストック濃度が0.324 mg/mLの場合、これは4.696 μMのストック濃度に相当します(SHP-2の分子量は69 kDa)。20 μLの反応でSHP-2ストックを4.26 μLすると、最終反応濃度は1,000 nM SHP-2になります。
9. 15 mLの円錐形に調製した10 mLの脱イオン水に7.7 mgのDTTを加えて、5 mM DTT溶液を調製します。装置の制限によりミリグラムの秤量が困難な場合は、10 mLの脱イオン水に0.77 gのDTTを加え、100倍希釈してアッセイに使用する5 mM DTT溶液を作成します。
   注:DTT溶液は、利用可能な装置を使用してミリグラムスケールの量を測定することができない場合に、5 mMに希釈するために高濃度のストック溶液で調製することができます。DTT溶液は、加水分解の傾向があり、水で希釈すると長期間にわたって不安定になるため、ワーキングバッファーで細胞の再懸濁に先立って新鮮に調製する必要があります。
10. ステップ3.2で調製したワーキングバッファーにペレット化した細胞を再懸濁し、各サンプルまたはコントロールの最終反応量が20 μLになるようにします。
    注:添加するワーキングバッファーの量は、各サンプルに含まれるDTT(2 μL)およびSHP-2(ステップ3.8で計算)の量に基づいて計算する必要があります。
11. ステップ3.9で調製した5 mM DTT溶液2 μLを各サンプルまたはコントロールに添加し、最終反応濃度を0.5 mM DTTにします。
12. ステップ3.8で計算したSHP-2の容量を各サンプルに加えて、最終容量を20μLにし、マイクロピペットを使用して穏やかに混合します。
13. サンプルバイアルの蓋をパラフィルムで包み、漏れや相互汚染を防ぎます。
14. サンプルを37°Cで2時間、ローター上で一定速度でインキュベートします。
15. ローターからサンプルを取り出し、各サンプルに1 mLのPBSAを加えて反応を停止します。
16. 手順3.6を繰り返します。

4. 脱リン酸化基質の細胞標識とフローサイトメトリー解析

1. ステップ 3.16 のサンプルを 、表 2 に記載されているように、対応する一次試薬の 20 μL 混合物に再懸濁します。サンプルを室温で20分間インキュベートします。
   注:使用されるすべての試薬濃度は、酵母細胞の表面に発現するタンパク質の数に対して過剰であると計算されています。この計算は、サンプル³⁵中のすべての2×10⁶酵母から10,000タンパク質/細胞が発現すると仮定しているが、通常はそのうちの~50%しか発現していない。表3は、表2で表される各試薬の過剰標識試薬比率を次のように計算したものである。
   
2. 4,500 × g でサンプルを1分間遠心分離し、上清をバイオハザード廃棄物として廃棄します。
3. 1mLのPBSAに再懸濁して細胞を一度洗浄します。手順4.2を繰り返します。
4. 表2に記載されているように、対応する二次試薬の混合物である20 μLにサンプルを再懸濁します。光が当たらない状態でサンプルを15分間インキュベートします。
5. 手順4.2を繰り返します。
6. 手順4.3を繰り返します。
7. 洗浄したサンプルを300〜500 μLのPBSAに再懸濁し、5 mLのポリスチレンチューブに移して、適切なフローサイトメーターを使用してすぐに分析します。
   注:サンプルを輸送する必要がある場合は、濡れた氷の上に置いてください。推奨されませんが、サンプルは湿ったペレットとして4°Cで最大2時間保存できます。
8. 新しい実験に必要なサイトメーターの起動と準備を行った後、File(ファイル)メニュー内のNew Experiment(新規実験)ボタンをクリックし、実験に名前を付けてSave(保存)をクリックし、取得したデータが目的のファイルパスに保存されていることを確認します。
9. 上部ツールバー内のドットプロットアイコンを選択して、実行するサンプルごとに2つ以上のドットプロットを作成します。ドットプロットの 1 つで、X 軸名を選択して FSC-A チャネルを表示し、Y 軸名を選択して SSC-A チャネルを表示します。このプロットは、側散乱光 - 面積と前方散乱 - 面積を示しており、さらなる分析のために酵母細胞をゲートするために使用されます。
10. 別のドットプロットで、X軸の名前を選択して、一次抗エピトープタグ抗体を標的とする二次試薬が蛍光を発するチャネルを表示します。Y軸名を選択すると、ストレプトアビジン二次試薬が蛍光を発するチャンネルが表示されます。このプロットは、酵母細胞として横方散布図と前方散布図プロットからゲートされたイベントのみを表示し、Y軸にチロシンリン酸化、X軸に基質表面発現を表示するために使用されます。
    注:この例では、一次抗エピトープタグ抗体を標的とする二次試薬はFITC(AF-488)チャネルで蛍光を発し、ストレプトアビジン二次試薬はAF-647チャネルで蛍光を発します。使用されるチャネルは、標識中に使用される一次試薬および二次試薬によって異なる場合があります。
11. 各サンプルチューブをサイトメーターのチューブホルダーにセットし、サイトメーターの[Run]を選択して、サンプルのロードとデータの取得を開始します。必要に応じて、表示するイベント、記録するイベント、記録する時間、およびサンプル流量を調整します。
12. ステップ4.9で作成したSSC-A対FSC-Aのプロットで健康な酵母細胞を囲むゲートを定義します。 図 1 は、適用するゲーティング戦略の説明的表現を示しています。
    注:SSC-A対FSC-Aのプロットでは、定義された酵母ゲート内で100,000のイベントを表示し、50,000のイベントを記録することが、さらなる分析のために十分なデータを視覚化して収集するための適切なガイドラインです。一重項酵母に対して選択するためのより厳密なゲーティング戦略は、最近報告された³⁶のように、前方散乱高さと前方散乱面積のプロットに基づいて適用することができる。 図1 に示すゲーティング戦略は、スキャッターゲーティングによる一重項および一部のダブレット酵母を含む、それほど厳密でないアプローチに対応しています。
13. フローサイトメトリーアナライザーを使用して、すべてのコントロールサンプルの蛍光を記録します。コントロールサンプルは、以下のステップ4.14で説明するように、ゲーティング戦略を定義するために最初に定期的に収集されます。
14. 処理したサンプルを分析する前に、ステップ4.10で作成したプロットのゲーティング戦略を定義します。 図 1 は、適用するゲーティング戦略の説明的表現を示しています。
15. フローサイトメーターとステップ4.12および4.14で定義されたゲーティング戦略を使用して、脱リン酸化サンプルの蛍光を記録します。
16. フローサイトメトリー解析ソフトウェアを使用して取得したフローサイトメトリーデータを解析します。
17. 表面でタンパク質を発現する細胞のY軸中央値と、サンプルとコントロール間で非表示細胞によって提供されるベースラインリン酸化を測定および比較することにより、脱リン酸化を評価します。リン酸化差の中央値の割合を次のように計算します。
    

結果

1,000 nM SHP-2 なし(図 1A)および(図 1B)の 1,000 nM SHP-2 を 2 時間インキュベートしたモデルシステムの個々の複製からのフローサイトメトリー解析では、リン酸化差の中央値は 63.6% であり、これは、表面に表示されたすべてのイベントからの Y 軸中央値(リン酸化)から、処理されたサンプルと未処理のコントロールとの間の非表示イベントの Y 軸中央値として定義されるベースラインリン酸化シグナルを差し引いた比として定義されますプロトコルのステップ 4.12 で定義されています。中央値を分析する前に、サンプルはサイズ(前方散乱)と複雑さ(側散乱)に基づいてゲート化され、健康な細胞グループを包含していました。定義された条件下では、サンプルの脱リン酸化は一目瞭然で区別できるはずです(図1C)。

このアッセイは、4つの主要な方法からなる簡単な手順で定義されます(

ディスカッション

提示されたプロトコルは、酵母表面上のタンパク質の細胞外ディスプレイを使用して酵素相互作用の分析を可能にします。使用される表面表示プラスミドに小胞体隔離を組み込むと、細胞内相互作用が発生するように設計できるため、酵素と翻訳後修飾基質との間の特定の相互作用を細胞外で分析する能力が導入されます^27,29。酵母表面ディスプレイを用いた以前に確立された酵素相互作用アッセイは、細胞内における目的タンパク質の発現を含み、表面ディスプレイは、標的タンパク質23,25,29間で起こる細胞内相互作用を検出するためのツールのみである。

このプロトコルは、標的となる酵素相互作用を細胞外環境に移動することにより、そのプラットフォーム上に構築...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1 Lメディアボトル	Corning	06-414-1D
1.7/2.0 mL マイクロチューブ	Axygen	MCT-175-C
10 & micro;L SureOne ピペットチップ	フィッシャーサイエンティフィック	02-707-438
1000 & micro;L SureOne ピペットチップ	Fisher Scientific	02-707-408
12 mL ポリスチレン丸底チューブ	Greiner	07-000-212
3 mL プラティックキュベット	ブランド	759076D
300 & micro;L SureOne ピペットチップ	Fisher Scientific	02-707-411
5 mL 血清ピペット	Fisher Scientific	13-678-11D
酸性カゼイン (カサミノ酸)	Fisher Scientific	BP-1424-500
分析天びん	メトラー・トレド30243397
学用ペトリ皿	Corning	Falcon 351008
バイオセーフティキャビネット	Labconco	Logic Class II, Type A2  302310102
Biospectrometer	Eppendorf	Kinetic 6136000010
ウシ血清アルブミン	フィッシャーバイオ試薬	BP1600-100
クエン酸	フィッシャー サイエンティフィック	A940-500
CytoFLEX フローサイトメトリーアナライザー	Beckam Coulter	Cytoflex C09745	CytExpert ソフトウェア
Dextrose	Fisher Scientific	D16-1
ジチオスレイトール	Fisher バイオ試薬	BP172-5
ロバ抗ヤギ FITC	Invitrogen	A16000
EDTA	Alfa Aesar	H56165.30
Ez-Link PEG4-NHS-Biotin	Thermo Scientific	A39259
冷凍EZ酵母形質転換IIキット	Zymo Research	T2001
ガラクトース	フィッシャー サイエンティフィック	BP656-500
汎用冷蔵庫	マーベル サイエンティフィ	MS24RAS4RW
ヤギ抗 myc タグ抗体	ベチル	A190-104A
ミクロチューブ遠心分離機	Eppendorf	5425 R 5406000313
ミニ低温冷蔵インキュベーター	Fisher Scientific	15-015-2632
マウス抗ホスホチロシン抗体 4G10	BioXcell	BE0194
パラフィルム M	Bemis	M PM999
リン酸緩衝生理食塩水	フィッシャーバイオ試薬	BP399-500
ピペットコントローラー	Eppendorf	easypet 3 4430000018
ラフィノース	Thermo Scientific	J21060-36
組換えヒト活性 SHP-2 タンパク質	R&D Systems	1894-SH
冷蔵遠心分離機	エッペンドルフ	5910 R
サッカロミセス セレビシエ 酵母表面表示株 EBY 100	ATCC	MYA-4941
シェーカー インキュベーター	エッペンドルフ	M1335-0002 ニューブランズウィック イノーバ 42
シングルチャンネルピペットセット	エッペンドルフ	05-403-151
塩化ナトリウム	フィッシャーサイエンティフィ	S671-500
クエン酸ナトリウム二水和物	フィッシャーサイエンティフィック	S279-500
リン酸ナトリウム二塩基性七水和物	ッシャーサイエンティフィ	S373-500
リン酸ナトリウム一塩基性一水和物	フィッシャーサイエンティフィック	S468-500
ストレプトアビジン Alexa Fluor 647	Invitrogen	S32357
トップローディング天びん	メトラー トレド
トリス塩酸塩	EMD ミリポア	648317-100GM
チューブ リボルバー ローテーター	フィッシャー サイエンティフィック	11-676-341
計量ペーパー	Fisher Scientific	09-898-12B
酵母窒素ベース	BD Difco	291940
ゼバ スピン脱塩カラム	サーモサイエンティ	89883