このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

方法論記事

Solanum nigrumにおけるAgrobacterium tumefaciensによる遺伝的形質転換

908 回視聴

⸱

DOI:

10.3791/68212

⸱

2025年6月24日

 ,  ,  ,  ,  , 
1College of Agriculture and Life Science, Liaocheng University

この記事について

サマリー

この記事では、 Agrobacterium tumefaciens がトランスジェニック Solanum nigrumを産生するための遺伝子形質転換法の詳細なプロトコルを提供します。

要約

Solanum nigrumは、ジャガイモとトマトの孤児のナス科の親戚であり、その新鮮な果実は栄養価が高く、おいしいベリーです。S. nigrumの全植物を薬として使用することができます。しかし、野生のS.nigrumにはいくつかの望ましくない特性があります。幸いなことに、遺伝子工学技術、特にCRISPR/Cas9のような遺伝子編集技術は、これらの欠陥に対処することにより、S. nigrumを迅速に改善する貴重な機会を提供します。ほとんどの植物では、遺伝子編集技術による植物の改良は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスを介した遺伝子形質転換によって達成されます。この記事では、S. nigrumのA. tumefaciensによって媒介される遺伝子形質転換プロトコルについて詳しく述べました。S. nigrumの実生の子葉と胚軸は、遺伝子組み換えのための外植片として利用されました。S. nigrumはカナマイシンに耐性があるため、DsRed遺伝子をトランスジェニック植物を同定するための視覚的マーカーとして使用しました。S. nigrumの遺伝子形質転換は、これらの操作プロトコルに従って効率的に完了することができます。T1トランスジェニック植物の検出は、PCR同定を必要とせずに、赤色蛍光を発するかどうかによって直接同定できます。

概要

Solanum nigrum(ブラックナイトシェード、2n = 6x = 72)は、ジャガイモとトマト1のナス科の親戚です。果実は球形のベリーで、熟すと黒くなります。みずみずしい果実は栄養価が高く、美味しいベリーです。S. nigrumの全植物は、うっ血を分散させ、腫れを軽減し、熱を清め、解毒する効果があり、薬として使用できます。S. nigrumは、一般的なコレステロール前駆体から、葉に含まれるステロイド性サポニンと果実に含まれるステロイド性グリコアルカロイド(SGA)という2つの異なるクラスの特殊代謝産物を合成します。S. nigrum由来のステロイド性サポニンであるウトロシドBは、最近、米国食品医薬品局(FDA)によって肝細胞がん2の治療薬として承認されました。S. nigrumのGAME15遺伝子のノックアウトにより、植物はサポニンとステロイド性アルカロイドの両方を欠くことになり、ステロイド性サポニンが深刻な農業害虫を防除することも明らかになりました2。S. nigrumのポリフェノールは、脂肪細胞と脂質代謝に影響を与えることにより、体重と体脂肪を減らします3。S. nigrumはカドミウムを濃縮することができ、カドミウム濃縮を研究するためのモデル植物として使用されています4,5。S. nigrumは未栽培の植物であり、その研究基盤は比較的弱いです。近年、S. nigrumの研究が徐々に増加していることは刺激的です。六倍体S.nigrumのゲノムは最近組み立てられており、S.nigrumはその二倍体Solanum americanum(2n = 2x = 24)から進化した可能性があります6,7。したがって、S. nigrumは薬用価値と食用価値の両方を持つ植物です。S. nigrumの研究は、ヒトの病気の治療におけるその潜在的なアプリケーションのより深い理解に貢献するだけでなく、農業生産の強化に関する貴重な洞察を提供します。したがって、S. nigrumにおける遺伝子形質転換システムの確立は、トランスジェニックおよび遺伝子編集技術による遺伝的改良の基礎となります。

Agrobacterium tumefaciensを介したS. nigrumの遺伝的形質転換に焦点を当てたいくつかの報告があります8,9,10,1 1.これまでの研究では、S. nigrumに対してA. tumefaciens LBA4404媒介遺伝子形質転換系を確立し、AcMYB110をS. nigrumに形質転換して、アントシアニン含量が増加したS. nigrumの新しい生殖形質を得ました1。トランスジェニックおよび遺伝子編集されたS. nigrum植物は、A. tumefaciens EHA105を介した遺伝子形質転換10で得られた。異なる蛍光タンパク質は、緑色、赤色、黄色、オレンジ色、および青色の蛍光発光を有し、細胞の生命活動を示すために広く使用されている12。植物の遺伝子形質転換過程では、遺伝子組み換え事象と非遺伝子組換え事象を区別するためのレポーター遺伝子として赤色蛍光遺伝子がよく用いられる13。DsRed遺伝子をレポーター遺伝子として使用すると、トランスジェニックイベントの簡便な識別が可能になるが、一方、R2R3-MYB転写因子をレポーター遺伝子として使用すると、植物の遺伝子型に影響され得る14。トランスジェニック子孫では、トランスジェニック植物は、光学機器(蛍光顕微鏡やイメージングシステムなど)を使用して非トランスジェニック植物と容易に区別することもできるため、PCRベースの同定が不要になります。蛍光タンパク質レポーター遺伝子をCRISPR遺伝子編集技術と統合することにより、トウモロコシの生殖能力遺伝子が正確に欠失し、その結果、核滅菌ラインと制御された核滅菌メンテナーライン15が作成されました。メンテナー植物の自家受粉と結実は、メンテナーと無菌系統の1:1の子孫を生み出します。異なる発光特性に基づいて、メンテナおよび無菌系統種子の非破壊選別は、目視または機械認識15を通じて達成することができる。したがって、蛍光タンパク質遺伝子をレポーター遺伝子として使用すると、PCR分析を必要とせずにトランスジェニック種子または植物の同定が容易になります。これは、遺伝子形質転換の分野における大きな利点を表しています。この方法は、赤い蛍光遺伝子であるDsRedをレポーター遺伝子として使用して、S. nigrumにおけるAgrobacterium tumefaciensを介した遺伝子形質転換のプロトコルを記述することを目的としています。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

1.無菌苗栽培

注:次の手順は、スーパークリーンベンチで実行されます。

  1. 中国の聊城市で S.nigrum の野生の種子を収集し、Snlc1と名付けます。 S. nigrum の野生の種子50個を取り、2mLの遠心分離チューブに入れます。5%ジベレリン1mLに30分間浸した後、ジベレリン溶液を廃棄します。
  2. 75%エタノール1mLを加え、1分間振とうしてからエタノールを捨てます。
  3. 2%次亜塩素酸ナトリウム溶液1mLを加え、種子の表面を10分間消毒します。遠心分離管をよく振って、種子の表面を滅菌します。10分後、次亜塩素酸ナトリウムを廃棄します。
  4. 種子を滅菌水で5回洗浄して、残留次亜塩素酸ナトリウムを取り除きます。1/2 MS固体培地が入った直径90 mmのシャーレに種子を入れます。プレートを植物成長チャンバー内で、25°Cで明光16時間/暗8時間の光周期で培養します(図1A)。

2. A. tumefaciens LBA4404の文化

  1. パラメータ:電圧1800 V、静電容量25μF、抵抗200 Ω、キュベット1mmのパラメータを持つMicroPulserによるエレクトロポレーションにより、赤色蛍光遺伝子DsRed2に抱かれたバイナリベクトルpRed130516をA. tumefaciens LBA4404に変換します。固体LB培地で50 mg/Lカナマイシンと50 mg/Lリファンピシンを入れ、28°Cで48時間培養します。
  2. pRed1305を含むLBA4404のクローンを1つピックアップし、50 mg/Lカナマイシンと50 mg/Lリファンピシンを含む1 mLの液体LB培地で、180 rpm、28°C、28 °C、12時間、テーブル濃縮器で15 mL遠心チューブで培養します。
  3. 同じ抗生物質を含む50 mLの液体LBを1 mLの細菌溶液に加え、200 rpmのテーブル濃縮器で28°Cで6時間培養します。
  4. 細菌培養液のOD600 が0.4になったら培養を停止し、2200× g で細菌溶液を25°Cで10分間遠心分離します。
  5. 遠心分離した細菌を感染液(IS:M519 4.43 g/L、ショ糖30 g/L、6-BA 2 mg/L、AS、100 μmol/L、pH 5.8)で再懸濁し、分光光度計で細菌溶液濃度をOD600=0.6に調整します。

3. A. tumefaciensによる外植片感染

注:次の手順は、スーパークリーンベンチで実行されます。

  1. 苗の子葉が広がるまで、種子を7日間育てます(図1B)。菌性ISを湿らせた濾紙を敷き詰めた培養皿に、苗から長さ約1cmの子葉と胚軸2本を、殺菌した鋭利なメスで切り取り、一次根を捨てます。メスを使用する際は注意が必要です。
  2. 外植片を感染溶液に30分間注入します。外植片を乾いた濾紙の上に置いて、外植片の表面の細菌溶液を吸収させます。
  3. 外植片をIS固体培地(0.7%寒天; 図1C)。外植片を光のない19°Cの植物成長チャンバーに入れ、3日間培養します。

4.外植片の区別

注:次の手順は、スーパークリーンベンチで実行されます。

  1. 19°Cの植物成長チャンバーから外植片を拾い上げます。 滅菌水を使用して外植片を5回洗浄し、乾燥した滅菌済みの濾紙に外植片を置きます。
  2. 外植片をシュート分化(SD)培地(SD:M519 4.43 g / L、ショ糖30 g / L、6-BA 2 mg / L、ZT 0.5 mg / L、Cef 100 mg / L、炭水化物100 mg / L、0.7 g / L寒天、pH 5.8)に入れ、25°Cで4週間培養します(図1D、E)。
  3. 赤色蛍光を示す外植片のカルス/芽を、手持ち型蛍光灯の緑色励起光の下でメスで切り取り、新しいSD培地に移し、25°Cで4週間培養します(図1F、G)。

5.発根と移植

  1. 赤色蛍光を示す芽を手持ち蛍光灯で切り取り、発根培地(RM:M519 4.43 g/L、ショ糖30 g/L、6-BA 2 mg/L、ZT 0.5mg/L、Cef 100 mg/L、炭水化物 100 mg/L、0.7 g/L 寒天、pH 5.8)に移し、25°Cで2〜4週間培養して根の産生を促進します。
  2. 根長が2cmを超える赤色の蛍光を示す苗を土壌に移植します(図1H-K)。移植する前に、根の中の細菌の過度の増殖を避けるために、手で根から寒天を取り除きます。

6. PCR増幅による遺伝子改変T0植物の試験

  1. セチルトリメチル臭化アンモニウム(CTAB)法17を用いて、独立したトランスジェニック系統のゲノムDNAを抽出します。
  2. 7.5 μL の 2x PCR Master Mix と 0.3 μL の各プライマー (10 μmol/L) を含む 15 μL の反応容量で、10 ng のゲノム DNA をテンプレートとして使用して、プライマーセット、RedF (5'-TGGCCTCCTCCGAGAAC-3') および RedR (5'-CGGAGGGGAAGTTCACG-3') で DsRed 遺伝子を増幅します。予想されたDNA断片は393bpでした。PCR 産物を 1% アガロースゲル電気泳動にかけ、トランスジェニック植物であるかどうかを判断します。

7. 蛍光灯によるT1世代のトランスジェニック植物の同定

  1. 完全に黒紫色に変色した S.nigrum のT0トランスジェニック植物の果実を収穫し、果実の中の種子を手で絞り出します。種子を室温で約1週間自然乾燥させます。
  2. このプロトコルのステップ1.1〜1.4に従って、乾燥させた種子を1/2MS培地で培養し、植物成長チャンバーに1週間置きます。トランスジェニック苗と非トランスジェニック苗をハンドヘルド蛍光灯で区別します。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

Agrobacterium tumefaciensによって媒介される遺伝子形質転換 によるトランスジェニックS.nigrumの産生。
S. nigrumの子葉と胚軸にA. tumefaciensを感染させた後、DsRedをレポーター遺伝子として用いたため、Agrobacteriumの感染が成功したかどうかを判断できた。感染後3-4週間後に創傷部位に赤色の蛍光が現れ(図1D、E)、これはアグロバクテリウムの感染が成功したことを示している。赤色の蛍光はほぼすべての外植片で観察され、アグロバクテリウムの感染率は100%に達しました(

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

これまでに、A. tumefaciensによって媒介されるS. nigrumの遺伝的形質転換法が、異なる研究室で確立されてきた8,9,10,11。これらの形質転換法のほとんどは、選択物質としてカナマイシンを使用します8,9,10,11。しかし、S. nigrumはカナマイシンに感受性がありません。したがって、選抜には高濃度のカナマイシンが必要であり、これは非正の形質転換体10...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

この研究は、聊城大学研究基金(318012028)と山東省自然科学基金会(ZR2020MC034)の支援を受けました。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
2X SanTaq PCR Master Mix (with Blue Dye)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. (2X SanTaq PCR Master Mix (with Blue Dye)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.)B5320612X SanTaq PCR Mixには、MgCl?、dNTP、Taq DNAポリメラーゼ、PCRバッファー、ローディング色素、PCRエンハンサーが含まれています。
6-BASangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.C14819266人工サイトカイニン
寒天天津大濁化学試薬パートナーシップ エンタープライズ(リミテッドパートナーシップ)CAS NO:9002-18-0Solids
ASSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.K914BA0002Agrobacterium
CarbSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.抗生物質
CefSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.I526BA0010抗生物質
ジベレリンSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.K514BA0009発芽を促進する
kanamycinSangon Biotech(Shanghai)Co.、Ltd.I614BA0013抗生物質
LB培地三言生物科(上海)有限公司B540113 Grow the bacteria
MicroPulser ( Gene Pulser Xcell)Bio-Rad, US617BR1 06783Gene Pulser Xcell
MS solid mediumphytotech Co., Ltd., USHCA0519228A ムラシゲ&ビタミン、M519
プラスチックボックスLiaoSu、中国T909H植物植栽ボックス
rifampicinSangon Biotech(上海)有限公司とSkoogS180305抗生物質
ショ糖Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.CAS番号:57-50-1   炭素源として
Tanon-5200Multi machineTanon Co., Ltd., China5200MultiAccelerated separation
wild Solanum nigrumは、聊城市
ZTでJ921BA0014植物成長調整剤
(上海)の効率的な発現を誘導種子の基礎媒体収集されました。

参考文献

  1. Wang, X., et al. Ectopic overexpression of AcMYB110 causes significantly increased content of anthocyanins in Solanum nigrum. Biologia plant. 67, 200-203 (2023).
  2. Boccia, M., et al. A scaffold protein manages the biosynthesis of steroidal defense metabolites in plants. Science. 386 (6728), 1366-1372 (2024).
  3. Peng, C. H., et al. Solanum nigrum polyphenols reduce body weight and body fat by affecting adipocyte and lipid metabolism. Food Funct. 11 (1), 483-492 (2020).
  4. Wang, J., et al. Influence of Cd toxicity on subcellular distribution, chemical forms, and physiological responses of cell wall components towards short-term Cd stress in Solanum nigrum. Environ Sci Pollution Res. 28 (11), 13955-13969 (2021).
  5. Wang, J., et al. Comparative cytology combined with transcriptomic and metabolomic analyses of Solanum nigrum L. in response to Cd toxicity. J Hazardous Mater. 423, 127168(2022).
  6. Lee, E. S., et al. Engineering homoeologs provide a fine scale for quantitative traits in polyploid. Plant Biotech J. 21 (12), 2458-2472 (2023).
  7. Lin, X., et al. Solanum americanum genome-assisted discovery of immune receptors that detect potato late blight pathogen effectors. Nat Genetics. 55 (9), 1579-1588 (2023).
  8. Bhattacharya, A., et al. Engineering gibberellin metabolism in Solanum nigrum L. by ectopic expression of gibberellin oxidase genes. Plant Cell Rep. 31 (5), 945-953 (2012).
  9. Chhon, S., Jeon, J., Kim, J., Park, S. U. Accumulation of Anthocyanins through Overexpression of AtPAP1 in Solanum nigrum Lin (Black Nightshade). Biomolecules. 10 (2), 277(2020).
  10. Park, S., et al. Rapid generation of transgenic and gene-edited Solanum nigrum plants using Agrobacterium-mediated transformation. Plant Biotech Rep. 14 (4), 497-504 (2020).
  11. Peng, W., et al. A convenient, reliable and directly visual selection marker for identifying transgenic lines of Solanum nigrum. Plant Cell Tiss Organ Cult. 152 (2), 369-375 (2023).
  12. Schlechter, R. O., et al. Chromatic Bacteria - A Broad Host-Range Plasmid and Chromosomal Insertion Toolbox for Fluorescent Protein Expression in Bacteria. Front Microbio. 9, 3052(2018).
  13. Hao, H., et al. High-efficiency Agrobacterium-mediated transformation of Lotus corniculatus using DsRed2 positive selection and vermiculite-based rooting method. Plant Cell Tiss Organ Cult. 156 (2), 58(2024).
  14. Fan, Y., et al. a novel and user-friendly reporter for convenient, non-destructive, low cost, directly visual selection of transgenic hairy roots in the study of rhizobia-legume symbiosis. Plant Meth. 16 (1), 94(2020).
  15. Qi, X., et al. Genome Editing Enables Next-Generation Hybrid Seed Production Technology. Mol Plant. 13 (9), 1262-1269 (2020).
  16. Fan, Y., et al. A fast, simple, high efficient and one-step generation of composite cucumber plants with transgenic roots by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. Plant Cell Tiss Organ Cult. 141 (1), 207-216 (2020).
  17. Schenk, J. J., Becklund, L. E., Carey, S. J., Fabre, P. P. What is the "modified" CTAB protocol? Characterizing modifications to the CTAB DNA extraction protocol. Appl Plant Sci. 11 (3), e11517(2023).
  18. Li, Q., et al. An Improved and Simplified Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation Protocol for Solanum nigrum with a Shorter Growth Time. Plants. 13 (15), 2015(2024).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

タグ

CRISPR Cas9DsRed

この記事は公開されました

動画は近日公開

お問い合わせ
図書館に推薦する

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。