方法論記事

発育中および成熟 シロイヌナズ ナ種子中の胚乳細胞層の顕微鏡分析のための無傷組織の調製

DOI：

10.3791/68217

⸱

2025年5月16日

 ,  , 
1Department of Life Sciences, School of Agriculture, Meiji University, 2Organization for the Strategic Coordination of Research and Intellectual Properties, Meiji University, 3Plant Functional Biotechnology, Agro-Biotechnology Research Center, Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、 シロイヌナズ ナの種子における胚乳細胞層の無傷のサンプルの調製について説明しています。この方法では、注射針や精密鉗子などの一般的な実験装置のみが必要で、発生中の種子と成熟した種子の両方の胚乳細胞の高分解能蛍光生細胞イメージングが可能になります。

要約

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シロイヌナズナの種子では、胚と精巣の間に位置する生細胞の単層である胚乳が、種子の成熟、休眠、および発芽を調節する上で重要な役割を果たします。無傷の胚乳細胞の顕微鏡分析は、細胞および分子レベルでの胚乳の生理学的機能を理解するために不可欠です。しかし、シロイヌナズナの種子のサイズが小さく、精巣の下に胚乳細胞層が位置しているため、サンプル調製は困難でした。この記事では、発育中の種子と成熟した種子の両方で顕微鏡観察と分析に適した無傷の胚乳細胞層サンプルの調製について詳しく説明します。この方法により、固定や切片作製を必要とせずに、広い領域と多数の無傷の胚乳細胞を観察することができます。さらに、このプロトコルでは、注射針、精密鉗子、実体顕微鏡などの標準的な実験装置のみを使用します。このアプローチにより、無傷の胚乳細胞における緑色蛍光タンパク質(GFP)などの蛍光シグナルの高分解能生細胞イメージングに成功しました。この方法により、さまざまなシロイヌナズナ変異体の胚乳細胞におけるさまざまなタンパク質の細胞内局在と移動、およびオルガネラの形態を観察できます。このプロトコールは、新しい胚乳機能の解明に貢献し、この必須組織の細胞および分子研究の可能性を広げます。

概要

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植物は固着生物であるため、種子の発芽はその運命を決定する重要なイベントです。発芽の決定は、一次種子の休眠レベル、温度、光強度と波長、窒素濃度1,2,3,4,5,6などの内部要因と環境要因の両方によって厳密に規制されます。種子は、複数の組織型からなる複雑な構造を有する7。シロイヌナズナの乾燥種子では、苗に成長する胚が単層の胚乳と最も外側の層である精巣に囲まれています。精巣は死んだ細胞の複数の層で構成されていますが、胚と胚乳は乾燥した種子でも生き続けています。胚乳は一般に、胚の成長に栄養を供給する貯蔵組織と見なされており、精巣とともに、根茎の突出8,9,10,11,12,13に対する機械的耐性を付与する。

最近のいくつかの研究は、胚乳が最適な種子発芽を調節する上で重要な役割を果たすことを実証している14,15,16,17。例えば、胚乳細胞の光受容体フィトクロムB(PHYB)は、赤色光(R)または遠赤色(FR)光を検出し、発芽応答を調節する15。胚乳は温度感知組織としても機能し、高温下での発芽応答を抑制します16。胚乳の品質管理は、特に長期保存種子17において、最適な種子の発芽にとって重要である。

胚乳の生理機能をさらに解明するためには、生細胞イメージングが必要とされています。蛍光タグ付きタンパク質を発現する無傷の胚乳細胞の顕微鏡分析により、胚乳が種子の発芽を制御する分子メカニズムを調べることができます。しかし、顕微鏡観察のために無傷の胚乳細胞を調製することは、特に シロイヌナズナ の種子では困難です。種子の直径は約0.4mmで、胚乳は胚と精巣の間に位置する単一細胞層であるため、精密な操作は困難です。その結果、その重要な生理学的役割にもかかわらず、胚乳は生細胞イメージングを使用して観察されることはほとんどありませんでした。

この記事では、発生中の種子と成熟した種子の両方で生細胞イメージングに適した無傷の胚乳細胞層サンプルを迅速に調製するためのプロトコールを紹介します。

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プロトコル

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この研究では、生きた胚乳細胞層サンプルの調製について、種子の開発用と成熟種子用の2つの異なる手順が確立されました。精巣の固さによって、若干異なるアプローチが必要です。使用した試薬や機器の詳細は 、資料表に記載されています。

1. 発育中の種子からの無傷の胚乳サンプルの調製

  1. シリックのコレクション
    1. シロイヌナズナの植物を土や岩羊の上で咲くまで育てます。
    2. 全開の花に色付きの糸で印を付けます(開花後0日、DAF0)。
      注:緑、黄色、または茶色の糸を使用して花をマークすることは、これらの色が成長または成熟した植物やシリックと区別するのが難しいため、避けてください。
    3. 椎弓根でマークされた発育中のシリックを切り取り( 図1(1)を参照)、1.5mLチューブに集めます。
      注:12-16 DAFからのシリクの現像は、このプロトコルを使用した調製に適しています。
  2. 発育中の種子の解剖
    注意: 次の手順は、サンプルを乾燥から保護するために、濡れた濾紙で実行する必要があります。操作は実体顕微鏡下で行う必要があります。
    1. 2つの鉗子を使用して、バルブ( 図1(2)を参照)をリプラム( 図1(1)に示)から分割します:1つは保持用の厚い先端があり、もう1つは引き裂くための鋭い先端があります)。
    2. 種子の損傷を避けるために、先端を閉じた鉗子を使用して、シリックから発育中の種子をそっと拾います(図1(2))。
    3. 種子を鉗子で墜落さず保持し、睾丸と胚の周囲に約0.2mmの大きさの傷跡を注射針(27G、0.40mm、19mm)で瘢痕×造成します(図1(3))。
      注:傷跡を作るのに最適な場所は、子葉と根の接合部です。
    4. 鉗子で種子をつまんで胚を押し出します(図1(4))。精巣と胚乳からなる空の種子封筒をつぶさず、丸い形を維持しようとしてください。
    5. 傷跡の空のシードエンベロープに注射針を挿入し、内側から外側に突き刺します(図1(5))。
    6. 針を所定の位置に保持し、先端を閉じた状態で鉗子を使用して睾丸の表面を引っ掻き、空の種子封筒の片側を切って開きます(図1(6))。
    7. 先端が鋭い鉗子を使用して、空のシードエンベロープをシートに開きます(図1(7))。ここで、サンプルは胚乳層と精巣層からなる二重層シートとして分離する必要があります(図1(8))。
      注:以下のステップ3で封入剤として水を使用するとサンプルが丸まりやすい場合は、シート状のサンプルを2つに分割します。約18DAFでシリクから収穫された種子(この段階では、精巣は茶色ですが、まだ完全には乾燥していません)もこのプロトコルを使用して処理できますが、種子は調製前に数分間吸収する必要があります。

2. 成熟種子からの無傷の胚乳サンプルの調製

  1. 成熟種子の吸収
    1. 乾燥シ ロイヌナズ ナの種子が入った1.5mLのチューブに1mLの再蒸留水を加えます。
    2. 種子を室温で少なくとも40分間吸収しておきます(図2(1))。
      注:乾燥した種子と吸収から40分以内の種子は、精巣と胚乳に傷をつけること、およびステップ2.2.1および2.2.2で空の種子エンベロープを損傷することなく種子の内部から胚を除去することは困難ですが、吸収時間が長いほど操作が容易になります。
    3. 1000 μLのマイクロピペットを使用して、吸収した種子を湿った濾紙に移します。
  2. 成熟種子の解剖
    注意: 次の手順は、サンプルを乾燥から保護するために、濡れた濾紙で実行する必要があります。操作は実体顕微鏡下で行う必要があります。
    1. 種子を鉗子で挫折させずに保持し、注射針を用いて胚を囲む精巣と胚乳に約0.2mmの大きさの傷跡をあけます(図2(2))。
    2. 鉗子で種子をつまんで胚を押し出します(図2(3))。精巣と胚乳を含む空の種子封筒をつぶさないでください。丸い形を保つようにしてください。
    3. 空のシードエンベロープの上部と下部を注射針で切断して、円柱状に成形します(図2(4))。
    4. 円筒形の空の種子封筒を中心軸に沿って切り取り、2つに分けます(図2(5))。サンプルは、胚乳層と精巣層からなる二重層シートとして分離する必要があります(図2(6))。

3. 顕微鏡観察

  1. 胚乳サンプルをシート状にしてスライドガラスに置き、水またはパーフルオロデカリン(PFD)にマウントします。
    注:サンプルとカバーガラスの間に気泡が残っている場合、葉18,19などのエアポケットを含むサンプルのイメージングに特に有用であると報告されているペルフルオロデカリン(PFD)が有用です。PFDは表面張力が最も低いことが知られているため、サンプル表面の空気空間を簡単に埋めることができます。ただし、タイムラプスイメージングでは、成熟した種子の水分含有量が細胞の流動性を維持するために豊富である必要があるため、封入剤として水を使用することをお勧めします。
  2. カバースリップをサンプルの上にそっと置きます。胚乳層がカバーガラスに面していることを確認します。
    注:マニキュアまたはグリースを使用してカバースリップの端をシールし、サンプルと封入剤の乾燥を防ぐことができます。

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結果

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図1に示すプロトコルを使用して、胚乳サンプルは、14 DAFでシリックから収穫された発育中の種子から調製されました(この段階では、精巣はまだ緑色です)。広い領域にわたる多数の胚乳細胞とその細胞内構造が観察されました(図3A)。この実験では、C末端でGFPと融合したPHYBを発現するシーズ(PHYB-GFP)を使用しました。PHYBは赤色光による活性化により核に移動し、光体(PB)として知られるPHYB陽性のスペックルを形成し、これが種子の発芽に関与することはよく知られている4,20,21,22。サンプルは、22°Cの連続白色光条件下で栽培された植物から収穫されました。 図3Bに示すように、核内のPBは胚乳細...

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ディスカッション

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種子の発芽における胚乳の役割は、遺伝子発現解析や脂質および植物ホルモンの定量化など、分離種子組織を用いた遺伝学的および生化学的解析を通じて明らかにされている9,14,25,26,27。空の種子エンベロープ(胚乳および精巣)を異なるシロイヌナズナ変異体から単離された胚と組み合わせたin vitro種皮寝床アッセイにより、発芽過程の根底にある分子メカニズムが明らかになった14,15,16,28。

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開示事項

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著者らは、競合する金銭的利益がないことを宣言します。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

35Sプロモーターが駆動するPHYB-GFPを発現する phyB 変異体を提供してくださった京都大学の松下博士と岡博士に感謝いたします。本研究の一部は、科学研究費補助金新学術領域研究「提案研究領域研究」の支援を受けて行われました(19H05713 to K.Y.)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1.5 mL マイクロ遠心チューブWatoson Bio Lab131-815C
カバーガラス (18 x 18 mm)松波硝子工業株式会社C218181
DDW付
水 ろ紙 No.526 (400×400mm)アドバンテックベトナム株式会社02453400 
元気くん せる 千陽 淀 こぷ N-150 (55L)カタクラ&ス生協アグリコーポ植物成長用土壌
ガラス (26mm×76mm)松波硝子工業株式会社S1215
Grodan AO 36 x 36 x 40 mm キューブ植物Grodanロックウール
 はさみプレミアムプラス 日本株式会社FC-0212
ジュエラーズ鉗子、デュモン No. 5 (4 1/4 インチ)DumontF6521
ライカ アプリケーション スイート X (LAS X) Sterallis 8 Leicaライカ
;顕微鏡用浸漬油超低自家蛍光THMOIL-10LF
LIOR精密鉗子 110mm SL-14ケニス株式会社鉗子KN33450438nbsp;
ネイルホリックコーセーマニキュア
針27G 3/4(19 mm)RB 三沢メディカル工業株式会社
ニチペットエア1000uLチリョウ00-NAR-1000A1000;L マイクロピペット
パーフルオロデカリンAPOLLO SCIENTIFICPC5960
赤色光・遠赤色光LEDパネル立垣会株式会社10147599
シャッペスパン #60株式会社富士クススレッド
SPINKOTE 潤滑剤 2 オンスBECKMAN COULTER306812グリース
Sterallis 8ライカ共焦点レーザー 走査顕微鏡
実体顕微鏡 Stemi 305 cam WCarl Zeiss NTS Ltd.491903-0017-000
白色光 LEDパナソニックFL40SSW/37
取用レーション スライド成長アイリス用 を引き裂くための鉗子;Microsystems  用 ソフトウェア浸漬油 保持用&ニµを切断するためのインジェクションニードル実装用試薬 東京

参考文献

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