経口β-アミノプロピオニトリルおよび皮下アンジオテンシンII注入により誘発された胸部大動脈解離のマウスモデル

サマリー

このプロトコルは、マウスの胸部大動脈解離の誘導のための詳細な段階的な手順を提供します。具体的には、β-アミノプロピオニトリルとアンジオテンシンIIの必要用量の正確な計算、浸透圧ポンプの充填手順、浸透圧ポンプの移植技術などが含まれます。

要約

胸部大動脈解離術(TAD)は、効率的な治療が不足している致死性の高い心血管疾患です。TADの病態生理学の動物モデルの複製は、TADの内因性メカニズムを研究するために不可欠です。マウスのβ-アミノプロピオニトリル(BAPN、不可逆的で経口活性なリシルオキシダーゼ阻害剤)によって誘導される広く使用されているTADモデルには、成功率が一貫していないという制限があります。このプロトコルでは、経口 BAPN と皮下アンジオテンシン II (Ang II) 注入の組み合わせによって誘発された TAD の報告された修正マウス モデルについて詳しく説明します。BAPN投与の4週間後、Ang IIの注入を24時間行った後、ヒトTADと同様の特性を持つマウスモデルが確実に誘導され、TADモデル構築の成功率が大幅に向上しました。経口BAPNはエラスチンとコラーゲンの架橋を阻害し、大動脈壁構造を破壊し、大動脈の拡張と解剖形成をある程度誘発します。その後のAng IIの誘導は、大動脈壁の変性をさらに悪化させ、それによってTADの発生を促進します。したがって、BAPNとAng IIの組み合わせは、マウスTADモデルを構築するための洗練されたアプローチを表しており、TADの病因と潜在的な治療アプローチを探求するための貴重なツールを提供します。

概要

胸部大動脈解離術(TAD)は、胸部大動脈壁内の出血による内膜の裂傷によって引き起こされる深刻な大動脈疾患であり、その結果、大動脈壁層が分離し、血液が大動脈壁の媒体に入り、偽の内腔を形成し、真の内腔^1,2,3に圧力をかけます。疫学研究では、TADの発生率は年間10万人あたり7〜9例であることが示唆されています⁴。現在、TADの病因は大動脈培地の異常な構造と血行動態によって引き起こされ、高血圧、脂質異常症、遺伝性血管疾患などの要因が^TAD5のリスクを高めると考えられています。外科的介入は、依然としてTADの主要な治療選択肢です。しかし、周術期リスクが高いため、TADの病因とその進行を遅らせるための早期介入方法を調査することは、TADの予後を改善するために非常に重要です。ヒトでのサンプルを採取し、直接ヒトで実験を行うことは非常に難しいため、ヒトTADの特性を模倣したTADの動物モデルを確立する必要があります。

過去数十年にわたり、大動脈瘤(AA)の多くの動物モデルが広く報告されてきました。しかし、TADモデルの確立に関する研究はまだ少ないです。一部の研究者は、TADをAA動物モデル⁶の副産物とさえ考えています。実際、TADが胸部大動脈の最初の内膜裂傷とそれに続く偽内腔の急速な拡張に起因することを考えると、このメカニズムの有意な違いはTADを大動脈瘤⁷と区別します。今日まで、β-アミノプロピオニトリル (BAPN) 誘発げっ歯類大動脈解離術は、TAD の最も使用されているモデルです。リシルオキシダーゼの特異的かつ不可逆的な阻害剤であるBAPNは、大動脈壁の弾性線維とコラーゲン線維の架橋を阻害し、大^動脈解離の動物モデルで広く使用されています^8,9,10。ほとんどの場合、マウスの飲料水にBAPNを添加してTADモデルを構築しており、浸透圧ポンプを介してBAPNとアンジオテンシンII(Ang II)の組み合わせによりTADモデルを構築することが報告されています^11,12。ただし、TAD モデルを構築するためのこれらの方法については詳しく説明していません。マウス系統、BAPN投与、およびAng IIの濃度と持続時間の違いにより、TAD病変の発生率と程度は異なる実験間で不安定でした。そのため、マウスのTADモデルを安定的に構築する方法が急務となっています。

ここでは、このプロトコルでは、マウスTADモデルを構築するためのBAPN添加水とAng II浸透圧ポンプの組み合わせを使用したシンプルで非常に成功した方法を、段階的に詳細に説明しています。このプロトコルは、ほとんどの研究室に適用でき、習得も容易であるため、マウスモデルの構築経験がない研究者でも一貫して実行できます。

プロトコル

動物実験のプロトコルは、天津医科大学の動物管理・使用委員会によって承認されました(承認番号TMUaMEC 2022036)。この研究では、生後3週齢のC57BL/6J雄マウスを使用しました。使用した試薬や機器の詳細は 、資料表に記載されています。

1.動物の維持管理とグループ化

1. 標準的なメンテナンスチャウでマウスを育てます。この研究では、生後3週間のマウスを使用します。
2. マウスを対照群(Control)、経口BAPN群(BAPN)、経口BAPNおよび生理食塩水注入群(BAPN + 生理食塩水)、および経口BAPNおよびAng II注入群(BAPN + Ang II)(図1)にランダムに割り当てます。対照群のマウスに通常の飲料水を提供します。
3. BAPNグループマウスに、BAPNを補充した飲料水を1 mg / g /日の用量で4週間提供します。.BAPN + Ang II群のマウスにAng II(1 ng / g / min)を注入し、BAPN +生理食塩水群のマウスに同量の生理食塩水を4週間経口BAPN投与の24時間注入します。.

2. BAPNを添加した飲料水の準備

1. マウスにBAPNを補給した飲料水を、3日間の適応給餌後、4週間連続して提供し、1日を誘導サイクルとして設定します。
2. 各ケージ内のマウスの体重を量り、飲料水に必要なBAPNの量を計算します。
3. 前日の各ケージの水量(vol)を記録します。
4. 適切な水分摂取量を確保するには、誘導サイクルの水量として1日の水量の1.3倍(1.3 x vol)を使用します。したがって、BAPNの必要重量の1.3倍を計算された飲料水に溶解します。詳細な計算方法と例を 表1に示します。
   注:この年齢のマウスは、まだ急速な成長期にあります。モデル導入期間中、マウスの水分摂取量を毎日記録し、ケージ内のBAPN補充飲料水を毎日交換することをお勧めします。BAPNの分解を防ぐため、ボトルをアルミホイルで包んで光から保護します。

3. Ang II質量の計算

1. 各マウスの体重を量り、最大体重に基づいて実験に必要なAng II質量を計算します。
2. 計算テンプレート(表2)を使用して、実験に必要なAng II質量を計算します。
3. 各ポンプには約100 μLが必要なため、マウスあたり130 μLのAng II溶液に必要なAng IIの質量を計算します。
4. 計算テンプレート(表3)を使用して、実験に必要なAng II溶液と生理食塩水の充填量を計算します。

4. Ang IIの解散

1. 凍結乾燥したAng II粉末を密封されたバイアルに入れ、-80°Cで保存します。 結露を防ぐために、Ang IIを室温まで平衡化させ、遠心分離してから開封してください。
2. 分析天びんを使用して、滅菌マイクロチューブ内のAng IIの計算量を秤量します。
3. 凍結乾燥されたAng IIが入ったマイクロチューブに計算された量の生理食塩水を加え、完全に溶解するまで完全にボルテックスします。
4. 必要なAng II溶液をクリーンベンチで各マウスに別々に調製し、体重に基づいて調製します。マイクロチューブを逆さまにして、溶液が十分に混合されていることを確認します。

5.浸透圧ポンプ充填

1. 浸透圧ポンプの2つの部分をパッケージから取り出し、感染のリスクを避けるために滅菌器具を使用してポンプを準備します。
2. 分析天秤を使用して、ポンプ本体とフロー減速器を含む各ポンプの重量を量ります。データを記録し、それを使用して充填率を計算します。
3. 開封したばかりの1mL滅菌シリンジに充填チューブを取り付け、気泡を吸引しないように注意しながら、上記の調製したAng II溶液を慎重に吸引します。
4. 充填チューブを上向きの位置に保持し、シリンジから気泡を慎重に取り除きます。気泡が充填チューブに入るのを防ぐために、この位置を維持してください。
5. 充填チューブの端を浸透圧ポンプ上部の開口部にそっと挿入し、それ以上挿入できなくなります。
6. 浸透圧ポンプを直立させ、シリンジプランジャーをゆっくりと絞ります。Ang II溶液が出口に現れたら、すぐに停止し、充填チューブを慎重に取り外します。
7. フロー減速器とポンプの上部との間に隙間が見えなくなるまで、フロー減速器を浸透圧ポンプの開口部に慎重にゆっくりと挿入します。余分なAng II溶液は滅菌吸収紙で拭き取ります。
8. 負荷がかかったポンプを分析天びんに計量し、記録します。注入前後のポンプ重量の差は、負荷されたAng II溶液の質量です。
9. 次の式を使用して充填率を計算します。
   充填率=(充填されたポンプの質量-空のポンプの質量)/(標準容量)x 100%
   注意: 充填量は、取扱説明書に記載されている標準容量の90%以上である必要があります。その場合、塗りつぶしは成功します。そうでない場合は、ポンプを排水して補充する必要があります。
10. 充填したポンプを37°Cの滅菌生理食塩水に入れ、着床するまで少なくとも6時間モデレーターヘッドを上げます。

6.ポンプ移植の外科的処置

1. はさみ、止血剤、ピンセット、針鉗子、縫合針を含むすべての手術器具を、ポンプ移植の24時間前にオートクレーブします。
2. マウスを1.5%〜2%イソフルランを含む麻酔導入チャンバーに2L / minの流量で置き、マウスを2分間安定させます。肩甲骨中央部の皮膚で約2cm×1cmの領域でマウスの毛を剃ります。
   注:イソフルランに対するマウスの反応は変動するため、安定した麻酔を維持するために濃度を調整する必要がある場合があります。.
3. イソフルラン麻酔器に接続されたノーズコーンに鼻を付けた状態で、マウスを腹臥位に置きます。麻酔下での乾燥を防ぐために、獣医用軟膏を目に塗ります。マウスがポンプ移植前および移植中に痛みを伴う刺激に反応しないことを確認してください。
4. 医療用ヨードフォアで背側の皮膚を3回消毒します。
5. メスを使って皮膚に約1cm横切開を慎重に行います。
6. 湾曲した鉗子で切開縁を優しくつかみ、別の湾曲した鉗子で皮下組織を鈍く解剖して、ポンプ用のポケットを作成します。ポケットがポンプが自由に動くのに十分な大きさであることを確認してください。
7. 充填されたポンプを皮下ポケットに挿入し、フローモデレーターヘッドをマウスの尾側の端に向けて配置します。切開部を閉じ、皮膚を過度に伸ばさないように十分なスペースを残してください。
8. ポンプが埋め込まれたら、切開縁をきれいに整列させ、6-0の非吸収性縫合糸で皮膚を閉じます。
   注意: 切開部位を注意深く検査して、傷が完全に閉じていること、およびポンプが切開部を直接圧迫していないことを確認します。
9. ヨードフォアで切開部を再度洗浄し、滅菌綿棒を使用して5%リドカイン麻酔ジェルを局所的に塗布します。.イソフルランをオフにします(0%)。.

7. 術後の動物の世話

1. ポンプ移植後、マウスを綿密に観察し、電気加熱ブランケットと一緒に回復ケージに入れます。
2. マウスが目覚めるまで少なくとも20分間、暖かいケージで一人で回復させ、その後、マウスを元のハウジングケージに戻します。
3. 手術後最初の6時間は、マウスを1時間ごとに観察します。次の18時間については、マウスを6時間間隔で観察します。マウスが瀕死の状態にあるか、Ang II投与中に死亡した場合は、すぐにサンプルを採取してください。

8. アオルタの採取、固定、洗浄、イメージング

1. すべての実験グループのマウスにイソフルランを麻酔し、研究の最後に子宮頸部脱臼によってマウスを犠牲にします。
2. マウスを仰臥位に置き、マウスプレートに固定します。下腹部を切開し、胸壁を横切って胸腔と腹腔が完全に露出するまで延長します。
   1. すぐに右心房に小さな切開を行い、滅菌注射器を左心室に挿入し、肺と肝臓が白くなるまで、左心室から約10 mLの氷冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS)をゆっくりと注入します。
3. その後、肺、肝臓、脾臓、腸の切除を行います。大動脈全体を完全に露出させ、デジタルノギスを使用して胸部大動脈の最大直径を測定します。心臓から大動脈を切開し、すべての動脈枝と総腸骨動脈を横断して大動脈全体を採取します。
4. 大動脈をデジタルカメラで画像化し、4%パラホルムアルデヒドで24〜48時間保存し、切片化のためにパラフィンに埋め込みます。
   注:腸管の損傷は組織分析を妨げる可能性があるため、注意してください。
5. ミクロトームを用いて大動脈パラフィン切片を3-5μmの厚さで切開し、脱ロウと水分補給を行います。メーカーの指示に従って、それぞれの染色キットを使用して、ヘマトキシリンとエオシン(H&E)およびエラスティックバンギーソン(EVG)で切片を染色します。

結果

この研究には、3週齢のC57BL/6Jマウス計70匹の雄を、対照群(n = 10)、BAPN(n = 20)、BAPN + 生理食塩水(n = 20)、BAPN + Ang II(n = 20)の4群に無作為に割り付けました。BAPN群では、20匹中11匹のマウスがBAPN投与の28日後に胸部大動脈解離術(TAD)を発症し、4匹のマウスが大動脈破裂で死亡した。BAPN+生理食塩水群では、20匹中12匹のマウスがTADを発症し、4匹が破裂により死亡しました。特に、BAPN + Ang IIグループでは、20匹のマウスすべてがTADを発症し、そのうち7匹が大動脈破裂で死亡しました。対照群ではTAD形成は観察されませんでした(図2A)。各グループの代表的な大動脈画像を 図2Bに示します。

平均最大大動脈径は、1.00 ± 0.09 mm(コ...

ディスカッション

生命を脅かす胸部大動脈解離術(TAD)の理解が限られているため、TADの発症と進行の根底にある分子メカニズムを探求するためには、安定した動物モデルの確立が不可欠です。リジルオキシダーゼ阻害剤であるβ-アミノプロピオニトリル(BAPN)は、コラーゲンとエラスチンの架橋を破壊し、それによって大動脈壁を弱め、機械的ストレスに対する感受性を高めるため、TADのげっ歯類モデルで広く使用されています¹³。しかし、BAPNの投与だけでは、研究間でTADの発生率に一貫性がなくなることがよくあります。

リシルオキシダーゼ阻害剤として、BAPNはエラスチンとコラーゲン¹⁰の架橋を不可逆的に阻害します。一般に、若年期には、これらの細胞外マトリックス成分の架橋はまだ進行中であると考えられています¹⁴。したがって、この重要な発生期間中にBAPNを投与すると、マトリックスの成熟を阻害するのに特に効果的...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
3-アミノプロピオニトリルフマル酸塩	シグマ・アルドリッチ	A3134
分析天びん	ラドワグ	AS 220.R2
麻酔器	上海仁義生物技術有限公司	MSS-3
アンジオテンシンII	MCEの	ハイ-13948
C57BL/6J オスマウス	ジェムファーマテック	N000013
チャウダイエット	Sibeifu Beijing Biotechnology Co., Ltd (シベイフ北京バイオテクノロジー株式会社)	SPF-F02-002
電熱恒温水タンク	イーヘンテクニカル株式会社	DK-8D
EVG染色キット	ソーラービオ	G1590型
GraphPadプリズム	グラフパッド	バージョン 10.0.2
H&E染色キット	サービスバイオ	G1076
止血剤	シンバ医療機器株式会社	ZH240RN
イソフルラン	RWDの	R510-22-10
マイクロチューブ	アクシーゲンサイエンティフィック株式会社	MCT-150-C
針鉗子	シンバ医療機器株式会社	ZM234R/RN/RBシリーズ
浸透圧ポンプ	アルゼット	1003D
パラホルムアルデヒド	サービスバイオ	G1101
PBS、1x	サービスバイオ	G4202
塩田	サービスバイオ	G4702
メス	シンバ医療機器株式会社	ZB084R/RN型
はさみ	シンバ医療機器株式会社	ZC480RN/RB/RNj/RNh
実体顕微鏡	ライカ	EZ4
縫合	金環医療用品株式会社	F604
ピンセット	シンバ医療機器株式会社	ZO022RB