方法論記事

極低温同時蛍光、電子、イオンビーム顕微鏡を用いた細胞のターゲットミリングのためのワークフロー

DOI：

10.3791/68238

⸱

2025年10月17日

 ,  ,  , 
1Division of Biology and Biological Engineering, California Institute of Technology, 2SLAC National Accelerator Laboratory, 3Department of Chemistry and Biochemistry, Brigham Young University, 4Department of Photon Science and Structural Biology, Stanford University

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このワークフローは、極低温トライコンシブイメージングプラットフォームを使用して、小さく(軸方向<1μm)希少な(細胞あたり1コピー)蛍光標識された生物学的構造を標的としたラメラ生成を可能にします。このプラットフォームは、蛍光顕微鏡、集束イオンビームミリング、走査型電子顕微鏡を単一の焦点位置に統合し、ミリング中の同時蛍光顕微鏡を可能にします。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

走査型電子顕微鏡による極低温集束イオンビームミリング(CryoFIB-SEM)は、極低温電子断層撮影(CryoET)用の厚さ200nm以下の細胞ラメラを調製するための主要なアプローチとなっています。最近、蛍光顕微鏡がCryoFIB-SEMシステムに組み込まれ、ラメラの生成を蛍光標識されたターゲットに誘導しています。ただし、ほとんどの実装では、光学イメージングシステムとイオンビームイメージングシステムは、真空チャンバーの異なる領域に異なる焦点面を持ち、2つの別々の顕微鏡として効果的に機能します。この構成では、モダリティ間の画像レジストレーションが必要であり、多くの場合、その 場で小さくて希少な構造を確実にターゲットにするために必要な精度が欠けます。蛍光イメージングと集束イオンビームミリングの同時性を可能にするカスタマイズされたトライコンシブイメージングプラットフォームに基づくワークフローを紹介します。これにより、最終的なラメラで目的の蛍光標識構造を保存するために、フライス加工をいつ終了するかを決定するために使用できるリアルタイムの蛍光フィードバックが可能になります。このアプローチを使用して、ガラス化マクロファージの微小管組織化センター(MTOC)を標的とし、その後の極低温電子断層撮影法と相関光学顕微鏡および電子顕微鏡によって確認された>60%の成功率を達成しました。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

極低温電子断層撮影法(CryoET)により、高分子分解能1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11でネイティブに近い状態の生体試料を可視化できます。.しかし、真核細胞の厚さ(多くの場合数ミクロン)は、300kV電子の平均自由行程(~300 nm)を超え、散乱していない電子の浸透深さを制限し、それによって使用可能なサンプルの厚さを制限します。これに対処するために、集束イオンビーム(FIB)を使用して、CryoFIBミリングとして知られるプロセスで極低温に保存された細胞のほとんどをアブレーションし、CryoETイメージングに十分な薄さのラメラを生成できます12,13,14,15,16。

以前に報告されたワークフローでは、サンプルは最初にプランジ凍結17、18、19を介してガラス化氷中に保存され、次にCryoFIBと走査型電子顕微鏡(SEM)の両方を備えたデュアルビーム装置にロードされます。SEMイメージングは、細胞小器官やいくつかのタンパク質構造などの関心のある細胞内特徴を同定するために使用することができる20,21。この情報は、CryoET 13,14,22に適した厚さ200nm未満のラメラを生成することを目標に、サンプルを段階的にアブレーションするCryoFIB粉砕プロセスを指示するために使用できます。ただし、このアプローチには、現在のプロトコルが対処する 2 つの重要な課題があります。まず、特定のタンパク質構造のクライオETを取得する必要があることがよくありますが、SEMは損傷を与える可能性があり、ほとんどのタンパク質構造は、染色されていない生体材料をイメージングする場合、SEMでは識別できません。特定の細胞内領域または特定の生体分子を含む領域に損傷のない方法でフライス加工を正確に誘導するにはどうすればよいでしょうか?第二に、薄いラメラとそれに続くCryoETの生成後でも、明確な同定に必要な分解能、S/N比、および/またはコントラストが不十分なため、最終的な再構成で特定の生体分子を同定することが困難になる場合があります。これらの生体分子の空間位置は、クライオET再構成内でどのように決定できるのでしょうか?

両方の課題に対処するために、この分野はますます蛍光顕微鏡に目を向けています。遺伝的にコードされた蛍光タンパク質または標的タンパク質に結合する外因性色素は、目的の特定の生体分子を標識するために日常的に使用されます5,23,24。粉砕後に採取されたガラス化細胞の極低温蛍光顕微鏡は、得られた断層撮影と相関させることができます。極低温相関光電子顕微鏡(CryoCLEM)として知られるこのアプローチは十分に確立されており、CryoET再構成5,12,23,24内の特定のタンパク質を局在化するために広く使用されています。最近の進歩には、相補的な情報と空間精度を向上させるための蛍光バイオセンサーと超解像法の使用が含まれます25,26,27,28,29。

CryoCLEMは、上記の2番目の課題を克服する1つの方法であり、ラメラ内の特定のタンパク質の位置を決定できます。ただし、CryoCLEMは、最終的なラメラに目的のタンパク質が含まれていない場合、ユーザーには何もしません。ありがたいことに、蛍光顕微鏡を使用して、標識された関心領域にミリングを向けることもできます。蛍光誘導FIBミリングは、CryoCLEMよりも新しい開発であり、最初のワークフローは約10年前に登場しましたが12、迅速かつ広く採用されています。初期のプロトコルは、外部光学顕微鏡に依存して2Dまたは3D蛍光データセットを取得し、サンプルをCryoFIB-SEMに転送した後、SEMおよびイオンビーム画像に登録しました。最近では、蛍光顕微鏡がCryoFIB-SEM真空チャンバーに直接統合されています。この統合により、転写中の氷汚染が軽減され、最終的なラメラのイメージングがより容易になります。蛍光誘導ミリングのために蛍光顕微鏡とCryoFIB-SEMを組み合わせるためのいくつかのプラットフォームが現在開発されています。これらは、細胞小器官と大きなタンパク質複合体を標的にすることに成功しています5,23,24。ただし、いくつかの例外30を除いて、光路は、FIB-SEMとは真空チャンバーの異なる物理領域に別個の焦点面を生成する。その結果、スタンドアロンの光学顕微鏡の使用と同様に、ダイレクトミリングには蛍光画像とイオン画像の間の正確なレジストレーションが依然として必要です。

このレジストレーションプロセスは、屈折率の不一致(明らかな焦点シフトを引き起こす)31,32、フライス加工中のサンプルの動き、および位置推定誤差の3つの重要な要因により、不正確になりがちです。さらに、レジストレーションは通常、イオンモダリティと光学モダリティの両方で可視であり、イオン画像と光学画像の間の変換を計算するためのアライメントポイントペアとして使用されるミクロンサイズの蛍光基準によって支援されます。ただし、これらのビーズはサンプルからの蛍光シグナルを覆い隠したり競合したりする可能性があり、光学画像やイオン画像全体でのビーズの局在化とアライメントは遅く、ユーザー集約的です。これらの制限が相まって、小さくてまれな特徴の日常的なターゲット設定が妨げられています。現在薄いラメラで保存できる構造の正確な限界を定義することは困難ですが、レジストレーションベースのアプローチは一般に、軸方向寸法が1ミクロン未満のターゲットを捕捉するのに効果がないと考えられています33。

ここでは、FIB、SEM、および蛍光顕微鏡を単一の焦点位置34,35に統合する三重一致イメージングシステムの使用を報告する。この構成により、光学画像とイオン画像を登録する必要がなくなるため、非一致積分と比較して、よりシンプルで正確な蛍光誘導ミリングが可能になります。低バックグラウンドで高信号の理想的な条件下では、10 nmオーダーのガイダンス精度を達成できます36。また、最終的な薄いラメラを含むミリングプロセス全体を通じて多色極低温蛍光顕微鏡データの取得を可能にし、準回折限界ターゲット35の相関分析と局在化を可能にします。これを達成するために、カスタマイズされた画像変換ツールキットを使用して、これらの蛍光画像を低倍率透過型電子顕微鏡で正確に位置合わせし、CryoETを収集する場所を決定し、データ収集を合理化し、最終的な断層撮影再構成でターゲットを確実にキャプチャします。

ミリングを導くために、蛍光強度の変化をリアルタイムで監視するシステムの機能を活用しています。ユーザーは、ターゲットを見つけるために光学画像とイオン画像を位置合わせしようとする代わりに、サンプルからの蛍光信号を観察するだけです。ミリングが進むにつれて、蛍光は非常に特徴的な方法で振る舞います:顕微鏡の対物レンズと蛍光標識されたサンプルの間の炭素支持膜が除去されるにつれて、最初に明るくなり、次に焦点が合っていない自家蛍光材料が粉砕されるにつれて徐々に減少し、最後に、標識された構造自体が部分的に除去されるにつれて急激に減少します。このリアルタイム信号は、フライス加工プロセスのどこにいるか、いつフライス加工を停止するかを正確に決定し、目的のターゲットが最終的なラメラ37内に保持されることを保証します。詳細なプロトコルでは、干渉効果による蛍光輝度の振動を使用して、軸方向の範囲が<300 nmの物体にフライス加工を誘導する、より高度なアプローチについても説明します。

微小管組織化センター(MTOC)38を標的とすることにより、プラットフォームの有用性を実証します。MTOC は、細胞の分裂と分化に関与する重要な細胞小器官です。哺乳類細胞では、標識チューブリンの蛍光顕微鏡検査により、MTOCが生細胞内の直径約1μmの単一の蛍光点として明らかになります。このアプローチは、ガラス化細胞の薄いラメラに忠実度の高いMTOCを正常に局在化するために使用されています。MTOCにおける微小管の詳細な構成と他の細胞小器官との相互作用は、その後の断層撮影再構成で明らかになります。このワークフローにより、レジストレーションなしで高精度の相関蛍光顕微鏡とCryoFIB-SEMが可能になり、ユーザー入力が減り、以前は非偶然アプローチで堅牢にキャプチャするには法外に小さかった細胞構造へのアクセスが拡大します。

定義と機器の説明
統合光学顕微鏡は、Boltjeら35で詳細に説明されており、統合顕微鏡の使用に関する詳細は、最近公開されたプロトコル34に記載されています。対物レンズは下から統合され、FIB-SEMの一致点とのアライメントを可能にするために、x、y、およびz位置決め機能を備えています。現在、カバーガラス補正器を備えた100倍、0.85NAの対物レンズで動作しています。光学イメージングはカバーガラスを通して行われ、スパッタ材料やFIBとSEMの両方からの照射から目的を保護します。広視野照明は、複数の可視波長にまたがる一連の LED によって提供されます。蛍光検出は、sCMOS検出器を使用して行われます。3つのステージ位置が定義されています。ローディング:サンプルがロードされるステージ位置。コーティング:ガス注入システムを介してコーティングするためのステージ位置。3ビーム:3つの顕微鏡(FIB、SEM、光学)すべてを同時に位置合わせできるステージ位置。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

注:ここで使用されるトライコンシニングシステムは、市販のデュアルビームFIB-SEMシステムに統合されたカスタマイズされた極低温蛍光イメージングコンポーネントです。演算の原則と順序は、一般に、将来の三重一致の実装に適合させることができます。

1. セットアップ

  1. システムを極低温まで冷却します。2つのセンサーを使用して温度を監視します:1つはサンプルステージにあり、もう1つはチャンバー内にあります。サンプルステージをチャンバーより約20°C高く保ち(例:ステージは~-170°C、チャンバーは~-190°C)、サンプルへの氷の蓄積を最小限に抑えます。冷却プロセスには通常約1.5時間かかります。

2. サンプルのローディング

  1. システム温度が極低温(約-167.5°C)に近づいたら、液体窒素を使用して移送ステーションを手動で冷却します。システム温度は、光学顕微鏡ソフトウェアの左上隅に表示されます。
  2. クリップしたオートグリッドを1つ、極低温光学顕微鏡システム用に設計されたサンプルカセットにロードします。カセットは、接着されたカバーガラスとスペーサーで構成され、オートグリッドがそれらの間に配置されています。リングネジを締めてカセットを閉じ、トランスファーステーション34のスロットに挿入します。
  3. トランスファーステーションをシステムに取り付け、内部チャンバーカメラを使用してサンプルカセットをサンプルステージに誘導します。

3. サンプルコーティング用ガス注入システム(GIS)

  1. 光学顕微鏡制御ソフトウェアを開き、サンプルステージを ローディング位置 から コーティング 位置に移動します。
  2. FIB-SEM制御ソフトウェアを使用して、SnowflakeアイコンをクリックしてGIS針を挿入します。 [GIS コントロール] で [ GIS 針の挿入] オプションを選択します。
  3. ガスの流れを開いて、GISの蒸着を30秒間許可します。
    注:これは、サンプルの種類に基づいて20秒から1分まで異なります。このステップの目的は、後続のFIBミリング手順でサンプルを十分に保護することです。
  4. GIS針を引っ込めて、サンプルステージを事前定義された ローディング 位置に戻します。

4. 3ビームシステムアライメント

注:このセクションは、Wang39から引用されています。

  1. 光学顕微鏡ソフトウェアで、サンプルステージを ローディング 位置から事前定義された 3ビーム 位置に移動します。
  2. FIB-SEMソフトウェアで、左上のウィンドウをクリックし、SEMを100倍の倍率に設定します。
  3. 光学顕微鏡ソフトウェアの[アライメント]タブで、[表示]機能をクリックして、グリッドのSEMアトラスを取得します。このアトラス画像は、以前に設定したパラメーターを使用します。
  4. カーボンフィルムが壊れている正方形の領域を特定し、それをダブルクリックしてサンプルステージをその場所に移動します。
  5. FIB-SEM制御ソフトウェアに戻り、SEMを より高い倍率 に調整して、視野の中央にある選択した正方形の領域に焦点を合わせます。
  6. 必要に応じて、SEMが壊れた炭素膜の鋭いエッジなどの識別可能なパターンに焦点を合わせるまで、手順4.4と4.5を繰り返します。
  7. 蛍光顕微鏡の電源を入れ、SEMビューに合わせてx、y、z座標を調整します。
  8. FIBを使用して、小さな長方形や円などの小さなパターンをフライス加工します。
  9. FIBビューと蛍光顕微鏡ビューの両方でパターンが表示されていることを確認します。必要に応じて、必要に応じて手順4.3〜4.7に従って位置合わせを調整します。
    注:光学顕微鏡とイオン顕微鏡のアライメントとレジストレーションは完了です。

5. ターゲットの位置特定とフライス加工

注:このセクションは、Wang39から引用されています。

  1. 光学顕微鏡ソフトウェアの [局在化 ]タブに移動し、適切な励起およびフィルタリング条件をアクティブにして蛍光チャネルを設定します。各蛍光色素を個別のチャネルとして割り当て、透過光(または明視野)用の追加のチャネルを含めます。
  2. 各蛍光チャネルのLED出力と露光時間を調整して、目的のターゲットを特定します。参考までに、SiR-チューブリンをイメージングする場合は、30 mWの一定のLEDパワー設定で1.2秒の露光を使用します。
    注:パラメータは蛍光色素によって異なる場合があります。光学強度は、サンプルで~25-50 W / cm2未満にとどまる必要があります。これよりも高い強度は、サンプル37,40の著しい加熱および脱透をもたらす可能性があります。
  3. パラメータに満足したら、軸方向をステップするプレミリング蛍光 Z スタックを取得します。次に、目標をROIとしてマークします。
  4. FIB-SEMソフトウェアに切り替えて、ROIでラメラを描画します。
  5. 荒削り加工を実行して、ROIの上下約3μmの材料の大部分を除去します。その間、ミリング中は蛍光顕微鏡をオンにして、蛍光シグナルの減少を監視します。
  6. 洗浄断面モードを使用してROIを~2 μmに薄くします。
  7. 端末からPythonベースの干渉計ツールキットを開き、ラメラ(https://github.com/pdahlb/trico_softwaresuite)36を薄くしながら蛍光信号を監視します。
  8. その後のフライス加工と研磨では、以下のステップ 5.9 または 5.10 で説明する 2 つのアプローチのいずれかに従って、選択したターゲットの寸法に基づいてフライス加工を行います。
    1. ターゲットの軸方向の範囲>300 nm
      注:ここでは、ダイレクトフライス加工に半破壊的なアプローチを使用します。
      1. Python-GUIで、蛍光顕微鏡写真で目的のターゲットを選択します。ソフトウェアは、新しいフレームごとに、時間の関数として明るさのプロットを自動的に開始します。
      2. Pythonツールキットを使用して蛍光強度を監視します。サンプルを下からクリーニング断面モードでフライス加工し、該当する場合は残っているサポートフィルム材料を除去します。
        注:サポートフィルムを剥がすと、蛍光の増強が観察されるはずです。
      3. 蛍光強度の急激な低下(蛍光材料の損失を示す)を、フライス加工方向を切り替えるタイミングの合図として使用します。たとえば、下から上にフライス加工し、蛍光の急激な低下が観察された場合は、フライス加工を中止し、上から下にフライス加工に切り替えます。
        注:構造物の除去が速すぎる場合は、FIB-SEMソフトウェアのフライス電流を下げて、ターゲットの除去を遅くしてください。
    2. ターゲットの軸方向≤300nm
      注:ここでは、干渉効果を使用して、36をフライス加工します。
      1. Python-GUIで、蛍光顕微鏡写真で目的のターゲットを選択します。ソフトウェアは、新しいフレームごとに、時間の関数として明るさのプロットを自動的に開始します。
      2. まず、テストターゲットを上から下にフライス加工します。蛍光強度でターゲットをミリングする直前に、フリンジコントラストを監視します。蛍光ターゲットは2Dガウスに連続的に適合し、その適合を使用して積分強度を取得し、それをプロットします。
      3. ターゲットをミルスルーした後、Python-GUIを使用して、強度トレースの振動を次のモデル関数に当てはめます。
        figure-protocol-1
        ここで、Aは振動の振幅、λは励起の波長、kは光源のコヒーレンス長を表す減衰項、位相係数Φ、dは捕獲対象物までの距離です。テストターゲットから、すべての項を合理的な範囲内で予測できるため、距離dは、蛍光物体がミリングに対してどこにあるかをユーザーに伝えるために使用される唯一の自由変数です。詳細については、Sica et al.を参照してください 36.
        注:後続のターゲットの場合、ツールキットは同じモデル関数で強度トレースをライブフィットし、ミリングを停止する場所を上から下に推定します。すべてのフィッティングはフライス加工と同時に行われます。目標は、ターゲットが上面より下の目的のラメラの厚さの半分に等しい深さにあるときにフライス加工を停止することです。
      4. トップダウンフライス加工が完了したら、希望の厚さが得られるまで、クリーニング断面モードで下から上にフライス加工してラメラを完成させます。
  9. ポストミリング蛍光画像を撮影します。

6. 相関光学顕微鏡とチルトシリーズの収集

  1. サンプルをCryoTEMに移した後、グリッド全体を十分にカバーできるように、182倍でグリッドのアトラスオーバービューを収集します。
  2. 6,500倍から11,000倍の範囲の適切な中間倍率で、0°の傾きで最終的なラメラの一連のモンタージュ画像を収集します。
  3. ポストミリングのマルチチャンネル蛍光画像とステップ6.2の投影画像を、ROIレジストレーション(https://github.com/pdahlb/CLEM_software_suite.git)用のカスタム射影変換ソフトウェアに読み込みます。
  4. 合計8〜10組の基準点を選択して、射影画像変換を正確に計算します。
    注:これらのポイントは、明視野光学顕微鏡と電子顕微鏡の両方に存在する明らかな特徴(ラメラエッジ、目に見える氷の汚染、または開いたグリッド穴など)である可能性があります。

7.高倍率チルトシリーズコレクション

  1. この重ね合わせた蛍光・透過型電子顕微鏡画像を参考に、高倍率チルトシリーズ撮影のカメラフレームサイズの制限内で撮像領域を選択します。
  2. 生物学的な質問に基づいてチルトシリーズの倍率とパラメータを選択します。
    注:デモンストレーションでは、3.5 Å 41,42,43のピクセルサイズで2°刻みで54°からデータを収集しました。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

凍結前に、分化したマクロファージ細胞をチューブリンマーカーSiR-チューブリンで標識しました。プロトコルに従って、MTOCを蛍光顕微鏡下で直径1~1μmの蛍光点として同定しました(図1A)。さらに、微小管ネットワークと一致して、MTOCから細胞周辺に向かって放射する原線維様蛍光構造を観察しました(図1A)。さまざまな試験片の厚さでの段階的なフライス加工スナップショットを 図1Bに示します。特に、ラメラが約800 nmの厚さに達すると、単一のMTOC点は、それぞれ直径約700 nmの2つの隣接するスペックルに分解されました。その後の分析により、各スペックルが個々の中心小体に対応していることが確認されました。

イメージングとミリングを同時に行うことで、蛍光強度の変化をリアルタイムで監視することができました。特に、バルク非蛍光物質と吸収性支持膜を除去した後、蛍光の増加が観察されました(図1B-D)。ラメラが2μmから800nmに薄くなると、標識構造の漸進的な除去を反映して、蛍光強度が急激に低下しました。この減少は、ラメラが200nm以下でさらに薄くなったため、続きました(図1B-D)。相関蛍光画像と電子顕微鏡アトラスは、私たちのワークフローがミリングの正確なターゲティングを可能にすることを示しています(図2A)。再構成された断層撮影法とセグメント化されたモデルは、中心小体が微小管の三重項で構成されていることを明らかにし、以前の報告42、43、44、45と一致しています(図2A、B)。最終的なラメラに蛍光スペックルが1つしか保存されていない場合は、対応する断層撮影で単一の中心小体を観察します(図2B)。

figure-results-1
図1:微小管組織化中心の正確な局在化のための三一致CryoFM-FIB-SEMのワークフロー。 (A)( 左) 生細胞顕微鏡と (右) MTOCのCryoFM。スケールバー = 10 μm。(B)ターゲットミリングのためのCryoFMおよびCryoFIBの段階的なスナップショット。クローズアップFMビューは、黄色の破線ボックスで示されます。中心小体は黄色の矢印でマークされています。スケールバー= 5 μm。(C)CryoFIBミリング中のMTOCの蛍光強度。(D)CryoFIBミリング中のさまざまな段階で撮影されたMTOC全体の蛍光線プロファイル。略語:CryoFM-FIB-SEM =集束イオンビームミリングと走査型電子顕微鏡による極低温蛍光顕微鏡。MTOC = 微小管組織化センター;ROI = 関心のある領域。この図は王39から脚色したものです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-2
図2:Tri-Coin CryoFM-FIB-SEMワークフローによって明らかになったMTOCの分子詳細。 (A)MTOCの相関FM、EM、およびセグメンテーションモデル。(a)フライス加工後のFM画像。これは、 図1B の最後のパネルと同じ画像で、180 nmとマークされていますが、CryoETの再構成とセグメンテーションに合わせて回転しています。スケールバー= 5μm;(b) (a) の黄色の破線領域の拡大図。(c)(2)に示したシアンの破線領域の相関FMおよびTEM投影。スケールバー= 1 μm。(d)関心領域(黄色、中心小体、緑色、微小管)での断層撮影再構成のセグメント化モデル。スケールバー = 100 nm。(B)異なる中心小体の向きを示す2つの異なるラメラの代表的なFM画像と断層撮影スライス。FM:スケールバー= 5μm。断層撮影スライス:スケールバー= 200 nm。略語: CryoFM-FIB-SEM = 走査型電子顕微鏡による極低温集束イオンビームミリング。MTOC = 微小管組織化センター;FM = 蛍光顕微鏡;ET = 電子透過;TEM = 透過型電子顕微鏡。この図は王39から脚色したものです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

私たちの結果は、蛍光イメージングとミリングの同時実行を可能にするトライコンシブイメージングプラットフォームの有用性を強調しています。このフィードバックを利用して、フライス加工中の屈折率の不一致と動きに関連する基本的な精度の制限に直面する面倒でレジストレーションベースのアプローチの必要性を回避する、半破壊と干渉測定の2つの蛍光誘導ミリング戦略を実証します12,33,46.さらに、正確なガイダンスはSEMではなく蛍光顕微鏡に依存しているため、強度が脱透につながる閾値未満に保たれている限り、光放射は検出可能な損傷をもたらさない37,47。ここで実証された機能は、ワークフローを合理化しながら、希少で小さな(軸方向範囲で<300 nm)関心のあるターゲットを含むように、アクセス可能な生物学的サンプルを拡張します。

このプロトコルの重要なステップは、目的のターゲットの蛍光明るさの変化に基づいて、ミリングをいつ停止するかを決定することです。現在、これには、希望の時間にフライス加工を停止するための迅速な手動介入が必要です。この方法は、現在調査されているターゲットには十分であることが証明されていますが、将来の変更により、Python ツールキットを FIB システムにさらに統合して、ミリングを直接停止する可能性があります。この変更は、より速い粉砕速度が必要な場合に、手動介入の時間が短縮されるため、必要になる場合があります。あるいは、遅い粉砕速度が許容できる場合は、必要に応じて手動介入により多くの時間を割くことができます。

関心のあるラメラを含む生物学的構造の生成に続いて、当社のカスタマイズされた画像変換ソフトウェアは、ラメラのアトラス概要を使用してCryoETデータ収集を導き、CryoTEMレベルでの相関を可能にします。全体として、ここで提示するプロトコルは、厚い真核生物の細胞サンプル中の極低温電子断層撮影法によって蛍光標識された、小さく、まれな生物学的標的をイメージングするために不可欠です。iFLMを搭載したAquilos 2などの既存の非一致クライオFIBシステムと比較して、当社のワークフローはこれらの機能をターゲットにするより高い成功率を達成しています。

この高いターゲティング精度には、効率が犠牲になります。フライス加工は自動化ではなく手動であるため、ラメラ生成のスループットは制限されます。8時間のミリングセッションでは、通常6〜8個のラメラを生成し、約5個に目的のターゲットが含まれています。ただし、このワークフローは将来的に自動化され、スループットが向上する可能性があると考えています。自動化には、FIB画像内のアクティブなミリング領域を継続的に監視し、蛍光強度をリアルタイムで追跡してターゲットの保持を確保するためのカスタムスクリプトが必要です。CryoFIB-SEMと蛍光顕微鏡の両方のすべてのカスタムスクリプトと制御ソフトウェア間の効果的な通信を確立するなど、重要な課題が残っています。

将来に目を向けると、蛍光バイオセンサー、超解像イメージング、共焦点顕微鏡など、前述の他の高度な蛍光顕微鏡技術を組み込むためにやるべきことはたくさんあります。それにもかかわらず、トライコンシクト形状が将来の機器の標準となり、フライス加工中の同時蛍光イメージングが日常的になると予想されます。もしそうなら、このプロトコルは、そのサイズと豊富さにもかかわらず、細胞生物学の中心である、小さくてまれな生物学的構造の分子スケールの詳細をキャプチャすることを目指す研究者にとって貴重なガイドとして役立つ可能性があります。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者には開示すべき利益相反はありません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

画像ワークフロー開発にご協力いただいたDelmicのメンバーに感謝いたします。PDDは、SLAC国立加速器研究所のパノフスキーフェローシップによって、DE-AC02-76SF00515契約に基づくエネルギー省研究所主導の研究開発プログラムの一環として、およびエネルギー省、科学局、生物環境研究局、契約番号に基づいて支援されました。DE-AC02-76SF00515 FWP 100883。この研究は、国立衛生研究所から G.J.J. への助成金AI127401によって部分的に支援されました。JW は、シリコンバレー コミュニティ財団の助言基金である Chan Zuckerberg Initiative DAF からの助成金 2021-234593 によって支援されました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アクイロス2 クライオ-FIBサーモフィッシャー・サイエンティフィックhttps://www.thermofisher.com/us/en/home/electron-microscopy/products/dualbeam-fib-sem-microscopes/aquilos-cryo-fib.html?cid=msd_ls_xseg_xmkt_sdb-aquilos_285811_na_pso_gaw_pei90m
&gad_source=1&gad_campaignid=12
764255901&gbraid=0AAAAADxi_GS
s7OvZmg4cgCUm0PjSiq9X9&gclid=
Cj0KCQjwh5vFBhCyARIsAHBx2w
xlIfYHMvqY3sSWu6oEAdUynCSf9
KRg9Jhjp7l0Dot9qTl6GyQaEo8aAiy
2EALw_wcB
オートグリッド対応クライオグリッドボックス電子顕微鏡科学https://www.emsdiasum.com/autogrid
-compatible-cryo-grid-box?srsltid=
AfmBOorQAd3esD8fLmnDDO2TvrNk
cj4UINXFnPSMgrpEmkWd0H7ImUq7
オートグリッドリングとCクリップナノソフトhttps://www.nanosoftmaterials.com/product-page/100-pack-autogrid-rings-c-clips
CLEMソフトウェアスイートスタンフォード/SLACのダールバーグ研究グループhttps://github.com/pdahlb/CLEM_software_suite.git
トンボ2022.1オブジェクト研究システムhttps://dragonfly.comet.tech/
エンツェルデルミック B. V.ENZELシステムはカスタマイズされた機器であり、現在は市販されていません
IMOD 4.12コロラド大学https://bio3d.colorado.edu/imod/
LD4液体窒素デュワーナノソフトhttps://www.nanosoftmaterials.com/product-page/ld4-liquid-dewar-4-liters
MATLAB 2023マスワークスhttps://www.mathworks.com/products/matlab.html
ピン蓋マニピュレーターツールナノソフトhttps://www.nanosoftmaterials.com/product-page/pin-lid-manipulator-tool
Pythonツールキットスタンフォード/SLACのダールバーグ研究グループhttps://github.com/pdahlb/trico_softwaresuite
量子箔R2/2、LF、200メッシュ、Au EMグリッド電子顕微鏡科学https://www.emsdiasum.com/quantifoil-r-22-lf-200-mesh-gold
シリアルEMコロラド大学ボルダー校https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/
スピアラブ標準船(転送デュワー)ナノソフトhttps://www.nanosoftmaterials.com/product-page/spearlab-standard-vessel
ピンセット電子顕微鏡科学https://www.emsdiasum.com/style-3sa

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Komeili, A., Li, Z., Newman, D. K., Jensen, G. J. Magnetosomes are cell membrane invaginations organized by the actin-like protein MamK. Science. 311 (5758), 242-245 (2006).
  2. Bykov, Y. S., et al. The structure of the COPI coat determined within the cell. eLife. 6, e32493(2017).
  3. Mahamid, J., et al. Visualizing the molecular sociology at the HeLa cell nuclear periphery. Science. 351 (6276), 969-972 (2016).
  4. Xue, L., et al. Visualizing translation dynamics at atomic detail inside a bacterial cell. Nature. 610 (7930), 205-211 (2022).
  5. Hampton, C. M., et al. Correlated fluorescence microscopy and cryo-electron tomography of virus-infected or transfected mammalian cells. Nat Protoc. 12 (1), 150-167 (2017).
  6. Oikonomou, C. M., Jensen, G. J. Cellular electron cryotomography: Toward structural biology in situ. Annu Rev Biochem. 86 (1), 873-896 (2017).
  7. Grimm, R., et al. Electron tomography of ice-embedded prokaryotic cells. Biophys J. 74 (2), 1031-1042 (1998).
  8. Medalia, O., et al. Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography. Science. 298 (5596), 1209-1213 (2002).
  9. Tamborrini, D., et al. Structure of the native myosin filament in the relaxed cardiac sarcomere. Nature. 623 (7988), 863-871 (2023).
  10. Kaplan, M., et al. Bdellovibrio predation cycle characterized at nanometre-scale resolution with cryo-electron tomography. Nat Microbiol. 8 (7), 1267-1279 (2023).
  11. Schur, F. K. M., et al. An atomic model of HIV-1 capsid-SP1 reveals structures regulating assembly and maturation. Science. 353 (6298), 506-508 (2016).
  12. Arnold, J., et al. Site-specific cryo-focused ion beam sample preparation guided by 3D correlative microscopy. Biophys J. 110 (4), 860-869 (2016).
  13. Lam, V., Villa, E. Practical approaches for cryo-FIB milling and applications for cellular cryo-electron tomography. cryoEM: Methods and Protocols. , Springer. 49-82 (2020).
  14. Rigort, A., Plitzko, J. M. Cryo-focused-ion-beam applications in structural biology. Arch Biochem Biophys. 581, 122-130 (2015).
  15. Noble, A. J., de Marco, A. Cryo-focused ion beam for in situ structural biology: State of the art, challenges, and perspectives. Curr Opin Struct Biol. 87, 102864(2024).
  16. Rigort, A., et al. Focused ion beam micromachining of eukaryotic cells for cryoelectron tomography. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (12), 4449-4454 (2012).
  17. Iancu, C. V., et al. Electron cryotomography sample preparation using the Vitrobot. Nat Protoc. 1 (6), 2813-2819 (2006).
  18. Dobro, M. J., Melanson, L. A., Jensen, G. J., McDowall, A. W. Plunge freezing for electron cryomicroscopy. Methods Enzymol. 481, 63-82 (2010).
  19. Chang, Y. -W., et al. Correlated cryogenic photoactivated localization microscopy and cryo-electron tomography. Nat Methods. 11 (7), 737-739 (2014).
  20. Wu, G. -H., et al. Multi-scale 3D cryo-correlative microscopy for vitrified cells. Structure. 28 (11), 1231-1237.e3 (2020).
  21. Lin, C., Zhang, L., Zhang, Z., Jiang, Y., Li, X. Locating cellular contents during cryo-FIB milling using cellular secondary-electron imaging. J Struct Biol. 215 (3), 108005(2023).
  22. Wagner, F. R., et al. Preparing samples from whole cells using focused-ion-beam milling for cryo-electron tomography. Nat Protoc. 15 (6), 2041-2070 (2020).
  23. Carter, S. D., Mamede, J. I., Hope, T. J., Jensen, G. J. Correlated cryogenic fluorescence microscopy and electron cryo-tomography shows that exogenous TRIM5α can form hexagonal lattices or autophagy aggregates in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (47), 29702-29711 (2020).
  24. Guo, Q., et al. In situ structure of neuronal C9orf72 poly-GA aggregates reveals proteasome recruitment. Cell. 172 (4), 696-705.e12 (2018).
  25. Perez, D., et al. Identification and demonstration of roGFP2 as an environmental sensor for cryogenic correlative light and electron microscopy. J Struct Biol. 214 (3), 107881(2022).
  26. Sartor, A. M., Dahlberg, P. D., Perez, D., Moerner, W. E. Characterization of mApple as a red fluorescent protein for cryogenic single-molecule imaging with turn-off and turn-on active control mechanisms. J Phys Chem B. 127 (12), 2690-2700 (2023).
  27. Sexton, D. L., Burgold, S., Schertel, A., Tocheva, E. I. Super-resolution confocal cryo-CLEM with cryo-FIB milling for in situ imaging of Deinococcus radiodurans. Curr Res Struct Biol. 4, 1-9 (2022).
  28. Dahlberg, P. D., Moerner, W. E. Cryogenic super-resolution fluorescence and electron microscopy correlated at the nanoscale. Annu Rev Phys Chem. 72 (1), 253-278 (2021).
  29. Perez, D., et al. Exploring transient states of PAmKate to enable improved cryogenic single-molecule imaging. J Am Chem Soc. 146 (42), 28707-28716 (2024).
  30. Li, S., et al. ELI trifocal microscope: A precise system to prepare target cryo-lamellae for in situ cryo-ET study. Nat Methods. 20 (2), 276-283 (2023).
  31. Loginov, S. V., Boltje, D. B., Hensgens, M. N. F., Hoogenboom, J. P., vander Wee, E. B. Depth-dependent scaling of axial distances in light microscopy. Optica. 11 (4), 553-568 (2024).
  32. Petrov, P. N., Moerner, W. E. Addressing systematic errors in axial distance measurements in single-emitter localization microscopy. Opt Express. 28 (13), 18616-18632 (2020).
  33. Yang, J., et al. Precise 3D localization by integrated fluorescence microscopy (iFLM) for cryo-FIB-milling and in situ cryo-ET. Microsc Microanal. 29 (Suppl. 1), 1055-1057 (2023).
  34. Perton, E., Boltje, D., Jakobi, A., Hoogenboom, J. Workflow for fluorescence-targeted lamella milling from vitrified cells with a coincident fluorescence, electron, and ion beam microscope. Bio Protoc. 15 (14), e5390(2025).
  35. Boltje, D. B., et al. A cryogenic, coincident fluorescence, electron, and ion beam microscope. eLife. 11, e82891(2022).
  36. Sica, A. V., et al. Optical interference for the guidance of cryogenic focused ion beam milling beyond the axial diffraction limit. bioRxiv. , (2024).
  37. Dahlberg, P. D., Perez, D., Hecksel, C. W., Chiu, W., Moerner, W. E. Metallic support films reduce optical heating in cryogenic correlative light and electron tomography. J Struct Biol. 214 (4), 107901(2022).
  38. Lukinavicius, G., et al. Fluorogenic probes for live-cell imaging of the cytoskeleton. Nat Methods. 11 (7), 731-733 (2014).
  39. Wang, J. Direct visualization of cellular protein complexes in situ by fluorescence-guided cryo-FIB-SEM and cryo-ET. , California Institute of Technology. (2025).
  40. Last, M. G., Tuijtel, M. W., Voortman, L. M., Sharp, T. H. Selecting optimal support grids for super-resolution cryogenic correlated light and electron microscopy. Sci Rep. 13 (1), 8270(2023).
  41. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. J Struct Biol. 152 (1), 36-51 (2005).
  42. Mastronarde, D. N., Held, S. R. Automated tilt series alignment and tomographic reconstruction in IMOD. J Struct Biol. 197 (2), 102-113 (2017).
  43. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J Struct Biol. 116 (1), 71-76 (1996).
  44. Meng, E. C., et al. UCSF ChimeraX: Tools for structure building and analysis. Protein Sci. 32 (11), e4792(2023).
  45. Heebner, J. E., et al. Deep learning-based segmentation of cryo-electron tomograms. J Vis Exp. (189), e64435(2022).
  46. Klumpe, S., et al. A modular platform for automated cryo-FIB workflows. eLife. 10, e70506(2021).
  47. Li, Y., Kang, D. -D., Dai, J. -Y., Wang, L. -W. The cage effect of electron beam irradiation damage in cryo-electron microscopy. npj Comput Mater. 10 (1), 115(2024).

再版と許可

このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト

許可をリクエスト

タグ

Cryogenic Focused Ion BeamCryoFIB SEMFluorescence MicroscopyElectron MicroscopyTargeted Cell MillingCryogenic Electron TomographyCorrelative Light Electron MicroscopyMicrotubule Organizing CenterLamella PreparationReal Time Fluorescence Feedback

関連記事