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方法論記事

全細胞バイオセンサーを用いた水サンプル中のイオン性水銀の測定

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DOI：

10.3791/68257

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2025年7月3日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratorio de Moléculas Individuales, Laboratorios de Investigación y Desarrollo, Facultad de Ciencias e Ingeniería, Universidad Peruana Cayetano Heredia, 2Kenniscentrum AI, Erasmushogeschool Brussel, 3Open BioLab Brussels, Erasmushogeschool Brussel

この記事について

サマリー

この記事では、2つの全細胞バイオセンサー(Mer-BlueおよびMer-RFP)を使用してイオン性水銀を検出するためのプロトコルについて説明します。この研究は、それらの操作と出力分析の詳細な手順を提供することにより、特定の汚染物質を監視するためのこれらの技術の広範な採用とさらなる開発を促進することを目的としています。

要約

全細胞バイオセンサー(WCB)は、調節要素を発見および特性評価し、バイオエンジニアリングを進歩させるための重要なプラットフォームです。また、環境や食品のモニタリングにも大きな期待が寄せられています。感度と移植性の向上に多大な努力が払われていますが、取り扱いとデータ分析の標準化は比較的未発達のままです。この記事では、最近開発された2つのWCB、Mer-BlueとMer-RFPを利用するための包括的なガイドを提供します。これは、世界保健機関の飲料水制限を下回るレベルでイオン性水銀を検出できることが証明されています。本明細書で詳述するプロトコルは、微生物培養調製、センサー較正、データ取得、および分析を網羅する。蛍光測定用Mer-RFPバイオセンサーでは、信頼性と精度に優れた用量反応測定の時間間隔を特定するために、新しい生合成割り当て定理が採用されています。比色分析バイオセンサーMer-Blueの場合、低コストのカメラセットアップにより、高価な分光光度計や蛍光計が不足している環境での厳密な測定が可能になり、分散型の汚染監視が容易になります。淡水サンプルの試験に使用される手順について説明し、サンプルタイプに関するこれらのバイオセンサーの制限について説明します。これらの取り扱いと分析技術を共有することにより、より広範な研究グループがこれらの生物学的デバイスを採用し、改善して効果的な環境モニタリングソリューションを開発することを奨励します。最終的に、この研究は、環境科学コミュニティ内でバイオセンサー技術の広範な採用を促進し、さまざまな生態系における微量元素汚染のより効果的かつ効率的なモニタリングに貢献することを目指しています。

概要

環境汚染や水・食料供給の安全性に対する懸念が高まる中、バイオセンサーは、従来の分析化学手法に代わる魅力的で手頃な価格の方法として浮上しています。重金属は、人間の活動によりますます蔓延している非常に有毒な汚染物質です1,2,3,4。しかし、従来の検出方法5は、多くの場合、高価でアクセスできません。

水銀感受性WCBは、MerR転写因子6,7,8の顕著な特異性と感度を利用しています。MerRは、その本来の機能において、エフェクタータンパク質の発現を調節し、その解毒活性が水銀耐性を付与する9。MerRが水銀依存的に遺伝子発現を調節する能力は、水銀検出システム10,11,12,13,14,15,16におけるレポータータンパク質の調節に転用されている。有望な研究にもかかわらず、これらのWCBはまだ実世界のモニタリングに採用されていません。生物学的脆弱性、特殊な取り扱い要件、標準化されたプロトコルや認証された標準物質の欠如などの要因が、実用化を妨げてきました17,18,19,20。

イオン性水銀検出のためのWCBシステムは、MerRを2つの異なるレポータータンパク質に結合させて開発されました。Mer-Blueは発色性タンパク質を発現し、比色バイオセンサーとして機能し、視覚またはカメラベースの検出を可能にします。蛍光バイオセンサーであるMer-RFPは、シグナル蓄積の継続的なモニタリングを可能にします。成長期における試料曝露のタイミングを慎重に制御することにより、両システムにおいて頑健な再現性が達成された15。

この記事では、Mer-BlueとMer-RFPの両方を動作させるための詳細なプロトコルと、それらの信号出力の包括的な分析について説明します。Mer-RFPの場合、分析は最近導入されたタンパク質生合成割り当ての定理に基づいています21。Mer-Blueの場合、ImageJなどの画像処理ソフトウェアを使用して比色分析をデジタル化できます。一貫した画像取得設定を確保するために、PelletCamという名前の低コストのDIYカメラセットアップが提示されます。いずれの場合も、操作を容易にするために自動化されたソフトウェアが提供されます。アクセス可能で標準化された実験方法論とデータ解析技術を共有することにより、WCBの広範な採用が促進され、信頼性が高く費用対効果の高いバイオセンサーベースのモニタリングソリューションの開発が促進されます。

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プロトコル

この研究で使用した試薬と機器は、 材料表に記載されています。

1. イオン性水銀溶液の調製

  1. 吸入や皮膚への曝露を防ぐための適切な保護手袋とマスクを使用して、少量のHgBr2 粉末(通常は0.1〜0.2 g)を計量します。
  2. 次の式を使用して、測定された固体粉末の質量をddH2Oに溶解することにより、4 mM溶液を得るために必要な水の量を計算します。
    figure-protocol-1
    注:予想容量は100mLに近いです。簡略化された式を使用できます。
    figure-protocol-2
    1. または、HgCl2を使用する場合は、次の式を適用します。
      figure-protocol-3
  3. ストック溶液は、蒸発を防ぐために冷蔵環境(4°C)の密閉容器に保管してください。
  4. 表1に示すように、各滴定アッセイの前に、1 mLの2 mM Hg2+から始めて40 nMまで希釈する段階希釈液を調製します。
    注:イオン性水銀の濃度は、おそらく元素水銀(Hg°)の自発的な減少と蒸発により、貯蔵中に変化する可能性があります。冷蔵および高品質の密閉容器の使用はこれらの影響を軽減する可能性がありますが、6週間以上保管された溶液、特に250 nMのHg2+ 以下の濃度の溶液の使用は避けてください。

2. M9メディウムの準備

  1. 試薬粉末を超純水を使用して別々のフラスコに溶解し、M9 5×、1 M MgSO4、1 M CaCl2、20%(w/v)グルコース、および20%(w/v)カサミノ酸を調製します。
  2. 500 mLまたは1 Lのガラス瓶に、M9 5×50 mL、2.5 mLの20%(w / v)カサミノ酸を混合し、超純水を加えて総容量246.475 mLにします。
  3. 混合物と上記のストック溶液を121°Cで20分間オートクレーブします。
  4. CaCl2の沈殿を避けるために、すべての溶液を完全に冷却します。
  5. 冷却した混合物に、25 μL の 1 M CaCl2、500 μL の 1 M MgSO4、3 mL の 20% (w/v) グルコースを加えます。
    注:これにより、最終濃度が0.24%(w/v)グルコース、0.2%(w/v)カサミノ酸、2 mM MgSO4、1 mM CaCl2、3 g/L KH2PO4、0.5 g/L NaCl、6.78 g/L Na2HPO4、1 g/L NH4Clの最終濃度が豊富に補充されたM9培地が得られます。

3. Mer-Blue / Mer-RFPバイオセンサーのアクティブ化

  1. pUC-Mer-RFPまたはpUC-Mer-Blueプラスミドで形質転換した 大腸菌 DH5α細胞を使用してください( 材料表を参照)。
  2. 100 μg/mL のアンピシリンを含む LB 寒天ペトリ皿を準備します。
  3. 凍結保存されたグリセロールストックから、ストリーキング法を用いてLB寒天プレート上に細胞を播種します。
  4. プレートを37°Cで一晩インキュベートします。
  5. 翌日、LB寒天プレートから1つのコロニーを取り出し、M9培地を使用して10 mLの培養液を接種します(図1A)。
  6. 培養物を37°Cでインキュベートし、220 rpmで一晩(~16時間)絶えず振とうします(図1B)。

4. Mer-RFPを用いた滴定実験

  1. 600 nm での一晩の細菌培養の光学密度を測定します (OD600)。
  2. 新鮮な M9 培地 10 mL の総容量で OD600 0.05 に達するために必要な一晩培養の量を、次の式を使用して計算します。
    figure-protocol-4
    ここで、C1 は一晩の培養の OD600 であり、V1 はそこから取得するボリュームです。
  3. 1mLの プレ接種物を3500 × g で5分間遠心分離します。古いM9培地を廃棄し、細菌性ペレットを10 mLの新鮮なM9培地に再懸濁します(図1C)。
  4. 再懸濁した培養液195 μLを96ウェルマイクロプレートの各ウェルに加えます。各マイクロカルチャーが正確な測定のためにトリプリケートに調製されていることを確認してください。
  5. ステップ1で説明したように、5 μLの40 nMから40 μMのイオン水銀溶液を各ウェルに加えて、1 nMから1 μMの範囲の最終濃度を達成します(図1D)。
  6. マイクロプレートを温度制御付きのマルチモードマイクロプレートリーダーに置き、次のパラメータに設定します(図1E) -温度:37°C、振とう:60rpmで一定の振とう、時間間隔:15分ごとに16時間読み取り、光学密度測定:600nmで読み取り、蛍光測定:570nmで励起、615nmで発光します。
  7. 16時間のインキュベーション期間が完了したら、マイクロプレートリーダーからデータを収集します(図1F)。

5. Mer-RFP結果のデータ分析

  1. お好みのスプレッドシートソフトウェアまたはデータ管理ツールを使用して、すべての個々の培養物について生のOD600 値を経時的に視覚化します(図1G)。ラグフェーズの終了と固定フェーズの開始が、各水銀濃度条件内のすべての反復でほぼ同時に発生することを確認します。平均タイミングから 1 時間以上ずれるカルチャは除外します。
  2. 各水銀濃度条件内のすべての反復にわたる各時点の平均 OD600 を計算します。3回培養条件ごとに、1つの平均OD600 成長曲線と3つの蛍光強度出力が異なる時点で利用可能になります。
  3. 平均化されたOD600 と水銀を含まない文化の時間。成長率がプラスの時間間隔を視覚的に識別して選択します ( 図 2 を参照)。すべてのカルチャから残りのデータ ポイントを除外します。
  4. カルチャごとに、次の式を使用して、前の時点からの OD600 の変化を見つけ、その変化をその時点の OD600 値で割ることにより、各時点の特定の成長率を計算します。
    figure-protocol-5
  5. 同様に、次の式を使用して、前の時点からの蛍光強度の変化を見つけ、その変化をその時点での OD600 値で割ることにより、各培養の特定の蛍光産生速度を計算します。
    figure-protocol-6
  6. 各培養物について、蛍光産生速度に対する比成長率をプロットします( 図3を参照)。遅い時点内の線形範囲を特定します。最小の 12 ポイント (約 3 時間) に基づいて、R2 が最も高い線形回帰が達成されるまで、早い時点を除外します。
    注:この線形回帰の傾きは、発現画分、すなわち、レポータータンパク質21に割り当てられた全タンパク質合成の割合を表す。
  7. すべてのカルチャについて、ほぼ同じ時間間隔から線形トレンドを抽出し、各条件の傾き値を記録します。
    注: 同じ時間間隔を使用してすべてのカルチャで可能な限り高い R2 値を達成するには、複数回の試行が必要になる場合があります。自動解析のために、以下のJupyter Notebook(Google Colabフレームワーク)が https://github.com/frank-britto/Mer_RFP で入手できます。このノートブックは、線形トレンドの抽出とさらなる用量反応プロファイリングを最適化するためのテンプレートとして機能します。
  8. 各水銀濃度の反復全体の平均傾きを取ります。
  9. 水銀濃度に対する平均傾き値をプロットします( 図4Aを参照)。Hill 関数をデータに当てはめます。
    figure-protocol-7
    ここで、fRFP は赤色蛍光タンパク質の発現画分、Hは回路の最大可能発現、 [Hg2+]はイオン性水銀濃度、kHg はイオン性水銀に対する親和性、nはHg2+に対する応答の協調性を表すHill係数である。

6. Mer-Blueバイオセンサーを用いた滴定実験

  1. ステップ3で説明したように得られた緻密な培養物を、3,500 × g で10分間一晩遠心分離します。
  2. 使用済みのM9培地を廃棄し、細菌ペレットを新しいM9培地に再度懸濁してOD6001.0 にします。この密度で最低5 mLの培養物が得られることを確認してください(図1C)。
    注:分光光度計が利用できない場合は、密集した培養物の元の容量の2倍に等しい新鮮なM9培地に細菌ペレットを再懸濁することにより、初期条件を概算してください。
  3. 滅菌したガラス製培養チューブに、9.5 mLのM9培地と10 μLの100 mg/mLアンピシリンストック溶液を加えます(図1H)。
  4. 添加したM9培地に、ステップ6.2で調製したバイオセンサー培養物500μLを接種します(OD600 = 1.0)。
  5. 調製したイオン性水銀溶液10 μLを添加し(ステップ1を参照)、最終濃度が0 nM、1 nM、2 nM、5 nM、10 nM、25 nM、50 nM、100 nM、125 nM、および250 nMになるようにします。
  6. 培養物を37°Cで16時間インキュベートし、220rpmで激しく振とうします(図1I)。

7. Mer-Blueの結果データ取得と分析

  1. 各培養物の約1.3 mLを1.5 mLマイクロチューブに移します(図1J)。
  2. マイクロチューブを最高速度で3分間遠心分離し、タイトなペレットを得ます。上清を捨てます。
  3. (オプション)より大きなペレットを得るには、遠心分離と上清の除去を最大6回繰り返します。
  4. ペレットに焦点を合わせて、各マイクロチューブの底を撮影します(図1K)。マイクロチューブホルダーと三脚またはPelletCam(ステップ8を参照)を使用して、すべての画像で一貫した再現性のある向き、照明、および色設定を確保します( 図5を参照)。
  5. 赤、緑、青(RGB)の各チャネルにわたる各ペレット画像の色強度値を決定します。
    1. ImageJ を使用している場合: 画像を読み込み、[ Image (イメージ)] > [Type (タイプ)] > [RGB Stack ] に移動して、3 スライス スタック (赤、緑、青のチャンネル) を作成します。選択ツールを使用して、ペレット領域の周囲に関心領域 (ROI) を描画します。 「Analyze > Measure 」に移動して、各チャネルの選択した領域の平均強度値を取得します。
    2. PelletCam を使用している場合: ペレット画像の代表的な 9 ピクセル領域の平均色強度値を含む .csv ファイルを開きます。
  6. 各サンプルのバイオセンサーの応答を計算するには、前述したように、白色の参照ペレット画像(変換されていない 大腸菌)に対するRGB空間のユークリッド距離を、次の式を使用して計算します22。
    figure-protocol-8
    ここで、Rサンプル、Gサンプル、およびBサンプルは、バイオセンサーのサンプルからのペレット画像の選択された領域における各RGBチャネルからの平均色強度を表し、Rref、Gref、およびBrefは、形質転換されていない大腸菌の参照ペレットの対応する値を示します。
  7. 計算されたユークリッド距離を、対応するイオン性水銀濃度に対してプロットします( 図6を参照)。Hill関数をデータに当てはめます( 図4Bを参照)には、次の式を使用します。
    figure-protocol-9
    ここで、Eはユークリッド距離、Hは回路の可能な最大色、 [Hg2+]はイオン性水銀濃度、kHg はイオン性水銀に対する親和性に関連し、nはHg2+に対する応答の協調性を表すHill係数です。

8. PelletCamの構築

  1. Web サイト (https://github.com/EhbAIGit/PelletCam-OPENBIOLAB-AI) から、細菌ペレットの色測定用のクローズド マイクロコントローラー システムを構築するためのファイルをダウンロードします。
    注:レーザー切断、3D印刷、ESP32、およびArduinoの基本的な知識が役立ちます。ESP32-CAMの紹介ガイドは(https://lastminuteengineers.com/getting-started-with-esp32-cam/?utm_content=cmp-true)で入手できます。プログラミングを容易にするために、ESP32-CAMをMBアダプターと一緒に購入することをお勧めします。ESP32に慣れていないユーザーは、最初に https://lastminuteengineers.com/esp32-arduino-ide-tutorial/ のチュートリアルに従うことをお勧めします。
  2. LasercutterBox.ai ヤスリを使用して、レーザーカッターで3mmマルチプレックスをカットして彫刻します。
  3. 3Dプリンターで ファイルESP32SET.stl ファイルからパーツを作成します。この .stl ファイルは、ほとんどすべての3Dプリンターソフトウェアで直接インポートできます。たとえば、Bambu studio(https://bambulab.com/en/download/studio)です。
  4. .cppと.hおよび.inoファイルを1つのフォルダに配置して、ESP32(ESP32-CAM-MB 2640 WiFi Bluetoothカメラモジュール)をインストールします。次に、Arduino IDEソフトウェアで.inoファイルを開き、[>Upload]をクリックします。アップロードすると、ESP32は自動的に起動します。
  5. この時点で、ユーザーは>PELLET という名前のWiFiアクセスポイントとパスワード >PELLETCAMに接続できるはずです。これは、ESP32の .ino ファイルで指定されています。PelletCamのIPアドレスは、ArduinoIDEのシリアルモニターに表示されます。Webブラウザーを開き、アドレスに移動します:http://192.168.4.1。
    注意: これにより、 view または新しい画像を撮る(>CAPTURE PHOTO)、画像を回転させる(>ROTATE)、またはLEDストリップの輝度を設定する(>LEDS)。
  6. ESP32 ArduinoをLEDストリップ(NeoPixel Stick - 8 x 5050 RGB LED、統合ドライバー付き)と5V USBケーブルに接続します file InstallationManual.pptx。
  7. グルーガンを使用して、ESP32とLEDストリップを3Dプリントされたサポートに接着します。
  8. 底部が着色されたマイクロチューブ(またはバクテリアペレット)をPelletCamの3Dプリントされた前面に挿入します。ESP32-LED-supportを約5cm離して置き、 webページ 。 シャープで適切に照らされた画像が得られた場合は、ESP32-LEDサポートを木箱の底に接着します。そうでない場合は、前面とESP32-LEDサポートの間の距離を調整し、満足のいく距離が得られるまで手順を繰り返します。
  9. マスキングテープを使用し、すべての部品を木工用ボンドで接着して箱を組み立てます。
  10. PelletCamをUSBケーブルで、少なくとも1Aを供給できるUSB電源に接続します。
    注: Python 3.9 以降のバージョンがインストールされていることを確認してください。
  11. コマンド プロンプトまたはターミナル ウィンドウを開きます。 pellet.py ファイルが含まれているディレクトリに移動します。コマンド >python pellet.py を使用してスクリプトを実行します。
  12. pellet.py スクリプトを実行できない場合は、Python ライブラリが見つからない可能性があります。必要なライブラリをインストールするには、コマンド >pip install pillow tkinter pathlib statistics を使用します。独自のシステムをセットアップするための追加のガイダンスについては、ドキュメント「PelletCam Example.docx」を参照してください。

9. 環境水サンプルの測定

  1. 河川や池などの環境源からサンプルを採取し、密閉容器に入れて低温で保管することで、蒸発を最小限に抑えます。詳細については、「ディスカッション」セクションを参照してください。
  2. サンプルを3,500 × g で10分間遠心分離し、堆積物砂と有機物破片を沈殿させ、水性画分を分離します。
  3. 清澄化したサンプルを0.22 μmシリンジフィルターで滅菌します。
    注:水銀は揮発性であり、プロセス中に蒸発する可能性があるため、熱滅菌は避けてください。
  4. (オプション)標準的な分析化学技術を使用して独立した測定のために、5% HCl を添加して、別の酸性化アリコートを調製します。バイオセンサーアッセイには、酸性化されていないサンプルのみを使用してください。
  5. 滅菌ろ過した環境サンプル5 mLを2× M9培地4.5 mLと混合し、サンプルを1:2に希釈します。
  6. 希釈したサンプル-培地混合物に0.5 mLの一晩培養液を接種します(ステップ5.4で説明したように調製します)。この接種は、培養物の20倍希釈に対応し、アッセイを開始するためのOD600 を0.05に導きます。
    1. Mer-RFPTransfer 200 μL のサンプル-培地混合物をマイクロプレートウェルに使用する場合は、ステップ 3.6 で説明したようにマイクロプレートリーダーを使用して測定を開始します。
    2. Mer-Blueを使用する場合:ステップ5.6で説明したように、10 mLのサンプル-培地混合物を37°Cで16時間インキュベートし、220 rpmで激しく振とうします。

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結果

どちらのバイオセンサーも、水銀フリー条件下では、それぞれのレポータータンパク質の検出可能なベースライン発現を示しません。マーブルーの培養物は、通常、接種後6〜8時間の間に、HgBr2 濃度の25 nM以上で肉眼で目に見える色を見せ始めます。適切に実施された場合、Mer-RFPまたはMer-Blueのいずれかを使用した滴定実験は、Hill係数が1に近いHill関数に適合する応答をもたらし、非協調的な結合挙動を示しています23。

Mer-RFPは、1 nMから1 μM HgBr2の信頼性の高い検出範囲を示しました。2 μM では、成長シグナルとレポーターシグナルの両方が著しく減少しました。対照的に、Mer-Blueは動作範囲が狭く、検出可能な応答は2 nMから125 nM HgBr2でした。高濃度(≥250 nM)では、10 mLの一晩培養における増殖阻害によると思われる、目に見える着色の顕著な減少が観察されました。

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ディスカッション

ここで利用されているバイオセンサー回路は、レポータータンパク質が異なるだけで同じです。どちらも高コピープラスミド上に完全にコードされているため、さまざまな菌株の 大腸菌 細胞に展開できます。 大腸菌 B株細胞では機能しているが、K-12株、特にDH5αおよび化学的にコンピテントな 大腸菌 細胞15では、Mer-Blueからのより強い色付きシグナルが観察された。

信頼性の高い出力を達成するには、イオン性水銀曝露時にかなりの細胞密度が必要であることが観察されました。これは、0.05または0.1のOD600 で培養を開始することによって、または本明細書に記載されるように、一晩培養からの1/20希釈を使用することによって達成することができる。あるいは、培養を非常に低い密度で開始し、0.05〜0.1のOD600 に達するまで1〜2時間成長させることもできます。この場合、水銀の添加が早すぎると、検出可能な信号が得られない可能性があることに注意してくだ...

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謝辞

この研究は、EF-041-2024-01 "Proyectos de Investigación aplicada"(助成金契約)の助成金契約PE501086520-2024-PROCIENCIAを通じて、Programa Nacional de Investigación Científica y Estudios Avanzados PROCIENCIAの支援を受けて発表されました。水銀バイオセンサーの開発は、South Initiativeの助成金コードPE2020SIN292B122を通じてVLIR-UOSから資金提供を受けました。M.D.は、VLIRUOS、DGD、およびCouncil of the Flemish Universities of Applied Sciences and Artsに対し、Global MindsプロジェクトBE2017GMHVLHC106の下でのXREI助成金に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
厚さ3mmのマルチプレックスウッド多くのディストリビューター
5 V USBケーブル多くのディストリビューター
96ウェル クリアフラットボトム ポリスチレンTC処理マイクロプレートコーニング3599
天粉末HiMediaGRM026
アンピシリンゴールドバイオテクノロジー株式会社A-301-100
CaCl2Millipore208290
カサミノ酸Calbiochem2040OP
D-(+)-グルコースセントラル ドラッグ ハウス (P) Ltd.506250
ESP32-CAM-MB 2640 Bluetooth WiFi カメラ モジュール USB - シリアル ポート開発ボード 自動ダウンロード (タイプ C)多くの販売代理店
ガラス培養管Corning9825
HgBr2、臭化水銀 (II) メルク200085
HgCl2、塩化水銀 (II)メルク21465
ルリアブロス(ミラー)シグマアルドリッチL3522
M9最小塩シグマアルドリッチM6030
MgSO4HiMediaGRM684
NeoPixelスティック-8 x 5050 RGB LED、ドライバー内蔵Adafruit1426
ミド:pUC-Mer-Blue 私たちのグループ-で利用可能なフルシーケンス
:pUC-Mer-RFP 私たちのグループ-フルシーケンス
リンジフィルター、親水性、細孔サイズ0.22ミクロンリポアSLGV004SL環境サンプルの滅菌用。
寒プラスhttps://www.mdpi.com/article/10.3390/bios14050246/s1 プラスミドは、https://www.mdpi.com/article/10.3390/bios14050246/s1 シで利用可能 ミ

参考文献

  1. Cooke, C. A., Balcom, P. H., Biester, H., Wolfe, A. P. Over three millennia of mercury pollution in the Peruvian Andes. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (22), 8830-8834 (2009).
  2. Gautam, R. K., Sharma, S. K., Mahiya, S., Chattopadhyaya, M. C. Contamination of heavy metals in aquatic media: transport, toxicity and technologies for remediation. Heavy Metals in Water: Presence, Removal and Safety. Sharma, S. K. , Royal Society of Chemistry. Cambridge. 1-24 (2014).
  3. Chen, C. Y., et al. A critical time for mercury science to inform global policy. Environ Sci Technol. 52 (17), 9556-9561 (2018).
  4. Ali, H., Khan, E., Ilahi, I. Environmental chemistry and ecotoxicology of hazardous heavy metals: environmental persistence, toxicity, and bioaccumulation. J Chem. 2019, 6730305(2019).
  5. Gao, Y., et al. Determination and speciation of mercury in environmental and biological samples by analytical atomic spectrometry. Microchem J. 103, 1-14 (2012).
  6. Ralston, D. M., O'Halloran, T. V. Ultrasensitivity and heavy-metal selectivity of the allosterically modulated MerR transcription complex. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (10), 3846-3850 (1990).
  7. Brown, N. L., Stoyanov, J. V., Kidd, S. P., Hobman, J. L. The MerR family of transcriptional regulators. FEMS Microbiol Rev. 27 (2-3), 145-163 (2003).
  8. Wang, D., et al. Structural analysis of the Hg(II)-regulatory protein Tn501 MerR from Pseudomonas aeruginosa. Sci Rep. 6, 33391(2016).
  9. Nucifora, G., Chu, L., Silver, S., Misra, T. K. Mercury operon regulation by the merR gene of the organomercurial resistance system of plasmid pDU1358. J Bacteriol. 171 (8), 4241-4247 (1989).
  10. Cai, S., et al. Engineering highly sensitive whole-cell mercury biosensors based on positive feedback loops from quorum-sensing systems. Analyst. 143 (3), 630-634 (2018).
  11. Guo, M., et al. Using the promoters of MerR family proteins as "rheostats" to engineer whole-cell heavy metal biosensors with adjustable sensitivity. J Biol Eng. 13, 70(2019).
  12. Wang, D., et al. Engineered cells for selective detection and remediation of Hg2+ based on transcription factor MerR regulated cell surface displayed systems. Biochem Eng J. 150, 107289(2019).
  13. Wang, D., et al. Visual detection of Hg2+ by manipulation of pyocyanin biosynthesis through the Hg2+-dependent transcriptional activator MerR in microbial cells. J Biosci Bioeng. 129 (2), 223-228 (2020).
  14. Guo, Y., Hui, C., Liu, L., Chen, M., Huang, H. Development of a bioavailable Hg(II) sensing system based on MerR-regulated visual pigment biosynthesis. Sci Rep. 11, 13516(2021).
  15. Zevallos-Aliaga, D., et al. Highly sensitive whole-cell mercury biosensors for environmental monitoring. Biosensors. 14 (1), 246(2024).
  16. Zhang, N. -X., et al. Versatile artificial mer operons in Escherichia coli towards whole-cell biosensing and adsorption of mercury. PLoS One. 16 (5), e0252190(2021).
  17. Chen, Y., et al. Advances in bacterial whole-cell biosensors for the detection of bioavailable mercury: a review. Sci Total Environ. 868, 161709(2023).
  18. Chen, S., Chen, X., Su, H., Guo, M., Liu, H. Advances in synthetic-biology-based whole-cell biosensors: principles, genetic modules, and applications in food safety. Int J Mol Sci. 24 (7), 7989(2023).
  19. Yu, W., et al. Genetically encoded biosensors for microbial synthetic biology: From conceptual frameworks to practical applications. Biotechnol Adv. 62, 108077(2023).
  20. Zhang, L., Guo, W., Lu, Y. Advances in cell-free biosensors: principle, mechanism, and applications. Biotechnol J. 15 (6), 2000187(2020).
  21. Vaccari, N. A., Zevallos-Aliaga, D., Peeters, T., Guerra, D. G. Biosensors characterisation: Formal methods from the perspective of proteome fractions. Synth Biol. 10 (1), ysaf002(2025).
  22. Liljeruhm, J., et al. Engineering a palette of eukaryotic chromoproteins for bacterial synthetic biology. J Biol Eng. 12, 8(2018).
  23. Alon, U. An Introduction to Systems Biology. , Chapman and Hall/CRC. Boca Raton. (2019).
  24. Lineweaver, H., Burk, D. The determination of enzyme dissociation constants. J Am Chem Soc. 56 (3), 658-666 (1934).
  25. Wyatt, L., et al. Spatial, temporal, and dietary variables associated with elevated mercury exposure in Peruvian riverine communities upstream and downstream of artisanal and small-scale gold mining. Int J Environ Res Public Health. 14 (12), 1582(2017).

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