インビボ 無傷の三叉神経節における一次感覚ニューロンのネットワークにおけるニューロンアンサンブルのカルシウムイメージング

一次感覚ニューロンは、皮膚を含む組織を直接神経支配し、感覚信号を中枢神経系(脊髄または脳幹)に中継します。三叉神経節 (TG) ニューロンは頭部を神経支配し、歯、眼窩周囲領域、口腔顔面および頭蓋顔面領域、顎関節 ^1,2、髄膜 ^3,4,5 からの痛みなどの感覚刺激に反応します。TGニューロンは、サイズ、髄鞘形成のレベル、および遺伝子発現プロファイルが異なります6,7,8,9。小さなニューロンは侵害受容性ですが、大きなニューロンは一般に痛みのない機械的刺激に反応します^10,11。三叉神経節ニューロンの機能不全は、ニューロン自体と中枢神経系(CNS)感覚ニューロンの両方を感作する可能性があります^11,12。

非病理学的状態の通常の生理学的状況では、生体内でニューロンを発火させることは痛みに必要ですが、過去20年間まで、生体内で無傷の感覚神経節を研究するためのツールは、一度に比較的少数のニューロンを監視することに限定されていました¹³。通常、細胞質カルシウム濃度が低いこと、活動電位中のカルシウム流入、および細胞質シグナルとしてのカルシウムの使用により、カルシウムダイナミクスは、カルシウム感受性蛍光指示薬を使用してin vivoで活動電位または細胞活動を監視するための強力な代理物です。この方法の理論的根拠は、蛍光顕微鏡がマウスの末梢感覚神経節において数百から数千のニューロンでこれらの指標を同時に監視できることである^{13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24}およびラット^25,26。これは、より限られた数のニューロンを in vivo で監視できる方法に比べて強力な利点です。

この方法の目的は、頭痛の痛みモデル19,23,24における機械的、温度的、化学的、およびホルモン的刺激に応答して、TG内の細胞質Ca^{2 +}動態をin vivoで直接観察することです。この方法は、口腔顔面領域の痛みやその他の体性感覚検査を補完するものとして使用できます。in vivo 三叉神経 Ca²⁺ イメージングは、熱および感覚コーディング^19,22、機械受容器の研究クラス²⁷、新しいクラスの機械感受性ニューロン²⁸ の発見、髄膜の正常な機械的ストレスに対する三叉神経反応の監視²⁹、痛みの感受性に対するホルモンの影響の研究²⁴、口腔顔面疼痛モデルの特徴付け³⁰ に使用されています、およびアルコール離脱誘発性疼痛の研究寄与者²³.

Pirt-GCaMP3マウスは、すべての(>95%)初代感覚ニューロンで高度に発現するPirt遺伝子のプロモーター領域にCa²⁺センサーGCaMP3が挿入されているため、in vivoでの神経活動のモニタリングを可能にします^12,18。この論文では、共焦点レーザー走査顕微鏡を使用した Pirt-GCaMP3 マウスの右側 TG の in vivo TG 外科的曝露とカルシウム指示薬顕微鏡データの収集と分析を行う技術を示します。

ここに記載されているすべての手順は、施設動物管理および使用委員会によって承認されたプロトコルに基づいて実行されます。手術は生存しません。この手順のセクション 1 と 2 は、開始直後に実行する必要があります。セクション3は後日実行される可能性があります。

1. 右側TGイメージングのためのマウスの固定と手術

注:Pirt-GCaMP3 C57BL / 6Jマウス¹⁸ は、性別に関係なく、成人の体型(通常8週間以上)を持っている必要があります。両側TGイメージングが可能です。ここに記載されている時間は、経験豊富な技術者による推定値です。出血が通常より多い場合は、時間ごとに数分長くなることがあります。

1. 40 mg/mL のケタミンと 6 mg/mL のキシラジンを含む滅菌生理食塩水を調製します。イメージング後の手術と安楽死に十分な量を準備します(マウス体重1グラムあたり最低9μL)。
   注: 生体内 イメージングでは、多くの種類の麻酔が使用されています。注意: ケタミンは、注射、飲み込み、または目に触れると有害です。取り扱いには注意してください。
2. すべての手術器具をビーズ滅菌器で滅菌します。器具を70%エタノールで洗浄します。
   注:または、事前に器具をオートクレーブします。
3. 体重1グラムあたり2.25 μLのケタミン/キシラジン(それぞれ90 mg / kgおよび13.5 mg / kgのケタミンおよびキシラジン)を、手術の15〜25分前にPirt-GCaMP3マウスにi.p.注射します。ケタミンは120mg/kgを超えないようにしてください。
4. 麻酔薬注射の15〜25分後(ステップ1.3)、鉗子で後足をつまんで、マウスが外科的麻酔面上にあることを確認します。
   注:ピンチは、意識のあるマウスに発声を引き起こすのに十分な強度である必要がありますが、怪我を引き起こすほど強くはありません。体温の低下を避けるために、このステップでマウスを必要以上に長く放置しないことが重要です。可能であれば、ケージを暖かく保つことが役立ちます。
5. マウスを加熱パッドの上に置いて体温が37°Cに維持されるようにし、マウスの頭を定位マスク(図1A、B)に置き、頭を左に約15°傾けます(図1B)。
   注:頭部を安定させ、イソフルランを投与する経路を提供する定位マスクについて、ここでは説明します。手順でイソフルランを使用しない場合、または定位マスクが使用されていない場合は、動きを防ぐために頭を安定させる別の方法を使用する必要があります。
6. 刺激は三叉神経の活動を誘発するため、乾燥や刺激を防ぐために目に眼科用軟膏を塗ります。
7. マウスの頭の右側を剃ります。
   注:このステップには90秒かかります。調査員は、シェービングのために動物を加熱パッドから一時的に取り除くことがあります。
8. 右耳と右目の間に9 mm x 5 mmの長方形の切開を行います(図2A)。止血スワブまたは実験用ワイプで出血を止めます。
   注:このステップには2分かかります。治験責任医師は、止血鉗子またはリトラクターを使用して切開部を開いたままにする場合があります。これは非生存手順であり、追加の洗浄は不要です。ただし、治験責任医師は、手術部位をポビドンヨードで綿棒で拭く場合があります。最大許容切開サイズが与えられます。外科医が十分なスキルを持っている場合は、組織の損傷を最小限に抑えるために、大きな切開よりも小さな切開が望ましいです。TGはこの組織を神経支配し、損傷する可能性があります。
9. 頭蓋骨表面の組織(骨膜)を目のすぐ腹側に切断します(図2B)。
10. 歯科用ドリルとテーパー裂隙TNTバー31pを使用して、切開部位を中心とする背側頭蓋骨に約9 mm x 5 mmの穴を開けます(図2C)。バーを頭蓋骨の表面にできるだけ軽く当てます。
    メモ:この手順には約2分かかります。外科医が十分なスキルを持っている場合は、大きな穴よりも小さな穴が望ましいです。
11. TGがはっきりと見えるまでヘッドを傾けます(図2C)。TGに出血がある場合は、血液を吸引するか、止血スワブまたは実験用ワイプで吸い上げて血液を取り除きます。皮質組織を除去せずにTGがはっきりと見えることを確認します(図2C)。
    注:ニューロンに苦痛の兆候なしに3〜6時間以上TGを日常的に画像化しますが、研究者はTGの乾燥を防ぐためにカバーガラスまたはその他のカバーを配置することを選択できます。
12. 動物と加熱パッドを顕微鏡ステージに移動し、マウスの鼻を定位固定ノーズコーンに入れます。マウスが継続的なイソフルラン麻酔を受けるように、酸素/イソフルランラインを接続します(図3A)。
    注:この手順には3分かかります。連続イソフルランには、酸素タンク、ガス供給チューブ、麻酔気化器が必要です。麻酔薬を定期的に注射することで、処置中ずっと麻酔を維持することも可能です。
13. 顕微鏡の対物レンズが頭蓋開口部の真上に9 mmになるように定位固定フレームを配置します(図3B)。
    注:正確な距離は、対物レンズ、顕微鏡、マウスによって異なります。
14. 直腸体温計を挿入します。電源コードを直腸体温計と加熱パッドに接続します。麻酔マスクを1%イソフルランを含む酸素ラインのイソフルランに接続します。

2. TGイメージング

注:緑色(FITC)設定495 nm、発光519 nm、検出波長500-580 nm、GaAsP-Pmt1イメージングデバイス、GaAsP-PMT検出器を使用するか、顕微鏡の推奨設定を使用してください。ソフトウェア設定の概要については、 表 1 を参照してください。

1. 5x/0.25 M27対物レンズ、顕微鏡メーカーのソフトウェア、および垂直共焦点レーザー走査型顕微鏡を使用してください。顕微鏡でTG表面を見つけます。
   注:客観的な選択は、顕微鏡と研究者の好みによって異なります。
2. 対物レンズとノーズコーンを調整して、TG表面をできるだけ平らにし、焦点面の表面積を可能な限り大きくします。
   注:よりフラットなTGは、より鮮明な画像を提供し、ソフトウェアがより鮮明なムービーを構成し、より多くのニューロンを画像化し、より傾いたTGと比較して分析の精度を簡素化および向上させます。
3. 麻酔マスクを通る酸素流に1〜1.5%イソフルランを塗布することにより、マウスを麻酔下で維持します。
   注:動物が麻酔下にあることを確認するために、20〜30分ごとに後足をつまんで、手順全体を通して動物を注意深く監視する必要があります。麻酔を維持するために必要なイソフルランの割合は、個々のマウスによって異なります。テストピンチ中に動物が動く場合は、イソフルランを増やす必要があります。呼吸が浅くなった場合は、イソフルランを減らす必要があります。注意: イソフルランは吸入すると有害であり、めまいや眠気を引き起こす可能性があります。吸入を避け、作業エリアに十分な換気があることを確認してください。
4. 顕微鏡の高速スキャンプロトコルをロードします: ボクセルサイズ4.160 μm x 4.160 μm x 14 μm、512 x 512ピクセル、10光学スライスZスタック、1.02エアリーユニット(AU)/ 33 μm、15%488 nmレーザー出力/ 75 mW、ピクセル時間1.52 μs、ライン時間0.91 ms、フレーム時間465 ms、LSMスキャン速度8、双方向スキャン、GaAsP-PMT検出器ゲイン550 V、 デジタルゲイン 1.
   注:最適な設定は、顕微鏡と動物によって異なる場合があります。
5. TGを6〜8サイクルの短いバーストでスキャンします。スキャンの直交投影(1回のスキャンで1つのムービーフレームが作成されます)を作成してムービーを作成し、画像の鮮明さとフレーム間の一貫性を確認します。必要に応じて、立体フレームの位置と光学セクションの厚さを調整し、鮮明で一貫性のあるムービーが作成されるまでこの手順を繰り返します。
   注:マウスの頭が動く場合、または研究者がマウスの位置を変更したり、焦点面を調整したりする場合は、この手順を繰り返す必要があります。
6. 顕微鏡の高解像度スキャンプロトコルをロードします: ボクセルサイズ0.520 μm x 0.520 μm x 14 μm、4096 x 4096ピクセル、6光学スライスZスタック、1.02エアリーユニット(AU)/ 33 μm、20%488 nmレーザー出力/ 100 mW、ピクセル時間0.52 μs、ライン時間4.95 ms、フレーム時間20.26秒、LSMスキャン速度6、双方向スキャン、 GaAsP-PMT検出器ゲイン550V、デジタルゲイン1。
   注:最適な設定は、顕微鏡と動物によって異なります。細胞がtd-Tomatoで標識されている場合は、緑色のチャネルに加えて、赤色チャンネル592nm励起/614nm発光、検出波長600〜700nmをスキャンするように顕微鏡を設定します。
7. TGの高解像度画像を作成します。
   注:この画像は、ニューロンを数えたり、薄暗いニューロンの直径を測定したり、同じニューロンが2つの異なる刺激に反応したのか、2つの異なるニューロンが反応したのかを区別するための詳細な画像を提供するのに役立ちます。
8. 顕微鏡の高速スキャンプロトコルをロードします(ステップ2.4を参照)。
9. 自発的な活動を80サイクル(約10分)記録します。直交投影ムービーを作成し、画像が分析するのに十分な鮮明さと一貫性があることを確認します。
   注: これにより、自発的な活動を分析するのに十分なフレームが生成されます。この数は、特定の実験にとって自発的な活動がどれほど重要であるかに応じて、増減することができます。
10. 刺激を加えるには、顕微鏡を15〜20サイクルスキャンするように設定します。
    注:マウスの頭を動かさないように刺激を加えるときは注意してください。刺激中にTGをミクロンでも動かすと、イメージングが中断される可能性があります。スキャンにより、サイクルはベースライン、刺激を確立し、刺激が除去された後のニューロンを観察することができます。
11. サイクル 1 から 5 が完了するまで待って、ベースラインを生成します。スキャン中に刺激を加えます 6〜10。ニューロンの脱感作を避けるために、各刺激の後に少なくとも5分待ちます。
    注:各刺激には、個別の15〜20サイクルのスキャンが必要です。最初に機械的刺激を加え、次に冷熱、熱、化学的刺激を加えます。高周波刺激(高い機械的力、室温から遠い温度)の前に、低周波刺激(機械的な力が低い、温度が室温に近いなど)を加えます。刺激を加えるときはTGを動かさないように注意してください。スキャンがはっきりと聞こえる場合は、スキャンの直後に刺激を加えることができます 5.ただし、刺激のタイミングを一定に保つ方法はどれでも機能します。景気刺激注文に関する議論を参照してください。
12. TGのV2部分が神経支配する領域のフォンフレイの場合、フィラメントを持ち、スキャン5の直後からスキャン10の直後まで、目の下と口の上の同側領域に繰り返し塗布します。
13. TGのV3部分によって神経支配されている領域のフォンフレイの場合、フィラメントを持ち、スキャン5の終了直後からスキャン10の終了直後まで、耳のすぐ下の同側領域に繰り返し適用します。
14. 冷熱刺激の場合は、ウォータービーカーを希望の温度よりわずかに低い(冷たい場合)またはより高い(熱の場合)まで冷却または加熱してから、プラスチックトランスファーピペットを使用してスキャンを開始します。スキャン5の直後にトランスファーピペットで、目のすぐ下、口の上(V2の場合)、または耳のすぐ下(V3の場合)の同側領域に刺激を加えます。
    メモ:温度がスキャン5の希望温度の1°C以内であることを確認してください。ニューロンの脱感作を避けるために、ビーカーの温度が正しくない場合は刺激を加えないでください。代わりに、水をもう一度冷やすか温めて、もう一度試してください。
15. 実験の最後に、サイクル6からV2またはV3領域に50 mMの塩化カリウムを皮下注射して、すべての応答性ニューロンを活性化して識別します。
16. すべての刺激が投与され、記録された後、ケタミン/キシラジンの過剰摂取(ケタミン1kgあたり200mg、キシラジン1kgあたり30mg、またはステップ1.1で調製した溶液1.1あたり5μL)によって動物を安楽死させ、首を切る。

3. 分析のためのプロトコル

1. ドラッグ&ドロップオプションを使用して、直交投影ファイルを開きます。画像の種類を画像 |タイプ |RGB カラー。オプション: Plugins | jars |StackReg を使用して、モーション アーティファクトを修正し、位置合わせを行います。
   注: 調査員は好みに基づいて画像の種類を選択できます。RGB は、公開用のカラー画像の作成を簡素化します。
2. Analyze |ツール |ROI マネージャー。
3. ツールバーの楕 円 または 長方形 ツールを使用してROIを描画してアクティブなニューロンを選択し、ROIマネージャーウィンドウの[ 追加 ]ボタンをクリックするか、「t」キーを押してROIファイルに配置します。
   注: ROI ファイルを頻繁に保存してください。ROI を復元するには、ROI ファイルを ImageJ にドラッグ アンド ドロップし、ROI マネージャー ウィンドウの下部にある [ すべて表示 ] ボックスをクリックします。ROI .zip ファイルを保存すると、ROI をオーバーレイとして保存する場合と比較して、分析が簡素化されます。ベースライン期間中に変動するニューロンは、刺激に反応するのではなく、自発的に活動するものとして除外する必要があります。
4. 分析 |測定設定で、 平均グレー値に チェックを入れます(オプションですが、推奨: 測定設定の下の他のすべてのボックスをオフにします)。
5. [詳細] |強度を測定するためのマルチメジャー。
   注:隣接するニューロンが近すぎて、別のROIを引き出すことができない場合があります。これらのニューロンは、アクティブニューロン数に含めることができますが、過渡強度測定には含めることはできません。
6. マルチメジャーは、「結果」というラベルの付いた新しいウィンドウに CSV ファイルを生成します。[ ファイル] |名前を付けて保存。.csvファイルをスプレッドシートソフトウェアで開き、ファイルをスプレッドシートとして保存します。
   注:解析テンプレートについては、 補足ファイル1 を参照してください。
7. Ca²⁺ 過渡強度を ΔF/F₀ = (F_t- F₀)/F₀ として計算します。ここで、F_t は関心のある時点での ROI のピクセル強度であり、F₀ は、自発的な活動の場合は Ca²⁺ 過渡現象に先行する 2-4 フレーム、または刺激誘発性 Ca²⁺ 過渡現象の場合は最初の 1-5 フレームの平均強度によって決定されるベースライン強度です。刺激前にCa²⁺ ピークを生成し、刺激後の活動を分析しないすべてのニューロンを除外します。
8. Ca²⁺ 過渡強度分析では、各神経節からほぼ同じ数のニューロンをランダムにサンプリングして、応答するニューロンの数が最も多い神経節が分析を支配しないようにします。ΔF/F₀ < 0.15 のピークを除外します。
   注:ニューロン^{15、16、19、22、32、33、34、35}を分析し、含め、除外するための別の公開された方法があります。
9. ツールバーの [線] ツールを使用して、ImageJ で描画された線の最長直径と最短直径に沿って平均長さを計算して、ニューロンの直径を測定します。
   注: 研究者は、ROI の面積と楕円形のパラメーターを測定して、直径を推定することもできます。

Pirt‐GCaMP三叉神経節の共焦点走査による多数のニューロンと特異的三叉神経枝のイメージング
Pirt-GCaMP3マウスの外科的TG曝露後、共焦点顕微鏡により、>3,000を超えるニューロンを同時にイメージングできます(図4)。これにより、通常の生理学的状況で何千ものTGニューロンを同時に観察できるという強力な利点が得られます。自発的なCa2+過渡現象は、刺激がない場合でも監視できます(図4A、Bおよびビデオ1)。刺激は、V2(図4D、Eおよびビデオ2)またはV3(図4G、Hおよびビデオ3)によって神経支配された領域に適用できます。自発的なCa2+過渡現象(図4C)およびこれらの刺激に応答して発生する過渡現象(図4Fおよび図4I)を監視できます。

Ca2+過渡現象を生成する細胞数の増加と、より強い刺激によるCa2+ 過渡現象の振幅の増加
強い刺激や有害な熱はCa2+反応を増加させます。0.4 gのフォンフレイフィラメントと比較して、2 gのフィラメントの適用により、Ca2 +過渡現象を生成するニューロンの数が増加しました(図5A、対応のあるスチューデントのt検定t = 3.786、df = 6、p = 0.0091)。また、Ca2+ 過渡現象の平均 ΔF/F0 振幅 (図 5B、C、刺激相互作用×双方向分散分析時間 F5,2796 = 3.605、df = 5、p = 0.0030) および最初の刺激フレーム中の振幅 (Šidák の多重比較検定、t = 3.758、df = 2796、調整済み p = 0.0010)。

図1:イメージング用マスク付き定位固定神経麻酔ヘッドホルダー。 (A)麻酔マスクを加熱パッドで金属板にボルトで固定したマウスヘッドホルダーの写真。歯のホルダーとノーズコーン/麻酔マスクが示されています。加熱パッドは損傷を防ぐためにアルミホイルで覆われています。(B) 手術および画像撮影の準備のために、麻酔ヘッドホルダー内でマウスを 15° 傾けた写真。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:イメージングのための三叉神経節の外科的露出。 (A)皮膚に小さな切開を施したマウス。(B)三叉神経節露出用の穴を準備するために頭蓋骨から組織を洗浄したマウス。(C)右三叉神経節が露出し、イメージングの準備が整いました。脳組織は除去されませんでした。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:イメージングのためにマウスを顕微鏡ステージに置く。 (A)顕微鏡ステージ上の定位固定装置内のマウス。直腸体温計とイソフルランチューブが示されています。(B)イメージング用に準備されたマウス。対物レンズは、外科的に準備された頭蓋骨の穴から約9mm上にあります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:三叉神経節のV2(上顎)およびV3(下顎)領域によって神経支配される領域への有害な熱刺激の適用。(A)200フレームにわたるTGの強度投影の合計(ImageJでは、画像|スタック|Zプロジェクト|プロジェクションタイプ|Sum Slices)を使用します。(B) 200フレームにわたるTGの最大強度投影(ImageJでは、画像|スタック|Zプロジェクト |プロジェクションタイプ|最大強度)。黄色の矢印のコールアウトは、応答しているニューロンを示します。(C)パネルBのコールアウトで示された6つのニューロンのΔF / F0強度プロット。各ニューロンは異なる色でグラフ化されています。(D)V2領域が神経支配する皮膚に50°Cの水を適用する前のTGの最大強度投影。(E)V2領域が神経支配する皮膚に50°Cの水を適用する際のTGの最大強度投影。黄色の矢印のコールアウトは、応答しているニューロンを示します。(F)パネルEのコールアウトで示された6つのニューロンのΔF / F0強度プロット(V2領域によって神経支配された領域に適用される有害な熱)。(G)V3領域が神経支配する皮膚に50°Cの水を適用する前のTGの最大強度投影。(H)V3領域が神経支配する皮膚に50°Cの水を適用する際のTGの最大強度投影。黄色の矢印のコールアウトは、応答しているニューロンを示します。(I)パネルHのコールアウトでラベル付けされた6つのニューロンのΔF / F0強度プロット(V3によって神経支配された領域に有害な熱が加えられます)。スケールバー = 200 μm (A、B、D、E、G、H)。略語:TG =三叉神経節;ΔF/F0 = Ca2+ 過渡強度。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:V2によって神経支配された領域の2つの異なる力によって誘発されるCa2 +活性。 (A)V2によって神経支配された7つの神経節のニューロン数のグラフは、0.4 gフォンフレイと2gフォンフレイの適用中のCa2+過渡現象、および7つの神経節における2 gフォンフレイと0.4 gフォンフレイの間で活性化されたニューロンの数の違いを示しています。平均値とSEMが表示されます。(B)V2が神経支配する領域における0.4 gフォンフレイ(上)および2 gフォンフレイ(下)の適用によって生成されたCa2+過渡現象のΔF / F0強度のグラフ。灰色の線は個々のセル、赤い線は平均強度です。(C)V2が神経支配する領域における0.4 gフォンフレイおよび2 gフォンフレイの適用によって生成されたCa2+トランジェントの平均ΔF / F0強度のグラフ。平均値とSEMが表示されます。セル数の統計量は、対応のあるスチューデントの t 検定です。過渡強度の統計は、2 元配置分散分析とそれに続くシダーク多重比較検定です。**p < 0.01。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1:TGでPirt-GCaMP3を画像化するために使用した共焦点走査型顕微鏡設定の概要。 3番目の列では、各設定の機能について簡単に説明します。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ビデオ1:右側三叉神経節における 自発的なCa2 +活動。刺激のない下で自発的なCa2+過渡現象と安定した高Ca2+濃度を示す三叉神経節このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ビデオ2:三叉神経節のV2枝によって神経支配される口腔顔面領域に50°Cの水を適用することによって誘発される Ca 2+トランジェント。V2口腔顔面領域への50°Cの水の適用に応答してCa2+過渡現象を示す三叉神経節このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ビデオ3:三叉神経節のV3枝によって神経支配される口腔顔面領域に50°Cの水を適用することによって誘発される Ca 2+過渡現象。V3口腔顔面領域に50°Cの水を適用したと応答してCa2+過渡現象を示す三叉神経節このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル 1: 分析スプレッドシートの例。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。