線維症を伴う代謝機能障害関連脂肪性肝疾患のマウスモデル

サマリー

代謝機能障害、肝臓遺伝子発現の変化、およびヒトMASLDに似た肝臓病理組織学的変化を伴う代謝機能障害関連脂肪性肝疾患(MASLD)のマウスモデル(進行性線維症ステージ3に進行する線維症を含む)。このモデルは、MASLDの病態生理学の研究や、新しい治療法の前臨床試験に使用することができます。

要約

肝線維症は、代謝機能障害関連脂肪性肝疾患(MASLD)の有害な転帰の最も重要な予測因子です。MASLDの前臨床試験では、マウスが最も一般的に使用される疾患モデルです。しかし、これらのモデルでは、肝線維症を誘発することは困難です。このプロトコルは、過食性Ayマウスに脂肪とフルクトースを多く含む食事を与え、米国の平均的な食事に似たMASLDのマウスモデルを記述しています。マウスは、脂肪肝、損傷、炎症、および線維症を発症します。線維症は、16週間後に細胞周囲、ステージ1の線維症から、12ヶ月後にブリッジング、ステージ3の線維症に進行します。これらのマウスは、肥満、高トリグリセリド血症、耐糖能異常、および高インスリン血症も発症します。この疾患モデルは、肝臓の組織病理学、肝臓の遺伝子発現の変化、およびヒト疾患の代謝機能障害を再現します。このプロトコルには、線維症を定量化するための2つの方法が含まれています:ピクロシリウスレッドによるコラーゲンの組織学的染色と、ヒドロキシプロリンの肝臓含有量の定量化。これらの方法は、MASLDの病態生理学の研究や、潜在的な治療法の前臨床試験に使用できます。

概要

代謝機能障害関連脂肪性肝疾患 (MASLD) は最も一般的な肝疾患であり、有病率は米国で 31% から 40%、世界で 42% です 1,2,3,4。MASLDの患者は、代謝機能障害関連脂肪性肝炎(MASH)、以前は非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬変、および肝細胞癌^を発症する可能性があります^5,6。MASLDは肝細胞がんのリスクを高め、近年のMASLDの有病率の増加を受けて、肝細胞がんを発症する患者で最も一般的な肝疾患となっています^7,8。MASLDでは、線維症は肝硬変への進行と、肝臓関連の罹患率(肝代償不全、肝不全、または肝臓がん)および肝臓関連の死亡率^6,9,10,11を含む有害な臨床転帰の主要な予測因子です。したがって、食品医薬品局(FDA)は、線維化を伴うMASH/NASHに焦点を当てた治療法の開発、および適切な動物モデルの使用を奨励している¹²。

薬物の前臨床試験やMASLDの機構研究では、マウスモデルが最も一般的に使用されています¹³。MASLDの何千ものマウスモデルが記載されており、最適なモデル^13,14に関するコンセンサスの欠如を示唆しています。最適なモデルの構築には、いくつかの課題があります。マウスに高脂肪の食事を与えることにより、マウスの肥満および脂肪症を誘発することは比較的容易であるが、肝線維症を誘発することはより困難である13,14,15,16。肥満食によって駆動されるMASLDモデルでは、線維症はゆっくりと進行します¹⁷このゆっくりとした進行は、人間の病気¹⁸をよりよく模倣する可能性がありますが、動物研究の期間とコストを増加させます。コレステロール含有量が高い食事(例:2%)は、線維症の発症を促進します。しかし、それらはまた、ヒトの疾患^15,16に記載されている増加とは逆のコレステロールの内因性合成を減少させます。一部のMASLDモデルは、突然変異マウスまたは遺伝子組み換えマウスを使用します。ただし、OB / OBマウスは肥満、脂肪症、およびインスリン抵抗性を発症しますが、線維症のメディエーターであるレプチンを欠いています。PTEN欠損マウスは脂肪症を発症するが、インスリン抵抗性は発症しない^15,17。したがって、MASLDのマウスモデルは、重大な線維症を発症するために、長い研究期間、高コレステロール含有量の食事、または遺伝子操作を必要とすることがよくあります¹⁴。これらの問題のいくつかに対処するために、我々は、動物が細胞周囲/類洞周囲(ステージ1)から架橋性線維症(ステージ3)に進行する線維症を伴うMASLDを発症するマウスモデルを開発しました¹⁹。

この記事の目標は、このMASLDのモデルと肝線維症、および線維症を定量化する2つの方法(ピクロシリウスレッドによるコラーゲン組織学的染色と肝臓ヒドロキシプロリン含有量の定量化)について説明することです。

このモデルを開発した理論的根拠は、最も有用な動物モデルは、疾患のドライバーと組織病理学および遺伝子発現の変化の両方で、ヒトの疾患を最もよく再現するモデルであるというものでした。したがって、適度に高い量の脂肪と果糖^19,20を含む、米国の平均的な食事に似た食事を使用しました。この飼料を、肥満のモデルとして広く使用されているアグーチイエロー(A^y)変異を持つマウスに与えました²¹。これらのマウスは、MC4Rを含むメラノコルチン受容体のアンタゴニストであるアグーチタンパク質を遍在的に発現し、過食を引き起こし、ヒトの肥満によく見られる食物摂取量の増加を再現します21,22,23。このモデルは、脂肪症、肝細胞損傷、炎症、線維症、代謝機能障害など、MASHを定義する変化を再現しています。

このモデルの主な利点は、人間の病気に似ている特性です。このモデルは、典型的な米国の食事に似せて設計されており、ヒトMASLDの表現型を再現する上で最も効果的な食事であることが示されています^14,20。マウスは、MASH^19,24のヒトの肝臓に記載されているものと同様の肝臓組織病理学的変化を発症します。マウスは代謝機能障害を発症しますが、これはMASLD⁵の診断に不可欠な基準です。MASHマウスの肝臓は、MASH/^NASH19のヒトの肝臓を再現する遺伝子発現の変化を示しています。最近の研究では、MASLDの39のマウスモデルがヒトの病気との類似性について比較されました。これには、MC4Rノックアウトマウスが含まれていたが、これらは過食症の同じメカニズムを共有し、我々が記述するモデルと同じ食事療法を受けた¹⁴。このモデルは、表現型、肝臓組織病理学、およびトランスクリプトミクスによって評価されたヒトMASLDとの類似性で5位(39点中)にランクされました¹⁴。

このモデルのさらなる利点は、Ayマウスがジャクソン研究所から市販されており、代謝研究で一般的に使用されるC57BL/6J系統で利用可能であることである^21,25;突然変異マウスは、毛髪の色で簡単に識別できます。このモデルは、機能獲得または機能喪失のモデルと組み合わせて、MASLDの発症における特定の遺伝子の役割を研究することができます。そして最後に、このモデルは、MASLDの一般的な原因ではなく、ヒトの病気を再現しない可能性のある栄養素欠乏症(コリンまたはメチオニン欠乏症)、異常な食品成分(コール酸、エチオニン)、特定の栄養素(トランス脂肪酸、エチオニン)の異常に高い含有量、または肝毒素(四塩化炭素)を使用していません13,14,17。

この方法は、MASLDの発症と進行に寄与するメカニズムの調査、およびMASLDの治療または予防のための介入の評価に適しています。このモデルは、動物が脂肪性肝炎と代謝機能障害の両方を発症するだけでなく、ステージ3に進行する線維症も発症するため、特に有用です。このモデルは、摂食行動に影響を与えるメカニズム(GLP1Rアゴニストなど)の研究には適していない可能性があります。なぜなら、これらのマウスは過食性を患っているからです。

プロトコル

このプロトコルは、ブルックリン大学の動物管理ガイドラインに準拠しています。IACUC プロトコル番号 318。

1. 線維化を合併したMASLDのマウスモデル

1. マウスを繁殖させてAyの子孫を産みます。Ayマウス(B6.CG-AY/J)。子犬の生年月日を記録します。
2. 同腹児の数が同数の子犬を産むようにして、適切で均一な摂食と成長を促進します。これはC57BL/6Jマウスの平均同腹児数であるため、1腹あたり5〜6匹の子犬を産むことを目標としてください。余分な子犬は、優先的には必要のない性別の子犬を安楽死させるか、育てることができます。
   注:野生型C57BL/6J雌マウスは入手が容易で、Ay雌マウスよりも優れたブリーダーである可能性があるため、Ay雄と野生型雌(C57BL/6J Jax 0000664)を使用すると、繁殖効率が向上する可能性があります。
3. 以下で説明するように、実験用のケージを設定します。
   1. Ayマウスは黄色の毛色で識別します。各マウスに一意のIDを割り当て、マウスにタグを付けるかマークします。
      注:アグーチ遺伝子のアグーチイエロー(Ay)対立遺伝子は、黄色のコート色を与えます。対立遺伝子はヘテロ接合体で半優性です。ホモ接合性は胚致死を引き起こします。したがって、黄色の毛色のマウスはAy遺伝子に対してヘテロ接合体です。
   2. 生後21日でマウスを離乳させます。研究中に同じケージに収容されるマウスをグループ化します。ケージごとに3匹または4匹のAyマウスを収容します(予想される体重と施設のガイドラインに従って)。
   3. 標準的なチャウと水を与えます。標準温度(20-23°C)および相対湿度(40%〜60%)のハツカネズミを、12時間の明るいサイクル、12時間の暗いサイクルで観察します。
4. Ayマウスに、以下で説明するように、8週齢から脂肪と果糖を多く含む食事(高脂肪および果糖食、HFFD)を与えます。
   1. 脂肪とスクロースを多く含む西洋型食をAyマウスに提供します(調整カロリー西洋型ダイエットInotiv TD.88137) 広告自由。
   2. 飲料水にフルクトース(23 g / L)とグルコース(19 g / L)を含む溶液を準備します。.0.2μmフィルターでろ過して溶液を滅菌し、滅菌ボトルで保存します。開封後は、溶液を冷蔵してください。
   3. マウスに、無菌の飲用ボトルにフルクトースとグルコースを含有する溶液を飲用用として供給します。溶液とボトルを少なくとも毎週交換し、微生物の増殖を確認します。
   4. 栄養価のないケージ敷き(木材チップなど)を使用してください。
5. 飼料制御マウスは、以下に説明するように、脂肪とフルクトースが少ない飼料です。
   注:使用する対照マウスの種類は、研究デザインによって異なります:Ay-HFFDマウスを使用して薬物の効果を評価する場合、対照マウスはプラセボで治療されたAy-HFFDマウスにすることができます。このモデルを使用して、遺伝子組み換えが線維症の発症に及ぼす影響を研究する場合、遺伝子組み換えのないAy-HFFDマウスを対照として使用できます。MASH を使用しないコントロールが必要な場合は、ここで説明する手順に従います。
   1. Ayマウスの同腹仔である野生型マウスを使用してください。彼らは黒いコートの色で識別できます。
   2. マウスに対照食(Low Fat Control Diet Inotiv TD.08485;低脂肪および果糖食、LFFD)を同じ年齢から開始して与えます。マウスに定期的な飲料水を提供します。
6. マウスの体重を毎週測定し、覚醒した動物を実験室の天秤の上の風袋容器に入れ、その体重を記録することにより、肥満の発症を監視します。
7. マウスが常に十分な食物と飲用溶液を持っていることを確認してください。必要に応じて、食品や飲料溶液の消費量を監視および記録して、カロリー摂取量を推定します。
8. 以下に説明するようにティッシュを収集します。
   1. HFFDダイエットを16週間後に組織採取します。二酸化炭素の吸入(または機関のIACUCによって承認された他の方法)によってマウスを安楽死させます。
      注:16週間後、HFFD食を与えられたAyマウスは通常、ステージ1の線維症を示します。期間を長くすると、線維化が進み、9〜12か月後にステージ3に進行します。
   2. マウスの重量を量り、重量¹⁹を記録します。
   3. 必要に応じて採血します。これを行うには、腹部を開いた後、肝臓を解剖する前に、1 mLの注射器と27Gの針で下大静脈から血液を採取します(または、IACUCによって承認された他の方法を使用します)。
   4. 正中線切開で腹部を開き、鉗子で肝臓を肺門で保持し、肝臓を横隔膜と後腹膜に結合する靭帯をハサミで切断して、肝臓を解剖します。肝臓の重量を量り、重量を記録します。
   5. 氷冷リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)で肝臓をすすぎます。肝臓を撮影し、定規またはその他のオブジェクトを画像の参照サイズとして含めます。氷の上に置かれたペトリ皿に肝臓を置きます。
   6. 正中葉、左葉、右葉を含むいくつかの葉のサンプル(サンプルあたり約100〜150 mg)を解剖します。固定を容易にするために、サンプルの厚さが4mm以下であることを確認してください。固定液(ホルマリン10%またはホルムアルデヒド4%)に24時間入れ、病理組織学的分析のために処理します(下記参照)。
   7. いくつかのローブの追加サンプルを解剖します。チューブ(1.5mLまたは2mL)に入れ、液体窒素に浸して凍結し、-80°Cで保存します。 これらのサンプルは、ヒドロキシプロリン含有量の測定に使用されます。
   8. 必要に応じて他の臓器(脂肪組織、筋肉など)のサンプルを採取します。

2. コラーゲン組織化学的染色と形態計測定量

注意: 有害および/または揮発性の化学物質の使用が必要な手順は、ドラフト内で行う必要があります。すべてのスライドは、染色皿とスライドホルダーを使用して並行して処理する必要があります。

1. 以下に説明するように肝臓切片を準備します。
   1. 肝臓組織をホルマリン(またはホルムアルデヒド)に室温で24時間保持して固定します。ティッシュの体積の20倍大きい量の固定剤を使用してください。次に、組織を70%エタノールに移します。この時点でプロトコルを一時停止できます。
      注:組織は組織学カセットに入れ、固定剤を入れた容器に入れるか、または個々の容器またはチューブに入れることができます。
   2. パラフィンに組織を埋め込みます。これは通常、組織病理学の中核施設またはサービスによって行われます。
   3. スライドに取り付けた厚さ0.5μmの切片を入手します(帯電していないスライドで十分です)。切片を室温で空気にさらして乾かします。組織病理学の中核施設またはサービスは通常これを行います。この時点でプロトコルを一時停止できます。
2. 以下に説明するように、セクションを脱パラフィンして水分を補給します。
   1. 切片を脱パラフィン化/清澄化溶液(キシレンまたはシトリソルブ)の2つの変更にそれぞれ5〜15分間浸すことにより、セクションを脱パラフィンします。
   2. スライドを100%エタノール、95%エタノール、70%エタノール、および水にそれぞれ5分間連続して浸して再水和します。
3. 以下に説明するように、切片をピクロシリウスレッドで染色します。
   1. 切片をシリウスレッド(ダイレクトレッド80)1 g / Lのピクリン酸1.3%溶液に1時間浸します。.直接の赤色はコラーゲン以外の構造(核など)を染色する可能性があるため、あまり長く染色しないでください。対比染色が必要な場合は、染色液にファストグリーン(1 g / L)を加えます²⁶。あるいは、Weigertのヘマトキシリン²⁷で核を染色します。
   2. ピクロシリウスレッド溶液を閉じた暗いガラスまたはプラスチックの容器に戻して保管します。このソリューションは複数回再利用できます(少なくとも20年間²⁷)。
4. サンプルをエタノール(100%)に5分間浸漬して脱水します。エタノールの2回目の交換で繰り返します。
5. 清澄溶液(キシレンまたはシトリソルブ)に沈め、取り付けのために個別に除去します。
6. 清澄溶液から一度に1枚のスライドを取り出し、ペーパータオルで吸い取って余分な液体を取り除きます。封入剤(約50〜100μL)を添加します。セクションをカバースリップで覆い、カバースリップをそっと押し下げて気泡を取り除きます。風乾させます。
   注:この時点でプロトコルを一時停止できます。
7. 明視野照明と対物レンズ4倍から20倍を備えた光学顕微鏡を使用して切片を観察します-コラーゲンは明るい黄橙色の背景に赤く見えます。カメラの指示に従って、カラーカメラで関心のある領域を撮影します。
8. 以下に説明するように偏光顕微鏡でイメージングを行います。
   1. 偏光子とアナライザーフィルターを直交させて調整し、コラーゲンが見え、バックグラウンド信号が最小限に抑えられるようにします。コラーゲンは、暗い背景に白、黄色、またはオレンジ色で表示されます。線維化がほとんどまたはまったくないセクションでは、血管壁のコラーゲンが見えます。照明強度などの設定は、比較するすべてのサンプルで同じに保ちます。
   2. モノクロカメラまたはカラーカメラのモノクロモードを使用して撮影します。4倍の倍率の対物レンズを使用してください。セクションごとに複数の画像を撮影します。大きな血管がある場合は、門の近くの領域を避けてください。比較するすべての画像に同じ設定を使用します。
9. 以下に説明するように、Photoshop(代替a)を使用して形態測定定量化を実行します。
   1. コラーゲンに対応する画像の白い領域を定量化します。Photoshop で、「色の範囲を選択」>をクリックし、「ハイライト」を選択し、「ファジーネス」と「範囲」のパラメータを調整して、コラーゲンに対応する白色のピクセルを選択します。次に、[Window > Histogram] > [Expanded View] を選択し、選択したピクセル数を記録します ([ピクセル] パラメーターの横に表示されます)。比較するすべての画像に同じパラメータを使用します。
   2. 画像の総面積を定量化します。Photoshop で、「 すべて選択」>をクリックし、前と同じように合計ピクセル数を記録します。
   3. コラーゲンに対応する画像領域の割合を、白いピクセルの数を合計ピクセルの数で割って計算します。値は通常、面積の割合で表されます。
10. 以下に説明するように、ImageJ(代替b)を使用して形態測定定量化を実行します。
    1. 画像内でコラーゲンに対応する白い領域を選択します。[ 画像] > [しきい値の調整 ] をクリックして (または Shift + T キーを押して) [しきい値] ツールを開きます (または> キーを押します)。コラーゲン染色領域(白い領域)のみが赤で強調表示されるようにしきい値範囲を設定し(例:最小しきい値64、最大しきい値:255)、[ 適用]をクリックします。これにより、画像が二値化され、コラーゲン領域が黒に、背景が白に変換されます。
    2. [ 解析] > [測定値の設定] をクリックして、画像の合計領域を測定します。 [エリア ] と [表示ラベル] をオンにします。 [OK] をクリックします。「 Analyze > Measure 」をクリックします (またはキーボードの M キーを押します)。[結果] ウィンドウに、画像領域の合計が表示されます。
    3. コラーゲンの面積と割合を測定するには、まず、「 分析」>「測定値の設定」をクリックして、「しきい値に制限」を有効にします。 「面積」、「面積の割合 」(ImageJはコラーゲン%を自動的に計算します)、「 Limit to Threshold」、 および「Display Label」をオンにします。 [OK] をクリックします。次に、「 Analyze > Measure 」をクリックします (または M キーを押します)。結果ウィンドウには、コラーゲン領域(絶対ピクセル数)と領域分率(画像全体のコラーゲン%)が表示されます。
    4. 「 名前を付けて保存 」を選択して結果を保存するか、クリップボードにコピーしてスプレッドシートに貼り付けます。

3. 肝臓のヒドロキシプロリン定量

注意: 強塩基と酸の使用が必要な手順は、適切な個人用保護具を使用して実行する必要があります。

1. ステップ1.8.7で調製した肝臓サンプルを計量し、重量を記録します。均質化に適したチューブに組織アリコートを入れます。脱イオン水は、組織100 mgあたり900 μLの水と組織比を使用して添加します。
2. 目視観察で評価したように、組織が完全に均質化されるまで、製造元の指示に従ってビーズ叩くまたはその他の方法によって均質化します。この時点でプロトコールを一時停止し、ホモジネートを-20°Cで保存することができます。
3. 以下に説明するようにタンパク質沈殿を行います。次の手順は、異なる温度が指定されている場合を除き、室温で実行されます。
   1. 約500 μLから1000 μLのホモジネートを1.5 mLの遠心分離チューブに移します。すべてのサンプルに同じボリュームを移します。
   2. トリクロロ酢酸を最終濃度12%に添加する(例えば、120μLのトリクロロ酢酸を880μLのホモジネートに加える)²⁸。渦を少し混ぜます。
   3. サンプルを氷/水浴で30分間インキュベートします。6,000 x g 、4°Cで10分間遠心分離します。タンパク質を含む沈殿物が形成されます。吸引により上清を除去します。チューブを氷の上に置いてください。
   4. 氷冷エタノール1mL(100%)を加えてペレットを洗浄します。超音波処理(または他の方法)によってペレットを再懸濁し、材料が再懸濁されていることを視覚的に確認します。6,000 x g 、4°Cで10分間遠心分離し、上清を吸引して除去します。機器の指示に従って超音波処理設定を使用します(たとえば、直径150 mmのマイクロチップを備えたBranson SFX 3.2ソニファイアを使用すると、ほとんどのサンプルで10秒間の70%の振幅が効果的です)。洗濯を2回繰り返します。
   5. ペレットを10分間、または必要に応じてそれ以上風乾させます。
4. 以下に説明するようにタンパク質の加水分解を行います。
   1. タンパク質沈殿物を含むチューブに800μLの6N塩酸を加えます。ステップ3.3.4と同じ設定を使用して、超音波処理(または他の方法)によってペレットを再懸濁します。
   2. タンパク質懸濁液をスクリューキャップ付きのガラス管またはバイアルに移します。しっかりと閉じます。チューブを110°Cのオーブンで22時間²⁹±インキュベートします。
   3. チューブを16,000 x g で10分間遠心分離します。微粒子はペレットを形成します。これには通常、遠心分離の前にガラスバイアルから遠心分離管に加水分解物を移す必要があります。
   4. ヒドロキシプロリンを含む上清を1.5mLチューブに移します。.この時点でプロトコルを一時停止できます。加水分解物は4°Cで保存できます。
5. ヒドロキシプロリン濃度の標準曲線を調製します。線維化ステージ1〜3の肝臓サンプルの場合、このプロトコルに示されている量の組織を使用して、最大125μg/ mLの標準濃度が適切です(例:125、62.5、31.3、15.6、7.81、3.91、1.95、および0μg / mLの段階希釈)。ヒドロキシプロリンを6 N塩酸で希釈して標準試料を調製します。
6. 各サンプルと標準液40 μLを1.5 mL標識遠心チューブに移します。それぞれに10 μLの10 N水酸化ナトリウムを加え、短時間ボルテックスして混合します。
7. 以下に説明するようにヒドロキシプロリンの酸化を行います。
   1. 脱イオン水中に酢酸1.2%v/v、クエン酸46 g/L、酢酸ナトリウム三水和物120 g/L、水酸化ナトリウム34 g/Lを含む酢酸-クエン酸緩衝液を調製し、緩衝液のpHを6.5に調整します。
   2. 12.7 g/L のクロラミン T を水:n-プロパノール:酢酸-クエン酸緩衝液 (1:1:8 v:v:v) に溶かします。まず、クロラミン T を水に溶かして混合し、次に n-プロパノールを加えて混合し、次に酢酸-クエン酸緩衝液を加えて混合します。
   3. 450 μLのクロラミン溶液をサンプルと標準液の入ったチューブに加えます。ボルテックスで混ぜます。室温で25分³⁰秒インキュベートします。
8. 1 M 4-(ジメチルアミノ)ベンズアルデヒド含有過塩素酸:プロパノール1:2(v / v)でエールリッヒ試薬を調製します。500 μLのエールリッヒ試薬をサンプルとスタンダードに加えます。ボルテックスで混ぜます。
9. 65°Cで20分間、加熱ブロック、ウォーターバス、またはインキュベーターでインキュベートします。インキュベーションが終了したら、サンプルと標準試料を室温まで冷まします。
10. 分光光度計を使用して、550 nmの波長でサンプルと標準の吸光度を測定します。
11. 吸光度と標準量をプロットし、線形回帰を使用して標準曲線を作成します。標準曲線のパラメータを使用して、サンプル中のヒドロキシプロリンの濃度を計算します。
12. 加水分解物の総量に基づいて肝臓サンプル中のヒドロキシプロリンの量を計算し(ステップ3.4)、タンパク質沈殿に使用されたホモジネートの量に対応する組織の質量で正規化します(ステップ3.3.1)。結果を組織のmgあたりのヒドロキシプロリンのngとして表します。あるいは、ホモジネート中のタンパク質の濃度を測定し、その結果をタンパク質の質量あたりのヒドロキシプロリンの質量として表すこともできます。

結果

HFFDを与えられたAyマウスは、LFFDを与えられた野生型マウスよりも体重が増え、肥満を発症します(図1A)。彼らはHFFD摂食の最初の4週間でより急速に体重を増やし、約3〜4 g /週増加します。8週間後、彼らは対照マウスと同様の速度で体重増加します(約0.6g/週)¹⁹。16週間後、HFFDを給餌したAyマウスの体重は約45g〜50g(3つの別々の実験の平均)で、LFFDを給餌した対照野生型マウスよりも約40%〜80%体重が重かった(図1B、C)。

Ay HFFDマウスは、対照群と比較して脂肪パッドが拡大した脂肪組織貯蔵量が多くなっています(図1D、E)。体組成の分析により、体重の増加は、NMR

ディスカッション

このプロトコルは、ヒト^5,6で疾患を再現する肝線維症を伴うMASLDのマウスモデルを記述しています。マウスは、組織学における微小小胞性脂肪症とマクロ小胞性脂肪症の混合および肝臓のトリアシルグリセロール含有量の上昇によって示されるように、肝臓脂肪症を発症します¹⁹。マウスはまた、肥満、高トリグリセリド血症、耐糖能異常を発症し、高血圧症を患っていると報告されており、これは脂肪肝と組み合わせて、ヒトのMASLDの診断基準に対応します^19,32。脂肪症に加えて、マウスはMASH¹⁹の特徴である他の変化を示します:これらのマウスは肝細胞損傷を有し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色された肝臓切片で肝細胞のバルーニングが観察され、血漿トランスアミナーゼのレ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
4-(ジメチルアミノ)ベンザルデヒド	シグマ・オルドリッチ	D2004
酢酸	様々な	NA
調整カロリー 食事 西洋食	イノティフ	TD.88137	脂肪(42%kcal)とショ糖(34%w/w)を含んだ食事。他の供給者は同じ成分のダイエットを提供しています
B6。CG-AY/J	ジャクソン研究所	000021	ストレインはアグーティ致死性の黄色変異を持ち、背景はC57BL6/Jです。現在、ジャクソン研究所はこの株を保存しています。
C57BL/6J	ジャクソン研究所	000664
遠心分離機	様々な	NA	ローターは1.5 mL管用で冷蔵されており、16,000xgに達することができます。
遠心分離機	様々な	NA
クロラミン-Tハイドレート	シグマ・オルドリッチ	857319
クエン酸	様々な	NA
ダイレクトレッド80	シグマ	365548-5G
エタノール	デコン・ラボラトリーズ	2701
ホルマリン溶液、中性緩衝	シグマ	HT501128
果糖	シグマ・オルドリッチ	F0127
グルコース	シグマ・オルドリッチ	G8270
組織学処理装置	NA	NA	埋め込みや切片は、研究者の研究室または外部施設で行うことができます
均質化装置	様々な	NA	ビードビーターは複数のサンプルを効率的に処理できます。他の均質化方法も利用できます
塩酸	様々な	NA
ヒドロキシプロリン	シグマ	H5534
低脂肪コントロールダイエット	イノティフ	TD.08485	コントロールダイエットで、低脂肪(13%kcal)とスクロース(12%w/w)を含みます。
偏光顕微鏡用に装備された顕微鏡	様々な	NA
N-プロパノール	様々な	NA
過塩素酸	様々な	NA
パーマウントマウント用メディウム	フィッシャー・サイエンティフィック	SP15-100
ピクリン酸、飽和水溶液、スペクトル	フィッシャー	18612375
酢酸ナトリウム三水和物	様々な	NA
水酸化ナトリウム	様々な	NA
ソニケーター	様々な	NA	ソニケーターはステップ2.5でペレットを再懸垂させるのに役立ちますが、絶対に必要というわけではありません
トリクロロ酢酸	様々な	NA
VWRマイクロカバーメガネ、長方形	VWR	48393-081
VWR プレミアムスーパーフロストプラス顕微鏡スライド |VWR	VWR	48311-703
水、脱イオン化	様々な	NA	水浄化システムから脱イオン水、または供給業者から購入した水。
キシレン	フィッシャー・サイエンティフィック	X3F	シトリソルブ清算代理店など;(フィッシャー 22-143-975)は環境に優しい代替案として販売されています