糸状菌による高分子加水分解細胞外酵素生産のための固体発酵系の設計

Summary

このプロトコルは、回転式固体発酵システムで小麦ふすまを利用して、酵素生産を強化します。基質にはキチンなどの誘導剤が添加されており、制御された条件下で真菌の増殖をサポートします。結果は、水中発酵と比較して酵素収量が4〜6倍高いことを示しており、多様なバイオテクノロジーアプリケーションに対するこの方法の適応性と有効性を示しています。

Abstract

固体発酵(SSF)は、水性媒体に溶解しない固体基質を利用する生体変換プロセスです。微生物は基質の表面で増殖し、その固体マトリックスに浸透して、その発生に必要な栄養素を抽出します。SSFは、自由水が最小限に抑えられ、基質の水分含有量が70%以上に維持されていることを特徴とし、気体、液体、固体の3つの相互接続された相を含みます。このプロトコルは、回転システムでの酵素生産のための基本基質として、農工業副産物である小麦ふすまの使用を説明しています。基質には、キチン、キトサン、デンプン、セルロースなどの誘導剤が添加され、加水分解タンパク質の合成が促進されます。このシステムは適応性が高く、菌糸体、胞子、ペレットなど、さまざまな真菌形態を使用することができます。記載されている方法では、インデューサーと基質を1:100(w/w)の比率で混合し、オートクレーブ滅菌 により 滅菌し、滅菌水で所望の水分レベルに調整します。次に、真菌接種物を添加し、回転システムを10rpmで作動させて、適切な混合と酸素化を確保します。このシステムは、中温性または好熱性/耐熱性真菌の最適な増殖条件下で6〜8日間インキュベートされ、その汎用性が向上します。インキュベーション後、酵素の種類に応じて、適切な低温緩衝液(酢酸、クエン酸塩、リン酸など)を使用して酵素を容易に抽出できます。抽出物は、遠心分離とろ過によって清澄化され、無細胞上清が得られます。その後、酵素は必要に応じてさらに濃縮または精製することができます。その結果、サブマージ発酵(SmF)と比較して酵素活性が4〜6倍増加したことが示され、システムの有効性が強調されました。さまざまな基質、誘導物質、および真菌種への適応性により、さまざまなバイオテクノロジーアプリケーションにとって貴重なツールになります。

Introduction

固体発酵(SSF)は、高価値酵素、生理活性化合物、および二次代謝産物を生産するための有望で持続可能なバイオコンバージョン技術として浮上しています。この手法では、最小限の自由水で固体基質上で微生物を増殖させ、微生物の自然環境をシミュレートし、効率的な代謝活動を可能にします¹。このプロトコルの主な目標は、基質の利用率、酸素拡散、およびプロセスのスケーラビリティを向上させる回転式SSFシステムを通じて酵素産生を最適化することです。農産業副産物として豊富に存在する小麦ふすまをベース基質とすることで、農業残渣の価値化に貢献し、循環型バイオエコノミーの実践を促進します²。

SSFは、エネルギーと水の消費量が少ない、製品濃度が高い、小麦ふすま、籾殻、サトウキビバガス³などの安価な農業残渣との幅広い適合性など、サブマージ発酵(SmF)に比べて大きな利点があります。大量の水と高価な栄養培地を必要とするSmFとは異なり、SSFシステムは、微生物の増殖表面として機能するだけでなく、微生物の活動に不可欠な栄養素を提供する固体マトリックスを活用します。さらに、SSFに含まれる自由水が限られているため、汚染リスクが最小限に抑えられ、工業環境での酵素生産のためのより堅牢なオプションになります⁴。SSFは、その運用上の利点に加えて、サブマージ発酵(SmF)と比較して、環境的および経済的に大きなメリットをもたらします。研究によると、SSFは水の消費量を50%〜70%削減し、絶え間ない攪拌と曝気を必要とする大量の水がないため、エネルギーコストを30%以上削減することが報告されています。さらに、農工業残渣を基質として使用することで、原材料コストを最小限に抑え、農業副産物を再利用することで循環型経済の実践を促進します^2,4。

SSFは、その効率性とスケーラビリティについて広く検証されています。例えば、SSFを使用した酵素活性はSmFと比較して4〜6倍に増加したと研究で報告されており、この手法の経済的および環境的利点が強調されています^2,5。さらに、酵素抽出は通常、必要な水と精製ステップが少なくて済むため、下流のプロセスが簡素化されます。そのため、SSFは、運用コストと環境への影響の低減を目指す業界にとって特に魅力的です⁶。

このプロトコルで説明されているロータリーSSFシステムは、従来の静的SSF方法に比べていくつかの改善点を提供します。静的システムは、不均一な基質のコロニー形成や酸素制限などの課題に直面することがよくありますが、回転構成により、完全な混合と曝気が保証され、均一な微生物増殖が促進されます^7,8,9。例えば、このシステムは、アスペルギルス属やトリコデルマ²形などの真菌種を用いて、キチナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼなどの加水分解酵素を作製するために成功裏に採用されています。

このSSFシステムの大きな特徴は、その適応性です。小麦ふすまをベース基質として使用することは、費用対効果の高いバイオコンバージョンのための農工業残渣の可能性を示しています³。さらに、キチン、キトサン、デンプンなどの誘導物質を基質に補給すると、特定の代謝経路を刺激することにより、酵素合成がさらに促進されます^2,10。また、このシステムは、胞子、菌糸体、ペレットなど、さまざまな真菌形態にも対応しているため、ユーザーは特定の要件に合わせてプロセスを調整できます²。

SSFは、食品バイオテクノロジー、バイオ燃料生産、環境修復などのさまざまな分野での応用に幅広い可能性を秘めています¹¹。コスト効率の高い基質、優れた酵素収率、および高いプロセスの柔軟性の統合により、SSFは工業規模のバイオテクノロジーイノベーションに不可欠なアプローチとしての地位を確立しています。

Protocol

この研究で使用した試薬と機器は、 材料表に記載されています。

1. 基板調製

注:基質特性の大幅な変動を最小限に抑えるために、市販の小麦ふすまを使用してください。小麦ふすまの各バッチは複数の要因によって異なるため、標準化が困難な不均一な材料であり、その構成含有量の変動につながります。標準化された材料が必要な場合は、代替マトリックスを選択するか、小麦ふすまの各バッチの近接化学分析を実行して、必要に応じて調整します。

1. 小麦ふすまを滅菌蒸留水で3回洗って、有機物の残留物、破片、ほこりを取り除きます。これにより、発酵を妨げる可能性のある単糖も除去されます。
2. 洗ったふすまをアルミ製のトレーに広げ、60°Cのオーブンで24時間乾燥させます。
3. 乾燥したら、小麦ふすまを滅菌済みの50mLコニカルチューブに入れます。

2.接種材料の調製

注:このプロトコルでは、接種液の3つの方法、すなわち胞子懸濁液、菌糸体円板の直接接種、および細胞懸濁液について説明しています。初期接種濃度を確立し、タンパク質レベルを定量化して、正確な収量計算を行います。

1. 胞子懸濁液の調製
   1. 菌糸体で飽和させた直径5mmの寒天ディスクを新鮮なジャガイモデキストロース寒天プレートに移します。プレートを28°Cで5〜7日間、または菌糸体が培地に飽和するまでインキュベートします。一部の菌類は、より長いインキュベーション時間を必要とする場合があります。
   2. 5 mLの滅菌蒸留水をプレートに加え、滅菌ループを使用して胞子を機械的に剥離します。
   3. 胞子懸濁液を1:100に希釈して調製します。ノイバウアーチャンバーの中央に10 μLを置き、顕微鏡で胞子をカウントします。チャンバーの係数と希釈に基づいて胞子濃度(胞子/ mL)を計算します。
2. 液体培地での菌糸体の培養
   1. 菌糸体で飽和させた5 mmの寒天ディスクを新鮮なジャガイモ-デキストロース-寒天プレートに移し、飽和するまで28°Cでインキュベートします。
   2. 25 mLのジャガイモ-デキストロースブロスを滅菌125 mLフラスコとオートクレーブで調製します。.
   3. 飽和プレートから5mmの菌糸体ディスクを滅菌ブロスに移します。
   4. フラスコをシェーカーで125rpmで24〜48時間インキュベートします(真菌株にもよりますが)。成長の遅い菌類のインキュベーション時間を延長します。
   5. 接種用に2 mL、乾燥重量測定用に2 mLを収集します。
3. 菌糸体円板の直接接種
   1. 菌糸体で飽和させた5 mmの寒天ディスクを新鮮なジャガイモ-デキストロース-寒天プレートに置きます。飽和するまで28°Cでインキュベートします。
   2. 1つの菌糸体ディスクを接種材料として使用し、もう1つの真菌ディスクを使用して乾燥重量を決定します。

3. SSFシステムの準備

注:インデューサーは、天然のものでも商業的なものでもかまいません。精製された市販の誘導剤は、発酵効率を変化させる可能性のある不純物を最小限に抑えるために好まれます。相対湿度を少なくとも90%に維持するように、水の追加を調整します。

1. 滅菌済みの50mLコニカルチューブに次のコンポーネントを組み合わせます:乾燥小麦ふすま5g;0.2gのインデューサー(例えば、市販のキチン);5.5 mLの水(インデューサーの吸水能力に基づいて調整します)。16 g/L 一塩基性リン酸カリウム、4 g/L 硫酸ナトリウム、2 g/L 塩化カリウム、1 g/L 塩化カルシウム、400 mg/L 塩化亜鉛、60 mg/L ホウ酸、40 mg/L モリブデン酸ナトリウム、150 mg/L 塩化マグネシウム、100 mg/L 塩化第二鉄、400 mg/L 硫酸銅を含む 5 mL の滅菌塩溶液。
2. 電極ベースの湿度計を使用して相対湿度を測定し、最低90%の湿度を確保します。電極プローブをさまざまな深さで反応器に直接挿入して、水分分布の代表的な測定値を取得します。
   1. 手順に従って、湿度が90%未満の場合は湿度を調整します。
      1. 滅菌蒸留水を基質10gあたり1mL刻みで徐々に加えます。添加するたびに、水分が均一に分布するように十分に混合します。
      2. 基板を10〜15分間平衡化させます。湿度レベルを再測定します。
      3. 目標湿度の90%に達するまで、上記の手順を繰り返します。プロセス全体で基材を過度に濡らさないようにしてください。
   2. 湿度が90%を超える場合は、手順に従って湿度を調整します。
      1. 無菌環境で基質を薄く広げます。(1)基板を層流にさらすか、(2)30°Cの乾燥チャンバーに10〜15分間置くことにより、余分な水分を取り除きます。
      2. あるいは、基材を穏やかに混合して、水分の再分布を均一に促進します。処理後、湿度レベルを再評価します。
      3. 湿度が90%に達するまで、必要に応じて乾燥または混合ステップを繰り返します。目標湿度に達した場合にのみ発酵を進めてください。
3. チューブを15psiで15分間オートクレーブします。
4. 冷却後、1 mLの胞子懸濁液(1 x 10^6-1 x 10⁷ 胞子/ mL)、2 mLの細胞懸濁液、または1つの5 mm菌糸体円盤のいずれかを基質に接種します。

4. 固相発酵(SSF)の手順

注:異なる時間での動力学研究またはパラメータ評価の場合は、代表性を確保するために、各時点に別々のチューブを準備してください。

1. 1分サイクルで5分間チューブを最高速度でボルテックスすることにより、基板の凝集を回避します。
2. チューブを水平軸のロータリーミキサーに入れます。基板がチューブ内を自由に動くことを確認します。ミキサーを10rpmで動作するように設定します。
3. ミキサーをインキュベーター内で、微生物の最適な増殖温度でインキュベートします。熱感受性インデューサーを使用する際には、最適な酵素活性を得るために報告された温度を維持してください。

5. 酵素の抽出

注:抽出の基本は、細胞外酵素の溶解度とpH-最大活性に基づいています。SSFは水媒体を避けるため、細胞外酵素は固体マトリックスの周囲の水に関与しており、これは濃度がSmFよりも高いことを意味します。この文脈では、最適な抽出バッファーの選択は、目的のアクティビティの知識に依存します。抽出の最適化は、最終的な酵素濃度と使用する抽出バッファーの種類によって異なります。

1. 所望の発酵期間の後、基質を20mLの予冷緩衝液に再懸濁します。例えば、0.1 Mアセテート緩衝液、pH 5.6、キチナーゼ抽出用。0.02 M リン酸緩衝液、pH 6.9、アミラーゼ抽出用。
2. チューブをサイクルでボルテックスします:最高速度で1分、続いて氷上で1分。10回繰り返します。
3. ペーパーフィルターを使用して懸濁液をろ過し、プレスして上澄みを機械的に抽出します。
4. 上清を3000 x g で4°Cで15分間遠心分離して清澄化します。
5. 粗抽出物を直接使用するか、カラムクロマトグラフィーまたは遠心フィルター を介して 酵素をさらに精製します。ミカエリス定数(Km)および酵素形質転換の最大速度(Vmax)を決定するために、速度論的研究も推奨される¹²。

6. 最適化プロセス

注:インデューサーの品質と濃度、および接種物の種類と濃度を評価および調整することにより、このプロトコルを最適化します。

1. 理想的な発酵時間を決定し、抽出ステップを改良して効率を向上させます。
2. 温度、pH、曝気などの環境条件を制御し、微調整します。
3. さまざまなバッファーと抽出条件をテストして、酵素の収量と安定性を向上させます。
4. 応答曲面法などの統計解析を実行して、最も影響力のある変数を特定し、最適な酵素産生を実現します。

Results

図1A は、このシステムで使用されるロータリーミキサーの概略図を示しており、50mLの円錐形チューブ6本の容量があります。 図2B は、固体発酵プロセスに入る前のコンディショニング中に小麦ふすまに発生する変化を示しています。見ての通り、大きな構造変化は観察されませんでした。

図2は、市販のキチンを誘導剤として使用した このシステムでのTrichoderma harzianaum 菌によるキチナーゼ産生のための6日間の固体発酵後の小麦ふすまの飽和度を示しています。 図2A は、発酵プロセス前の元の材料を示しています。顕微鏡写真は、基質が真菌によって利用されていることを確認し、それはそれが受ける修飾にも反映され、真菌との相互作用によりフラクタル様構造を失います。

Discussion

この研究では、糸状菌専用に設計された固体発酵(SSF)システムによる酵素産生を最適化するための関連プロトコルを概説しています。以下では、方法論の重要な側面について、その重要性、制限、および潜在的なアプリケーションとともに説明します。

プロトコールの成功は、基質や接種の調製などの主要なステップに大きく依存します。小麦ふすまの適切な洗浄と乾燥は、真菌の増殖や酵素産生を妨げる可能性のある不純物を排除するために不可欠です。さらに、相対湿度を90%以上に維持するために基質の水分を慎重に調整することで、最適な真菌のコロニー形成と活性が保証されます¹³。10rpmでのロータリーシステムの動作は、均一な混合と酸素化を促進し、基質の凝集を防ぎ、均一な真菌の成長を確保するため、別の重要なパラメータです¹⁴。

このプロトコルの適応性は、多様な真菌種および誘導物質との適合性にあります。例え...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
125 mL三角フラスコ	シグマ・アルドリッチ	CLS431684	液体培地で菌糸体を培養するため。
50 mLコニカルチューブ	シグマ・アルドリッチ	CLS430921	基質や接種物の保管・調製に。
酢酸緩衝液、pH 5.6	シグマ・アルドリッチ	320866	キチナーゼ抽出用。
Centriconフィルター	ミリポール	UFC905024	酵素のさらなる精製のために。
計数細胞チャンバー	シグマ・アルドリッチ	Z359629	顕微鏡で胞子を数えるために使用されます。
濾紙	ワットマン	1001-110	酵素抽出物をろ過するため。
湿度計	トドマイクロ	-	基板の相対湿度を測定します。
誘導剤(市販のキチンなど)	シグマ・アルドリッチ	C9752	発酵中の酵素生成を促進するために使用されます。
リン酸緩衝液、pH 6.9	シグマ・アルドリッチ	P5379	アミラーゼ抽出用。
ジャガイモデキストロース寒天培地	シグマ・アルドリッチ	P2182	真菌菌糸体を増殖させるための培地。
ジャガイモとデキストロースブロス	シグマ・アルドリッチ	P6685	真菌菌糸体を増殖させるための液体培地。
ロータリーミキサー	サーモフィッシャーサイエンティフィック	88-861-051	発酵中に基質を動かし続けるため。
塩溶液成分(例:KH2PO4、Na2SO4、KClなど)	シグマ・アルドリッチ	倍数	滅菌塩溶液の調製については、プロトコルの詳細なレシピを参照してください。
麩	商業市場	-	固体発酵用基質。