糸状菌による高分子加水分解細胞外酵素生産のための固体発酵系の設計

Summary

このプロトコルは、回転式固体発酵システムで小麦ふすまを利用して、酵素生産を強化します。基質にはキチンなどの誘導剤が添加されており、制御された条件下で真菌の増殖をサポートします。結果は、水中発酵と比較して酵素収量が4〜6倍高いことを示しており、多様なバイオテクノロジーアプリケーションに対するこの方法の適応性と有効性を示しています。

Abstract

固体発酵(SSF)は、水性媒体に溶解しない固体基質を利用する生体変換プロセスです。微生物は基質の表面で増殖し、その固体マトリックスに浸透して、その発生に必要な栄養素を抽出します。SSFは、自由水が最小限に抑えられ、基質の水分含有量が70%以上に維持されていることを特徴とし、気体、液体、固体の3つの相互接続された相を含みます。このプロトコルは、回転システムでの酵素生産のための基本基質として、農工業副産物である小麦ふすまの使用を説明しています。基質には、キチン、キトサン、デンプン、セルロースなどの誘導剤が添加され、加水分解タンパク質の合成が促進されます。このシステムは適応性が高く、菌糸体、胞子、ペレットなど、さまざまな真菌形態を使用することができます。記載されている方法では、インデューサーと基質を1:100(w/w)の比率で混合し、オートクレーブ滅菌 により 滅菌し、滅菌水で所望の水分レベルに調整します。次に、真菌接種物を添加し、回転システムを10rpmで作動させて、適切な混合と酸素化を確保します。このシステムは、中温性または好熱性/耐熱性真菌の最適な増殖条件下で6〜8日間インキュベートされ、その汎用性が向上します。インキュベーション後、酵素の種類に応じて、適切な低温緩衝液(酢酸、クエン酸塩、リン酸など)を使用して酵素を容易に抽出できます。抽出物は、遠心分離とろ過によって清澄化され、無細胞上清が得られます。その後、酵素は必要に応じてさらに濃縮または精製することができます。その結果、サブマージ発酵(SmF)と比較して酵素活性が4〜6倍増加したことが示され、システムの有効性が強調されました。さまざまな基質、誘導物質、および真菌種への適応性により、さまざまなバイオテクノロジーアプリケーションにとって貴重なツールになります。

Introduction

固体発酵(SSF)は、高価値酵素、生理活性化合物、および二次代謝産物を生産するための有望で持続可能なバイオコンバージョン技術として浮上しています。この手法では、最小限の自由水で固体基質上で微生物を増殖させ、微生物の自然環境をシミュレートし、効率的な代謝活動を可能にします¹。このプロトコルの主な目標は、基質の利用率、酸素拡散、およびプロセスのスケーラビリティを向上させる回転式SSFシステムを通じて酵素産生を最適化することです。農産業副産物として豊富に存在する小麦ふすまをベース基質とすることで、農業残渣の価値化に貢献し、循環型バイオエコノミーの実践を促進します²。

SSFは、エネルギーと水の消費量が少ない、製品濃度が高い、小麦ふすま、籾殻、サトウキビバガス³などの安価な農業残渣との幅広い適合性など、サブマージ発酵(SmF)に比べて大きな利点があります。大量の水と高価な栄養培地を必要とするSmFとは異なり、SSFシステムは、微生物の増殖表面として機能するだけでなく、微生物の活動に不可欠な栄養素を提供する固体マトリックスを活用します。さらに、SSFに含まれる自由水が限られているため、汚染リスクが最小限に抑えられ、工業環境での酵素生産のためのより堅牢なオプションになります

Protocol

この研究で使用した試薬と機器は、 材料表に記載されています。

1. 基板調製

注:基質特性の大幅な変動を最小限に抑えるために、市販の小麦ふすまを使用してください。小麦ふすまの各バッチは複数の要因によって異なるため、標準化が困難な不均一な材料であり、その構成含有量の変動につながります。標準化された材料が必要な場合は、代替マトリックスを選択するか、小麦ふすまの各バッチの近接化学分析を実行して、必要に応じて調整します。

1. 小麦ふすまを滅菌蒸留水で3回洗って、有機物の残留物、破片、ほこりを取り除きます。これにより、発酵を妨げる可能性のある単糖も除去されます。
2. 洗ったふすまをアルミ製のトレーに広げ、60°Cのオーブンで24時間乾燥させます。
3. 乾燥したら、小麦ふすまを滅菌済みの50mLコニカルチューブに入れます。

2.接種材料の調製

注:このプロトコルでは、接種液の3つの方法、すなわち胞子懸濁液、菌糸体円板の直接接種、および細胞懸濁液について説明しています。初期接種濃度....

Results

図1A は、このシステムで使用されるロータリーミキサーの概略図を示しており、50mLの円錐形チューブ6本の容量があります。 図2B は、固体発酵プロセスに入る前のコンディショニング中に小麦ふすまに発生する変化を示しています。見ての通り、大きな構造変化は観察されませんでした。

図2は、市販のキチンを誘導剤として使用した このシステムでのTrichoderma harzianaum 菌によるキチナーゼ産生のための6日間の固体発酵後の小麦ふすまの飽和度を示しています。 図2A は、発酵プロセス前の元の材料を示しています。顕微鏡写真は、基質が真菌によって利用されていることを確認し、それはそれが受ける修飾にも反映され、真菌との相互作用によりフラクタル様構造を失います。

Discussion

この研究では、糸状菌専用に設計された固体発酵(SSF)システムによる酵素産生を最適化するための関連プロトコルを概説しています。以下では、方法論の重要な側面について、その重要性、制限、および潜在的なアプリケーションとともに説明します。

プロトコールの成功は、基質や接種の調製などの主要なステップに大きく依存します。小麦ふすまの適切な洗浄と乾燥は、真菌の増殖や酵素産生を妨げる可能性のある不純物を排除するために不可欠です。さらに、相対湿度を90%以上に維持するために基質の水分を慎重に調整することで、最適な真菌のコロニー形成と活性が保証されます¹³。10rpmでのロータリーシステムの動作は、均一な混合と酸素化を促進し、基質の凝集を防ぎ、均一な真菌の成長を確保するため、別の重要なパラメータです¹⁴。

このプロトコルの適応性は、多様な真菌種および誘導物質との適合性にあります。例え.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
125 mL三角フラスコ	シグマ・アルドリッチ	CLS431684	液体培地で菌糸体を培養するため。
50 mLコニカルチューブ	シグマ・アルドリッチ	CLS430921	基質や接種物の保管・調製に。
酢酸緩衝液、pH 5.6	シグマ・アルドリッチ	320866	キチナーゼ抽出用。
Centriconフィルター	ミリポール	UFC905024	酵素のさらなる精製のために。
計数細胞チャンバー	シグマ・アルドリッチ	Z359629	顕微鏡で胞子を数えるために使用されます。
濾紙	ワットマン	1001-110	酵素抽出物をろ過するため。
湿度計	トドマイクロ	-	基板の相対湿度を測定します。
誘導剤(市販のキチンなど)	シグマ・アルドリッチ	C9752	発酵中の酵素生成を促進するために使用されます。
リン酸緩衝液、pH 6.9	シグマ・アルドリッチ	P5379	アミラーゼ抽出用。
ジャガイモデキストロース寒天培地	シグマ・アルドリッチ	P2182	真菌菌糸体を増殖させるための培地。
ジャガイモとデキストロースブロス	シグマ・アルドリッチ	P6685	真菌菌糸体を増殖させるための液体培地。
ロータリーミキサー	サーモフィッシャーサイエンティフィック	88-861-051	発酵中に基質を動かし続けるため。
塩溶液成分(例:KH2PO4、Na2SO4、KClなど)	シグマ・アルドリッチ	倍数	滅菌塩溶液の調製については、プロトコルの詳細なレシピを参照してください。
麩	商業市場	-	固体発酵用基質。