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方法論記事

ウニParacentrotus lividusの酸化還元状態と代謝プロファイルに対するカドミウムの影響の評価

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DOI:

10.3791/68300

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2025年7月29日

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1Higher Institute of Biotechnology - Sidi Thabet, Laboratory of Biotechnology and Valorization of Bio-Geo-Resources, University Manouba, 2Faculty of Sciences of Tunis, Laboratory of Ecology, Biology and Physiology of Aquatic Organisms LR, University Tunis El Manar, 3Laboratory of Mass Spectrometry, National Institute of Research and Physical-Chemical Analysis (INRAP) Biotechpole Sidi Thabet, 4Department of Chemistry, College of Sciences at Bisha, University of Bisha, 5Department of Applied Medical Sciences, Applied College at Bisha, University of Bisha

この記事について

サマリー

このプロトコルは、ウニ Paracentrotus lividus (棘皮動物)からの生理活性化合物の抽出と特性評価の方法、ならびにカドミウム曝露後の酸化ストレスパラメータの決定に焦点を当てています。

要約

カドミウム (Cd) は、水生生物にとって最も有害な重金属の 1 つであり、海洋生物相に広く存在する汚染物質です。カドミウム (Cd) は、その高いバイオアベイラビリティ、持続性、生物蓄積能力により、鉱山流出、産業排水、農業投入物から排出される有毒な重金属であり、水生生物にとって最も有害な汚染物質の 1 つであり、海洋生物相の一般的な汚染物質です。現在の研究では、96時間にわたってさまざまな濃度(0.0183、0.183、および1.83 mg / L)に曝露された 傍中心性 腺の酸化ストレスバイオマーカーおよび代謝産物プロファイルに対するカドミウムの潜在的な毒性効果を評価しました。その結果、Cdは対照群と比較してマロンジアルデヒド、過酸化水素、脂質ヒドロペルオキシドのレベルを増加させるとともに、抗酸化活性(グルタチオンとカタラーゼの減少)を高めることにより、酸化ストレスを誘発することが示されました。さらに、ガスクロマトグラフィー-質量分析に基づいて、処理されたウニと対照の両方の性腺抽出物に74の代謝産物が同定されました。部分最小二乗判別分析により、明確なクラス分離が明らかになり、VIP スコアを通じて 9 つの関連する代謝物が識別されました。実施されたヒートマップ分析では、ステロールとCholest-5-en-3-ol(3.beta)などの脂肪酸化合物のレベルの乱れが浮き彫りになりました。-、デスモステロール、(23S)-エチルコレスト-5-エン-3.ベータ-オール、エイコサペンタエン酸(EPA)、レチノイン酸などの抗酸化防御、プレグナ-5-エン-20-オン、3-ヒドロキシ-、(3β)などのステロイド調節。全体として、私たちのデータは、比較的低い濃度でも、Cdに対する生殖腺の感度が高いことを明らかにしました。

概要

海洋環境は、重金属などのいくつかの有毒化学物質の重要な吸収源とも考えられます。親油性により、これらの元素は浮遊粒子状物質と結合する傾向があり、海洋堆積物に徐々に蓄積し、移動性と生物学的利用能が低下します。その結果、海洋堆積物は主要な重金属吸収源として機能します1。これらの汚染物質の中で、カドミウム (Cd) は、生態系とそれに関連する生物相を脅かす主要な世界的な水質汚染物質として長い間認識されてきました2。水生生態系に存在するCdの3分の1は、リン酸肥料の製造と使用に由来します2。環境へのカドウム放出の他の発生源には、鉱業部門、電気めっき会社、地殻の自然プロセスなどがあります3。この汚染物質は、水性媒体を介して容易に輸送できる能力と、他の重金属とは対照的に比較的大きな移動性のために非常に広まっています2。文献によると、Cdの濃度は、バルト海4で12〜16 x 10-3 μg/L、ガリシア沿岸(北西イベリア半島)に沿って非常に汚染された場所では13.4 x 10-3〜1.49 μg/Lの間で変化します5。地中海の一部の汚染地域では、シチリア島(イタリア)付近で濃度が80.4 x 10-3 μg/Lに達し、6、ガベス湾(チュニジア)7では48 μg/Lに達する可能性がある。この残留性、生物蓄積性、非必須遷移金属は、人間と水生生物の両方に深刻な健康問題を引き起こす能力が認められています8。Cd は、タンパク質に結合し、酵素活性を阻害し、カルシウム恒常性を妨害することにより、その毒性を直接発揮する可能性があります9。また、活性酸素種 (ROS) の生成を通じて間接的に作用し、脂質、タンパク質、DNA などの生体分子に酸化的損傷を引き起こすこともあります10。いくつかの科学的研究は、Cd汚染が水生生物の構造的および機能的障害を引き起こす可能性があることを報告しています11。

他の海洋底生無脊椎動物と同様に、ウニは特に海洋汚染にさらされています。ウニは高レベルの重金属を蓄積する能力があるにもかかわらず、金属汚染に対処し、汚染された環境に耐えることができます12。したがって、それらは一般的にセンチネル生物として認識されており、生態毒性学および環境研究のモデルとして広く使用されています13。多くの研究が、成体、胚、幼虫など、さまざまなライフステージのウニ種に対するCd曝露の影響を調査してきました13。Cd曝露は、卵子受精率の低下、胚と幼虫の発育の異常、酸化ストレスからアポトーシスとオートファジーに至るまで、さまざまな悪影響を引き起こす可能性があることがわかりました13。入手可能な文献のほとんどは、ウニの胚の発育に対するCdの影響に焦点を当てています13,14;しかし、成体のウニの代謝プロファイルに対するこの金属の影響を理解するために実施された研究はごくわずかであり、脂質代謝に関する情報はありません。

Paracentrotus lividus(Lamarck、1816)胚を亜急性/亜致死カドミウム濃度に連続曝露すると、骨格の伸長とパターン化に欠陥があり、タンパク質合成の一般的な減少、およびメタロチオネイン発現の差が生じます16。

提案された方法は、ガスクロマトグラフィー質量分析(GC-MS)を使用した生化学的アッセイと標的および非標的メタボロミクスプロファイリングを組み合わせることにより、海洋生物におけるカドミウム(Cd)毒性と酸化ストレスの評価を改善します。脂質過酸化や抗酸化酵素活性(SOD、CATなど)などの単一のバイオマーカーのみに依存する従来のアプローチと比較して、GC-MSベースの代謝産物スクリーニングを追加することで、生物の生理学的状態の包括的な生化学的フィンガープリントが得られます17。この統合により、低濃度のCdでも亜致死効果をより高感度かつ体系的に検出できるようになり、観察可能な毒物学的損傷の前に発生するエネルギー代謝、アミノ酸代謝回転、酸化経路の早期摂動を検出できます。重要なことに、この方法は、より高い解像度のデータを提供し、従来のアッセイでは見逃される可能性のある新しいバイオマーカーの同定を可能にすることで、既存の毒物学的評価を補完します18。また、経路レベルの分析を通じてメカニズムの理解を促進し、予測生態毒性学モデルを強化します19。この方法は、汚染された沿岸および河口システムに関連する1〜100μg / Lの範囲のカドミウム曝露を検出します20。このアプローチは、制御された実験室での曝露や中程度に複雑なフィールド研究に最適です。ただし、複数のストレッサー(重金属、PAH、新興汚染物質など)が相互作用し、バイオマーカーの特異性を混乱させる可能性がある高度に汚染されたマトリックスでは、解釈が困難になる可能性があります。それにもかかわらず、適切に設計されれば、GC-MSの堅牢性と特異性は、多変量データ分析(PCA、PLS-DAなど)と組み合わされて、重複する効果を解決するための強力な識別力を提供します。

この統合された生化学メタボロミクスプラットフォームは、海洋戦略フレームワーク指令(MSFD)などの枠組みの下でのセンチネル種のモニタリングと生態学的リスク評価に特に有用であり、オミクスベースの環境モニタリングを推進するための現在の取り組みと一致しています21。

現在の研究では、大西洋と地中海沿岸全体で最も利用され、経済的に重要な種の1つである紫色のウニP.lividusを使用して、生殖腺の酸化還元状態とメタボロミクスプロファイルに対するCd汚染の影響を評価しました。

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プロトコル

1. サンプルと実験計画

  1. 2023年5月にビゼルト沿岸(チュニジア、地中海)から水深5〜7mの範囲でダイバーがウニの成体 標本( オス20匹、メス20匹、平均体長:45±4mm、平均年齢:2.0±0.5歳、平均体重:22.54±2.50g)を合計40匹採取します。
  2. 収集したウニ P. lividus サイズに基づいて推定年齢約12〜18か月の混合性別のウニをラボに移し、~38 PSU、pH7.8〜8.0、光周期12:12の天然塩分濃度で16±1°Cの通気された天然海水に保管します。環境の安定性を確保し、外部の変動を最小限に抑えるために、暴露期間を通じてパラメータを毎日監視します。
  3. 1 mLのKCl 0.5 Mをストーマ周囲領域に注入して、産卵を誘導し、配偶子を視覚的に識別します。ろ過した海水で個人をすすぎ、餌の提供のない管理された状態で3日間順応させます。
  4. ウニをランダムに9個体ずつの4つのグループ(3回の水槽ごとに3個体)に分け、50Lのガラス水槽に割り当てます。海洋無脊椎動物における酸化ストレスバイオマーカーとメタボロミクス応答を評価し、同等またはそれ以下の生物学的複製を使用する以前に発表された研究23,24に基づいてサンプルサイズを決定します。
    注:このレベルの複製により、強力な生物学的表現と統計的に有意な結果が保証されます。
  5. 順応後、動物を次のように塩化カドミウム(CdCl2)濃度の範囲に96時間さらします。グループI(Ctrl):非CdCl2水中に飼育されたウニ。グループII(Tr1):0.0183 mg / LのCdCl2濃度に曝露されたウニ。グループIII(Tr2):0.183 mg / LのCdCl2濃度に曝露されたウニ。グループIV(Tr3):CdCl2濃度1.83 mg / Lに曝露されたウニ。
  6. 実験中に水の安定性を維持するために、24時間ごとに50%の水を交換し、サイフォンを使用して慎重に水を取り除き、CdCl2の濃度を維持しながら新しく準備した水と交換します。

2.組織の準備

  1. Telahigueら23によって記述されたプロトコルを使用して、ウニ組織ホモジネートの調製を実行する。
  2. 実験の最後に、各グループの氷ウニを解剖します。滅菌ハサミを使用して口の周りに円形の切り込みを入れ、テストを開きます。
  3. へらで5つの生殖腺を慎重に取り除き、さらなる分析のために保管してください。冷たい蒸留水で洗浄し、破片や表面の汚染物質を取り除きます
  4. 振幅40%に設定されたプローブ超音波処理器を使用して、それぞれ10秒の3バーストで、バーストの間に20秒の休憩があり、低温条件下でTris-HClバッファー(20 mM、pH 7.4)で300 mgの生殖腺画分を同質化します。
  5. 各生殖腺サンプルを生化学分析用(新鮮)とメタボロミクス分析用(凍結乾燥)の2つの部分に分けます。
  6. 10,000 x g で 20 分間遠心分離します。生化学的パラメータ分析のために上清を-80°Cで保存します。
  7. GC-MS分析の前に凍結乾燥機を使用して他の生殖腺画分を凍結乾燥します。完全な乾燥が完了するまで、0.1 mbar未満の真空で-50°Cで48時間維持します。
  8. ローリー法を利用して、BSAを標準として使用して、各サンプルの総タンパク質含有量を測定します。560 nmでLOOHレベルを決定し、タンパク質のmmol / mgとして発現します。
    注:この定量化は、バイオマーカーレベルを正常化するために、すべての生化学的アッセイの前に実行されました。

3. 還元グルタチオンアッセイ

  1. グルタチオンのチオール(SH)基による5-50-ジチオ-ビス-2-ニトロ安息香酸(DTNB)の還元から生じる2-ニトロ-5-メルカプチュル酸の吸光度に基づいて、エルマン25の方法に従って還元されたグルタチオン(GSH)含有量を推定します。
  2. リン酸緩衝液中の組織ホモジネートの混合物とスルホサリチル酸(4%)を1600 x g で15分間遠心分離します。
  3. 得られた上清を500 μLの容量を取り、0.025 mLでエルマン試薬(DNTB)に加えます。412 nmで得られた混合物の吸光度を読み取ります。
  4. GSH含有量を組織gあたりmgとして評価します。総GSH含有量を組織のμg/mgで表します。既知の濃度の還元型グルタチオンに基づく標準検量線を使用して、GSHレベルを計算します。
    注:目的は、カドミウム曝露後の酸化ストレスマーカーとして、性腺ホモジネート中の還元グルタチオン(GSH)を定量化することです。

4.カタラーゼ活性

  1. Aebi26の方法に従って反応セットアップを実行します。2.9 mLの100 mMリン酸緩衝液(pH 7.4)と20 μLの性腺組織上清からなる反応培地を調製します。反応媒体を室温に予備平衡化します。
  2. 新たに調製した0.5 M過酸化水素(H2O2)溶液80 μLをキュベットに加えることから反応を開始します。すぐに内容物を完全に混合し、紫外可視分光光度計を使用して、10秒間隔で1マイル、240 nmでの吸光度の低下を記録します。
  3. 240 nmでの吸光度の経時的な減少を監視することによって決定された、H2O2分解速度に基づいてCAT活性を計算します。次の式を使用します: CAT 活動 = (ΔA/分 x V) / (ε x l x C)
    ここで、ΔA/min = 240 nmでの毎分吸光度の変化、V =アッセイの総体積(L)、ε = H2O2(43.6 M-1/cm)のモル吸光係数、l =キュベットの経路長(通常1 cm)、C =タンパク質濃度(mg/mL)。
  4. モル消光係数43.6 M / cmを使用します。CAT活性は、mgタンパク質あたりの毎分分解されるnmol H2O2 (nmol H2O2 / min / mgタンパク質)として表されます。
    注:目的は、カドミウム曝露に対する抗酸化酵素反応の尺度として、 P.lividus の性腺ホモジネートにおけるカタラーゼ活性を定量化することです。

5. 過酸化水素発生量の測定

  1. Ou and Wolff27によって記述された方法に従って、第一鉄酸化-キシレノールオレンジアッセイを使用して、P. lividus生殖腺の過酸化水素(H2O2)レベルを測定します。
  2. 560 nmの分光光度計を使用して、上清中のH2O2の濃度を測定します。結果をタンパク質のnmol / mgで表します。

6. マロンジアルデヒドアッセイ

  1. ドレーパー法とハドリー法28に記載されているようにサンプルを調製します。500 μLの生殖腺ホモジネートと1 mLの10%トリクロロ酢酸(TCA)を混合します。2500 x g で4°Cで10分間遠心分離します。
  2. 得られた上清1 mLを新しいチューブに移し、1 mLの0.67%TBA溶液を加えます。混合物を100°Cのウォーターバスで15分間インキュベートします。
  3. サンプルを室温まで冷却します。分光光度計を使用して532 nmの吸光度を測定します。
  4. 試薬ブランク(組織抽出物なしのTBA + TCA)を使用してバックグラウンド吸光度を差し引きます。1,1,3,3-テトラエトキシプロパン(TEP)を使用して標準曲線を作成し、MDA濃度をnmol / mgタンパク質として表します。

7.脂質ヒドロペルオキシド測定

  1. Jiang et al.29の方法で説明されているように、キシレノールオレンジアッセイにおける第一鉄酸化を使用して、生殖腺組織中の脂質ヒドロペルオキシド(LOOH)を測定します。
    注:目的は、酸化膜損傷の副産物であるマロンジアルデヒド(MDA)を定量化することにより、性腺組織の脂質過酸化レベルを評価することです。

8. 生殖腺からの生理活性化合物の抽出と分析スクリーニング

  1. 各グループの乾燥性腺組織から、材料を分析グレードのメタノール(≥99.8%;1:25 w/v)に浸し、周囲温度で150 rev/minで3回にメタノール抽出します。
  2. 40°Cのウォーターバス温度と100 rpmに設定された回転速度で回転蒸発してMeOH画分を蒸発させた後、すべての抽出物を700 x g、4°Cで15分間遠心分離します。粗抽出物を1 mLのMeOHに再懸濁し、密閉バイアルに入れて4°Cで保存します。

9. 性腺抽出物のガスクロマトグラフィー-質量分析

  1. 保存したメタノール抽出物を使用して、バイアルに500 μLのアリコートを作ります。
  2. ガスクロマトグラフィー質量分析(GC-MS)による分析は、質量分析計と結合したガスクロマトグラフで行います。GCカラムは5%-フェニル-メチルシロキサン:膜厚30 m x 0.25 mm x 0.25 μmでした。
  3. ヘリウムをキャリアガスとして1mL/minの一定流量で使用します。注入量を100:1の比率で分割モードで1 μLに設定します。オーブン温度を4〜280°C、5°C/分でプログラムします。
  4. 電子衝撃(EI)モードで分光計を操作し、イオン化エネルギーは72 eV、イオン源温度は250°C、スキャン時間は1秒、質量範囲は45〜550 amuです。
  5. 化合物の質量スペクトルをNIST98MSライブラリおよびWilly Library275データベースからの質量スペクトルと比較することにより、化合物の同定を実行します。

10. 統計分析

  1. 最初に、Shapiro-Wilk 検定を使用して正規性についてデータセットを評価し、Levene の検定を使用して分散の均一性について評価します。
  2. MetaboAnalyst 6.030で、標準的な正規化手順、対数変換、およびパレートスケーリングを使用してデータを前処理し、正規分布や分散の均一性などのANOVA仮定を満たします。
  3. Metaboanalystを使用して多変量統計分析を実行し、Benjamini-Hochberg偽発見率(FDR)法を使用して複数のテストを修正し、多数の生化学的比較に関連するタイプIエラーを考慮し、統計的堅牢性を保証します。
  4. 一元配置分散分析(ANOVA)を使用して、グループ間の結果を比較します。平均間の差は、p <0.05 のときに有意であると見なされました。
  5. 部分最小二乗判別分析 (PLS-DA) を使用して、比較可能なグループを区別します。すべての化合物の投影(VIP)における変数の重要度を決定します。
  6. 標準化変数の一次元統計分析のために、対応のあるスチューデントのt検定を使用してp値を計算します。

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結果

私たちの方法の妥当性と有効性は、生物学的および技術的複製の使用によって保証され、一貫した信頼性の高い測定が可能になりました。アッセイは低いばらつきを示し、標準偏差は通常 10% 未満であり、高い再現性を示しています。正確な代謝物定量を保証するために、GC-MS 分析には検量線と内部標準が含まれていました。使用されるすべての技術は、原稿に記載されているように、海洋生態毒性学および環境メタボロミクスで以前に検証された、広く受け入れられているプロトコルに基づいています。

バイオマーカー応答
結果は、カドミウムに曝露された P. lividus の生殖腺の GSH レベルが、対照群と比較してすべての処理群 (Tr1、Tr2、および Tr3) で有意に増加した (p < 0.05) ことを示しています (図 1)。

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ディスカッション

この研究は、生化学的バイオマーカーと活性代謝産物を分析することにより、ウニ P. lividus 生殖腺に対する Cd の毒性効果を評価するために計画されました。 P.lividus を異なる濃度のCdにさらすと、酸化ストレス反応が生じました。これらの発見は、ウニの場での抗酸化レベルの増加と汚染物質レベルとの間に密接な相関関係があることを示す以前の報告と類似しています13。

私たちの結果は、異なる濃度のTr1、Tr2、およびTr3への曝露後のGSHレベルの有意な増加を明らかにしました(図1A)。私たちの発見は、ナマコHolothuria forskaliに対する水銀曝露の影響を研究したTelahigueら23の発見と相関しています。主要な非タンパク質チオールであるGS...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

著者らは、ファストトラック研究支援プログラムを通じてこの研究を支援してくれたビシャ大学の大学院研究および科学研究学部長に感謝しています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
凍結乾燥機BiobaseBK-FD12PT 凍結乾燥機乾燥
ガスクロマトグラフAgilent Technologies HP6890 ガスクロマトグラフ火炎イオン化検出器 (FID)
GC カラムAgilent TechnologiesHP-5 (5%-Phenyl)-メチルシロキサンカラム非極性 コラム 幅広いアプリケーションで優れた性能を発揮する質量
分析計Agilent TechnologiesHP 5973質量分析計Quadrupole MS
凍結

参考文献

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