真菌病原体におけるChIP-seqおよびトランスクリプトーム解析を改善するためのツールとしてのピークコールアルゴリズム(WonderPeaksおよびPeakStream)

サマリー

本レポートでは、RNA-seqおよびChIP-seqデータを解析するための新しい計算ツールであるWonderPeaksを紹介します。このツールは、シーケンシングデータのピーク(リードパイル)の同定に成功し、RNA-seqの非翻訳領域境界の特性評価とChIP-seqのクロマチン濃縮の検出を可能にし、真菌病原体の研究に貴重な洞察を提供します。

要約

トランスクリプトミクスと転写調節因子活性を通じて遺伝子発現の変化を特徴付けることは、真菌の病因に関与する多様な応答を理解するための基本的なアプローチとなっています。この論文では、真菌病原体、特にゲノムアノテーションが制限された非モデルにおける転写調節の研究における重要な課題に対処するために設計された2つの計算ツールを紹介します。まず、次世代シーケンシング(NGS)実験からマッピングされたゲノムデータの一次導関数を利用して、クロマチン免疫沈殿とそれに続くシーケンシング(ChIP-seq)で濃縮されたピークを特定する新しいピークコールアルゴリズムである WonderPeaksを紹介します。次に、ポリ(A)プライミングライブラリ調製を使用して生成されたトランスクリプトームデータで3'非翻訳領域(UTR)に注釈を付けるためのWonderPeaksの拡張である PeakStreamを紹介します。これらのツールを組み合わせることで、エンドツーエンドのデータ分析パイプラインが提供され、真菌の転写調節を研究する研究者にユーザーフレンドリーなソリューションを提供します。真菌病原体カン ジダ・アルビカンスのデータでその有効性を実証し、ChIP-seqデータで検証されたピークを同定し、同じ条件下でトータルRNAシーケンシングデータとの比較を通じて検証済みUTRに注釈を付けることに成功しました。また、現在の最先端の手法と比較したChIP-seqデータに対するWonderPeaksの限界についても議論し、今後の改善の方向性を提案します。最終的に、この研究は、病原性真菌とより広範なゲノム研究への潜在的な応用に直接関連し、転写調節を研究するための実践的なガイダンスと強力なリソースを提供します。

概要

真菌病原体は世界的な健康上の懸念事項であり、近年感染が増加しています¹。これらの病原体の多くは高い抗真菌耐性を示し、有意な死亡率と関連しています²。しかし、モデル真菌生物と比較して、多くの病原性真菌は依然として特徴付けが不十分であり、その病原性のメカニズムについてのさらなる研究の必要性が強調されています。クロマチン免疫沈降シーケンシング (ChIP-Seq) や RNA シーケンシング (RNA-Seq) などの次世代シーケンシング (NGS) 技術は、真菌の病原性の根底にある遺伝子発現の分子メカニズムを明らかにする上で重要な役割を果たします。

NGSデータから得られる洞察の質は、生データ分析に使用されるソフトウェアの精度に大きく依存します。NGSデータ解析の主な課題の中には、濃縮されたNGSリードの領域を正確に同定するピークコールがあり、これは多種多様なライブラリ調製およびシーケンシング技術により特に複雑であり、普遍的なソリューションは実用的ではありません。MACSアルゴリズム³は、その最新バージョンであるMACS3を含む、ChIP-seqデータセットを分析するためのゴールドスタンダードとして広く認められています。ただし、MACS は、最小ピーク長や最大ギャップなどのユーザー定義のパラメーターに依存しており、これらは普遍的に適用できるとは限らず、分析前に決定するのが難しいことがよくあります。特に、最新の MACS3 リリースには、ユーザーがピーク通話前にパラメータを推定できるカットオフ分析機能が含まれています。パフォーマンスを向上させるために、ユーザーは、クロマチン構造またはコピー数の変動によってバイアスを引き起こすことが知られている「ブラックリストに登録された」ゲノム領域のリストを提供することもできます。MACSは、ChIP-seqデータに対して最も一般的に使用され、信頼できるピークコールツールであり続けていますが、特に高度に調整されたパラメータ設定が必要な場合、利用可能な代替アルゴリズムはほとんどありません。

RNA-Seqは、組織培養やマウス感染モデル4,5,6,7など、in vivo増殖中の病原性真菌の遺伝子発現応答を研究するための非常に貴重な技術です。これらの条件下で正確な差次発現分析を行うには、高いシーケンシング深度が必要であり、コストとリソースが法外なものになる可能性があります^8,9。cDNA生成のためにmRNAのポリ(A)テールにアニーリングするように設計されたプライマーを使用するポリアデニル化(ポリ(A))プライミングシーケンシング(3'RNA-Seq)などのライブラリー調製方法は、遺伝子発現解析に必要なシーケンシングの深さを減らすのに役立ちます¹⁰。ただし、このアプローチは、高品質のゲノムアノテーション、特にポリ(A)プライミングイベントからのピークが通常¹¹に位置する3'非翻訳領域(UTR)に依存しています。十分に研究されていない多くの真菌病原体のゲノムアノテーションにはUTRアノテーションがないため、これらの生物での3'RNA-Seqの使用は困難です。さらに、単一遺伝子のUTR長は、異なる増殖条件および細胞型にわたって動的であり得る^12,13。UTRを同定して注釈を付けるために多くの新しい分析ツールが開発されていますが、それらの多くは、遺伝子構成が真菌のそれとは大きく異なる哺乳類データセット用に設計されているか、単一細胞またはリバースmRNAシーケンシングなどの独立したシーケンシング実験からのデータを必要とするため、トランスクリプトーム解析を行おうとしている研究者にとって時間とコストが増加する可能性があります^12。14,15。

本論文では、NGSデータセットのピークを動的に呼び出すために使用できる、一次導関数の原理に基づいて設計された新しいピークコールソフトウェアであるWonderPeaksを紹介します(図1)。WonderPeaksは、カバレッジ信号の一次導関数を計算し、この値(ピークの傾き)を使用して潜在的なピークを定義することで、ピークを識別します。このアルゴリズムは、一次導関数がユーザーが指定した、またはデータによって推測された傾きしきい値を超える局所的な最大値(増加信号を示す)を示し、続いて同じしきい値を超える局所最小値(減少信号を示す)を示すインスタンスを検索し、それによってデータセット内のすべての候補ピークを検出します。ChIP-seqアプリケーションの場合、WonderPeaksはテストサンプルとコントロールサンプルのすべての候補ピークを比較して、一意に濃縮されたピークを特定します。真菌病原体カンジダ・アルビカンス¹⁶の転写因子の以前に公開されたChIP-seqデータセットにWonderPeaksを適用することにより、元の研究で強調された主要な遺伝子の上流のピークを正常に同定する能力を実証すると同時に、このアプリケーションにおけるアルゴリズムの現在の限界についても議論しました。

また、WonderPeaksを活用して3'RNA-Seqデータセットのピークを同定するソフトウェアツールであるPeakStreamも紹介します。3'RNA-Seqライブラリーは、ポリ(A)プライミングによって生成されたリードは、遺伝子のコード配列(CDS)の終止コドンを超えて拡張されることが多く、したがって、コード領域のみに焦点を当てた標準アノテーションを使用する場合はカウントされないため、正確な3'UTRアノテーションに依存しています。PeakStream解析パイプラインは、遺伝子コード配列(CDS)領域の下流領域に焦点を当てて、3' RNA-Seqデータを使用して新しいゲノムアノテーションを作成するように設計されています。PeakStreamはこれらのピークを遺伝子に割り当て、下流のリードカウントプログラムで使用する新しいゲノムアノテーションを生成します。PeakStreamを使用すると、3'RNA-Seq C. albicansデータセット内の適切な遺伝子に下流のポリ(A)生成ピークを正確に識別し、割り当てることができることを示しています。また、PeakStreamは、現在の遺伝子アノテーションに関連付けられる可能性が低いピークにアノテーションを付け、新しい転写産物の可能性の発見を容易にします。PeakStreamとWonderPeaksは、次世代シーケンシング(NGS)データセットでピーク検出するための強力なユーザーフレンドリーなツールスイートを表します。

図1:WonderPeaksとPeakStreamによるピークコールの概要図。 左:1次導関数を使用したピーキング呼び出し。右上:WonderPeaksを用いたChIP-Seqデータセットのピークコール。右下:PeakStreamを使用したRNA-Seqデータセットのピークコール。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

プロトコル

1. インストール(完了したらスキップ)

1. 前提 条件
   1. Anaconda または Minconda をインストールして、前処理 (セクション 5) と WonderPeaks (セクション 6 またはセクション 7) を実行するための要件をロードします。
      注: Anaconda のユーザーガイドについては、リファレンス¹⁶ を参照してください。
   2. Python: Python を Anaconda または Miniconda 内にインストールします。
   3. Jupyter Notebooks をインストールして、このメソッドのすべての関数を実行します。
      注: Jupyter Notebook の初心者向けユーザーガイドは、参考文献¹⁷ にあります。
      注意: 真菌ゲノム (≤100 Mbp) の場合は、少なくとも 20 コア、8 GB の RAM、および 30 GB の使用可能なディスク容量を備えたコンピューティング環境を確保してください。
2. 前処理機能をインストールします。
   1. ターミナルで、conda create -n WP_preprocessingを実行します。
   2. ターミナルで、conda activate WP_preprocessing を実行します。
   3. ターミナルで、conda env update --file environment.yml --name を実行します。
      注: environment.yml は、すべてのパッケージの依存関係を含むファイルであり、https://github.com/mgarber21/WonderPeaks_preprocessing.git からダウンロードする必要があります。
   4. ターミナルで、pip install WonderPeaks-preprocessing を実行します。
   5. ターミナルで、conda deactivate WP_preprocessingを実行します。
3. WonderPeaks Functions をインストールします。
   1. ターミナルで、 conda create -n WonderPeaks を実行します。
   2. ターミナルで、次のように実行します: conda activate WonderPeaks
   3. ターミナルで、conda env update --file environment.yml --name を実行します。
      注: environment.yml は、すべてのパッケージの依存関係を含むファイルであり、https://github.com/mgarber21/WonderPeaks.git からダウンロードする必要があります。
   4. ターミナルで、 pip install WonderPeaks を実行します。
   5. ターミナルで、 conda deactivate WonderPeaks を実行します。
      注: ステップ 1.2 と 1.3 では、次のことを実現します。前処理 (セクション 5) と WonderPeaks (セクション 6 と 7) 専用の Conda 環境 を作成し 、依存関係を分離して他のソフトウェアとの競合を回避します。環境を アクティブ化 し、WP_preprocessingまたはWonderPeaks固有の機能をインストールして実行するように設定します。データの前処理に必要なソフトウェアの依存関係とツール をインストールし ます。使用していないときは環境を 非アクティブ化 して、偶発的な変更を防ぎ、システム リソースを解放します。
4. Jupyter Notebook とテンプレートを WonderPeaks GitHub リポジトリからダウンロードします。WonderPeaksのダウンロードを、生データを含むオペレーティングシステムにアップロードします(ディレクトリはセクション2で作成されます)。
   注: Jupyter Notebook には、前処理、WonderPeaks、および PeakStream ワークフローの実行に必要な事前に作成されたスクリプトとテンプレートが含まれています。それらを生データと同じシステムにアップロードすると、パスとディレクトリが正しく配置されます。

2. データディレクトリを作成する

注:WonderPeaksおよびPeakStreamワークフローでは、すべてのデータ(未加工データと処理済みデータ)を同じディレクトリに保存する必要があります。このステップでは、この新しいディレクトリ ({data_directory} = /path/to/your/data) を作成する方法と、実験的な生データ (未処理のシーケンス読み取り) をこのディレクトリ内の raw_data というフォルダーに移動する方法について説明します。

1. データディレクトリを作成します。
   1. ターミナルで、 mkdir {data_directory} を実行します (例: mkdir /path/to/your/data)
2. 未処理のシーケンス読み取り用の生データサブディレクトリを作成します。
   1. ターミナルで、 mkdir {data_directory}/raw_data を実行します(例: mkdir /path/to/your/data /raw_data)
3. 未処理のシーケンス読み取りを生データディレクトリに移動します。
   1. ターミナルで、 mv {current_path_to_raw_data}/*fastq* {data_directory}/raw_data を実行します (例: mv current/data/path/*fastq* /path/to/your/data /raw_data

3. ユーザー入力ファイル(NGS_user_input.csv)を作成する

注:入力ファイルは、前処理とWonderPeaksを実行するためのユーザー生成構成を指定します。

1. テンプレート NGS_user_inputs.csv は、WonderPeaks GitHub リポジトリからダウンロードします。
2. NGS_user_inputs.csvでフィールドを更新します。フィールドを次のように更新します。
   データディレクトリ: /path/to/your/data
   ゲノムディレクトリ: /path/to/your/genome
   ゲノムファスタ:genome.fasta
   ゲノムアノテーション:genome_annotation.gtf(ゲノムアノテーションのファイル名をGTF形式で提供)
3. 更新した NGS_user_inputs.csv をセクション2で作成したデータディレクトリに保存します。
   注意: ファイル名は変更しないでください。WonderPeaks は、 名前が NGS_user_input.csv の場合にのみこのファイルを認識します。

4. メタデータファイルの作成(NGS_user_metadata.csv)

注:メタデータファイルは、実験に関連する情報を保存するために使用されます。実験の条件を説明するために列を追加できますが、これらは後続のステップには影響しません。

1. テンプレート NGS_user_metadata.csv は、WonderPeaks GitHubリポジトリからダウンロードします。
2. NGS_user_metadata.csvのフィールドを更新するフィールドは次のとおりです。
   1. ファイル: ファイル名にスペースが含まれていないこと、ファイル ハンドル (fastq、fastq.gz など) が含まれており、絶対パスが含まれていないことを確認します。
   2. bedgraph: このフィールドを TRUE または FALSE に設定して、ファイルを PeakStream に含めるかどうかを指定します。
      1. ファイルをPeakStream分析から合理的に除外できる場合は、ベッドグラフフィールドをFALSEに設定します。たとえば、RNAseq実験では、変異体またはサンプル間のUTRの違いが予想されないその他のケースに対して、ベッドグラフパラメータbedgraph=FALSEを設定します。ただし、RNAseq実験のすべてのコントロールファイルとChIPseq実験のすべてのファイルについて、ベッドグラフフィールドをTRUEに設定してください。
   3. designfactor (デザインファクター)
      1. designfactor1: 実験計画に関連する設計係数 ( 例: 治療 や sample_type) を指定します。
      2. designfactor2: 実験計画に関連する 2 番目の設計因子 ( ひずみ や エピトープなど) を指定します。 RNAseq 実験では、一般的な設計因子として 処理 と 株 を含めます。 治療 列には適用された処理(コントロール、薬物1など)がリストされ、 株 列には菌株情報(野生型、変異体など)がリストされます。 ChIPseq 実験では、典型的な設計係数として sample_type と エピトープ を含めます。 sample_type 列にはタンパク質がタグ付けされているかタグ付けされていないかがリストされ、エピトープ列には使用された エピトープ の名前がリストされます。
         注: designfactors は、実験計画に固有の属性です。
         WonderPeaksは、タグなしのコントロールまたはベースラインとしての入力コントロールのいずれかと互換性があります。
      3. 設計因子列に一意の反復数が含まれ ていない ことを確認してください(例:sample_type: [tagged_1, tagged_2, untagged_control _1, untagged_control _2]ではなく、sample_type[tagged, tagged, untagged_control, untagged_control]。一意のレプリケート番号を指定すると、実行中にエラーが発生します。
      4. 設計係数名には、スペースの代わりにアンダースコア(_)を使用してください。
      5. ChIPseq アプリケーションの場合、メタデータ・ファイルの sample_type (またはカスタム名) 列に、 タグ および 制御という単語を含む用語が含まれていることを確認します。
         注: たとえば、有効なエントリには tagged と untagged_control を含めることができます。これらの用語なしで sample_type 列を指定すると、実行中にエラーが発生します。
         注意: ChIP アプリケーションの場合、ユーザーは 2 つの 設計要素を指定する必要があります。
      6. 関連する NGS_user_inputs.csv行に設計係数を追加します。設計因子に使用される列名がセミコロンで区切られた文字列(例: treatment;ひずみまたはsample_type;エピトープ)。
         注意: NGS_user_inputs.csv の設計係数は、 NGS_user_metadata.csv の列と完全に一致する必要があります。実行が一致しないと、実行中にエラーが発生します (図 2、 補足表 S1、 および 補足表 S2)。

図2:NGS_user_input.csvとNGS_user_metadata.csvの例。 NGS_user_input.csv (上部パネル) と NGS_user_metadata.csv (下部パネル) の例で、designfactor 列と designfactor 列の一致をピンクまたは青のテキストと矢印で強調表示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

5. NGSデータの前処理

注: カスタム前処理を使用する場合は、セクション 5 またはセクション 6 に進んでください。

1. NGS前処理Jupyter Notebook(NGS_Preprocessing.ipynb)を開きます。
2. ノートブック インターフェイス WP_preprocessing 右上隅にある環境 (手順 1.2 で作成) をアクティブ化します。
3. Shift キーを押しながら Enter キー (Shift+Enter) を押して、最初のセルを実行します。
4. Jupyter Notebook の 2 番目のセルで、Directory = "path/to/your/data" を設定してディレクトリ パスを更新します。ここで、 path/to/your/data/ は セクション 2 で作成されたディレクトリです。
5. 線形ファイルを生成します。前処理関数は、FastP¹⁸を使用してトリミングを実行します。FastQC¹⁹およびMultiQC²⁰を使用した品質管理。STAR²¹を使用したアライメント。出力アライメントファイルは、データディレクトリ内のstartoutという名前のサブディレクトリ(例:path/to/your/data/starout)に保存されます。samtools ビュー²² を使用してフィルタリング (または個別) アライメント ファイルをフィルタリングして、NGS_user_inputs.csvで指定されたしきい値を超える読み取りのみを保持します。
   注:これらの関数は、一度にデータセットの1回の読み取り(R1など)のみを処理します。ユーザーは、NGS_user_inputs.csvでFastPとSTARの実行オプションを指定できます(例:FastP:adapter_sequence(オプション)。STAR: genomeDir, genomeFastaFiles, sjdbGTFfil) を参照してください。
6. 2番目のセルで Shift + Enterで前処理関数を実行します。
   注: 2 番目のセルのタスクは、完了するまでに数時間かかる場合があります。実行が中断された場合は、手順 5.3 から 5.6 を繰り返して実行を再開します。前の手順の進行状況は上書きされず、プロセスは中断したところから続行されます。
7. BamCoverage²³ を使用して、アライメント カバレッジのトレース ファイルを生成します (手順 5.7.1 および 5.7.2 を参照)。
   注:ChIPseqの場合、WonderPeaksには、正方向と逆方向の両方の読み取りをカバーする単一のベッドグラフファイルが必要です。Poly(A)プライミングを使用したRNAseqの場合、PeakStreamには2つのベッドグラフファイルが必要であり、1つはフォワードリード用(_fwd.bedgraph)用、もう1つはリバースリード用(_rev.bedgraph)です。順方向と逆方向の読み取りは、BamCoverage²³ 内の filterRNAstrand パラメーターを使用して生成されます。
   1. 次のパラメーターを使用して ChIPseq を実行します: outfilfeformat="bedgraph"、strand=None、binsize=20、smoothLength=60、minMappingQuality=255、normalizeUsing="CPM"。
      注: 出力:順方向と逆方向の両方の読み取りのカバレッジを含む単一のベッドグラフファイルを生成します。出力は/path/to/your/data/bedgraphout に保存されます(図3)。
      1. 3 番目のセルで BamCoverage 関数を Shift + Enter キーで実行します。
   2. 次のパラメーターを使用して RNAseq を実行します: outfilfeformat="bedgraph"、strand="forward" or "reverse"、binsize=20、smoothLength=60、minMappingQuality=255、normalizeUsing="CPM"。
      注意: ストランドを順方向または逆方向に設定して関数を 2 回実行し、両方向の読み取り用ファイルを生成してください。
      注: 出力:2つのベッドグラフファイルを生成します:1つは順方向読み取り用(_fwd.bedgraph)用、もう1つは逆方向読み取り用(_rev.bedgraph)です。出力は/path/to/your/data/ bedgraphoutに保存されます(図3)。
      1. 3 番目のセルで BamCoverage 関数を Shift + Enter キーで実行します。

図3:WonderPeaksのファイル構成。 bedgrapghout/normalizeUsingCPM ディレクトリ内のベッドグラフ ファイルを含むデータ フォルダーのスクリーンショット。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

6. ChIPseq の WonderPeaks

1. 事前チェック
   1. ファイルハンドル が.bedgraph のすべてのベッドグラフファイルが、 bedgraphout というデータディレクトリ内のサブディレクトリにあることを確認します(図3)。
   2. user_inputsファイル (NGS_user_inputs.csv) の designfactors (図 2) がメタデータ ファイル (NGS_user_metadata.csv) の列と一致し、designfactor 列の行が一意ではないことを確認します (手順 4.2.4 の注意を参照)。
2. NGS前処理Jupyter Notebook(WP4ChIP.ipynb)を開きます。
3. ノートブックインターフェイスの右上隅にある WonderPeaks (手順1.3で作成した環境)をアクティブにします。
4. Shift+Enter キーを使用して、ピーク呼び出しを実行するブレークポイントまでセルを実行します。完了すると、処理されたデータの記録が保存され、WonderPeaksと呼ばれるデータディレクトリ内のサブディレクトリに保存されます
   1. WOnder_init.csvを探してください:すべての生のカバレッジと一次導関数の計算結果の連結。
   2. 注 WOnder_unfiltered_peaks.csv:一次導関数に基づいて呼び出されるすべてのフィルタリングされていないピークの連結。
   3. 観察 bedgraph_summary.csv:各ファイルと染色体をグループ化した後のスコア統計の要約。
5. 実行パラメータを定義します。
   1. マークダウンブレークポイントの下にある1^番目の セルを実行します。
      注: 指定された 設計因子 によって分離された生データを表示するプロットと、設計因子を示すテーブルがポップアップ表示されます。表とプロットを使用して、後続のステップで値を決定します(図4)。
   2. 次のセルで、score_cut、fold_change、designfactor の値を指定します (図 4)。
      1. score_cut は、出力でピークを考慮するかどうかを決定するために使用されるしきい値です。score_cutを決定するには、プロットを観察し、タグ付けされたデータの中央値に近い値を選択します(ハッシュ線、 図4を参照)。この値を次のように入力します: score_cut= 値。
      2. fold_change は、ピークが実在と見なされるかどうかを判断するために使用される、タグ付き:タグなしの比率スコアのしきい値です。fold_changeを決定するには、プロットを観察し、タグなしデータとタグ付きデータの中央値の比率を超える値を選択します。この値を次のように入力します: fold_change= 値。
      3. designfactor_value は実験計画の一部として指定されます。考えられる設計係数は、印刷された表に 赤 で示されています。設計係数を決定するには、赤で示されている値のいずれかを選択します。引用符の間にこの値を次のように入力します: designfactor_value ="{ value}"。
6. Shift + Enter を使用して次のセルを実行し、ピーク フィルタリングとマッピングを実行します。データとサマリープロットは、WonderPeaksと呼ばれるデータディレクトリ内のサブディレクトリに保存されます。
   1. Observe {designfactor_value}_taggedVuntagged.csv: タグ付きサンプルとタグなしサンプルのそれぞれの列を含む、重なり合うすべてのピークのピボットテーブル。
   2. 注{ designfactor_value}_all_tagged_peaks.csv:ユーザーパラメータに基づくすべての実際のピークの要約表(ステップ6.5)。
   3. { designfactor_value}_peaks2gtf.csvの観察:ユーザーパラメータ(ステップ6.5)に基づいて、ユーザーが指定したアノテーションファイル内の遺伝子への実際のピークのマッピング。
7. オプション: ステップ 6.5 から 6.6 を再実行して、ステップ 6.5 のパラメータを切り替えます。同じ designfactor_valueを使用する場合、手順 6.6 で説明したように、生成されたファイルは上書きされます。

図4:WonderPeaks for ChIP-seqのdesignfactor_valueしきい値とユーザー指定のしきい値を強調表示したスクリーンショット。 WonderPeaks jupyter Notebook のスクリーンショットで、表示されたテーブルから可能なdesignfactor_valueオプションと、次のセルでdesignfactor_valueを実装する方法が強調表示されています。上部の黒い矢印は、可能なdesignfactor_valueエントリを表示するテーブルを指します。Op 値は丸で囲まれ、オプションセル (下部の黒い矢印) にdesignfactor_valueに対して選択したユーザー入力として表示されます。グラフでは、実線と破線は、不透明な細胞実験におけるタグ付きサンプルとタグなしサンプルのおおよそのピークスコアの中央値を示しています。これらの中央値は、score_cut (タグ付き中央値) およびfold_change (タグ付き中央値とタグなし中央値の比率) パラメーターを定義するために使用されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

7. 3'RNAseqのPeakStream

1. 事前チェック:
   1. すべてのbedgraphファイルが bedgraphout というデータディレクトリ内のサブディレクトリにあることを確認します(図2)。
   2. オープンNGS前処理Jupyter Notebook(PeakStream.ipynb)
   3. ノートブックインターフェイスの右上隅にある WonderPeaks (手順1.3で作成した環境)をアクティブにします。
2. ブレークポイントまで Shift+Enter を使用してセルを実行し、ピーク呼び出しとピークマッピングを実行します。完了すると、予測された3'UTRと FeatureCounts²⁴ 読み取りカウントファイルを含む新しいアノテーションファイルが保存され、 PeakStream と呼ばれるデータディレクトリ内のサブディレクトリに保存されます(図5)。
   注:デフォルトでは、出力ファイルにはタンパク質をコードするバイオタイプの注釈のみが含まれますが、これはバイオタイプオプションを使用して切り替えることができます。

図5:PeakStreamのファイル構成。bedgrapghout ディレクトリ内のベッドグラフファイルを含むデータフォルダーのスクリーンショット。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

結果

ワンダーピークス
ChIP-seq実験を実施した後、研究者は通常、MACS³などのピークコーラーを使用して、エピトープタグ付きDNA結合タンパク質によって濃縮されたゲノム領域を同定します。WonderPeaksは、上記の方法を使用してピークを識別するように設計されたユーザーフレンドリーなピークコーラーとして開発されました。

WonderPeaksは、最初にカバレッジの一次導関数を計算してピークを識別し、この値(ピークの傾き)を使用して潜在的なピークを定義します。次に、一次導関数がユーザーが指定した傾きしきい値を超える局所最大値 (スコアの増加を示す) を示し、続いて同じしきい値を超える局所最小値 (スコアの減少を示す) を示すインスタンスを検索します。各ピークの中心は、一次導関数の局所的な最小値と最大値の間の中点として計算されます。次に、ピークが互いに120 bp以内に発生する場合、サンプル間でグループ化され、最終的な位置はグループ化されたピークの平均位置を中心とします。一次導関数を計算した後、...

ディスカッション

次世代シーケンシング(NGS)技術は、真菌病原体における遺伝子調節と発現に関する比類のない洞察を提供します。そのため、計算ツールは、実験で生成されたすべてのデータをキャプチャする包括的なものであり、一般ユーザー、特にベンチサイエンティストがアクセスできるものでなければなりません。本レポートでは、ChIP-seqおよびRNA-seqワークフローにおける真菌病原体研究者のこれらのニーズに対応するWonderPeaksとPeakStreamの2つのツールを紹介しました。

WonderPeaksは、ChIP-seq実験におけるピークコールのためのユーザーフレンドリーなワークフローです。広く使用されているMACSと比較すると、WonderPeaksは、高濃縮サンプル(不透明細胞型ではWor4)および低濃縮サンプル(白細胞型ではWor4)でMACSによって検出されたピークを同定し、MACSでは同定されない新しいピークを同定することに成功しました。一次導関数に基づくWonderPeaksアルゴリズムの利点は、パラメータ化をほとん...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
CORALL Total RNA-seq V1 キット	Lexogen	095	ウェットラボ材料
糸状真菌リボプール	siTOOLs	dp-P096-6	ウェットラボ材料
高感度 RNA ScreenTape	Agilent	5067-5579	ウェットラボ材料
高感度 RNA スクリーンテープ ラダー	アジレント	5067-5581	ウェットラボ材料
高感度RNAスクリーンテープサンプルバッファー	ジレント	5067-5580	ウェットラボ材料
WonderPeaks の依存関係のリスト	https://github.com/mgarber21/WonderPeaks/blob/main/environment.yml https://github.com/mgarber21/WonderPeaks_preprocessing/blob/main/environment.yml
			WonderPeaks_preprocessing
Monarch Spin RNA Cleanup Ki	NEB	T2040L	Wet lab material
pygenometracks (3.9)
QuantSeq 3′ mRNA-Seq FWD Library Prep Kit V1	Lexogen	015	ウェットラボ材料
Qubit RNA 高感度 (HS) アッセイキット	Invitrogen	Q32852	ウェットラボ材料
RNAクリーン&レナConcentrator-5	Zymo Research	R1016	ウェットラボ材料
TURBO DNA フリー キット	ThermoFisher	AM1907	ウェットラボ材料
ワンダーピークス(0.1.14)
WonderPeaks_preprocessing(0.2.3)