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方法論記事

粘膜類天疱瘡の診断のための結膜生検および直接免疫蛍光法の技術

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DOI:

10.3791/68303

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2025年6月17日

 ,  , 
1Prof. Krothapalli Ravindranath Ophthalmic Research Biorepository, LV Prasad Eye Institute, 2Brien Holden Centre for Eye Research (BHERC), LV Prasad Eye Institute

この記事について

サマリー

ここでは、結膜類天疱瘡を特定するための結膜生検の採取と処理のプロトコルを紹介します。

要約

眼粘膜類天疱瘡 (MMP) は、慢性瘢痕性結膜炎として現れ、治療せずに放置すると失明を引き起こす可能性があります。タイムリーな診断と免疫抑制療法により、疾患の進行を防ぎます。基底膜への免疫複合体沈着のための結膜生検の直接免疫蛍光染色(DIF)は、MMPの診断です。生検陽性率は、生検の特性、側性、老齢、および疾患活動性によって異なります。現在の方法の論文では、結膜生検を採取し、サンプルの移送とブロック調製に最適な切断温度の媒体充填カートリッジを使用する技術について説明しています。生検は、両眼の結膜の瘢痕化していない、関与していない、または比較的関与の少ない領域から行われます。通常の生検のサイズは、長さ 4 〜 5 mm、幅 2 〜 3 mm で、基底膜を見逃さないように、下にある結膜下組織を小さくする必要があります。基底膜の存在を確認するために、過ヨウ素酸シッフ染色を行うことをお勧めします。指定されたプロトコルを使用して、生検からの凍結切片を蛍光標識抗体IgG、IgM、IgA、および補体因子C3cおよびC4cで染色します。生検陽性では基底膜に緑色の陽性蛍光が認められ、抗体の1つが陽性であってもMMP陽性となります。陰性の生検は類天疱瘡を除外するものではありません。ただし、陽性の場合はMMPが確認され、薬物誘発性瘢痕性結膜炎または偽性類天疱瘡と区別されます。

概要

粘膜類天疱瘡 (MMP) は、自己免疫病因の慢性瘢痕性結膜疾患であり、体内の粘膜に影響を及ぼします 1,2。慢性瘢痕性結膜炎は病因が異なり、SJS、サルコイドーシス、眼扁平上皮腫瘍、および偽性天疱瘡からのMMPの鑑別が必要です。さらに、MMP は失明する可能性のある疾患であり、患者はしばしば遅れて来院し、最初に誤診されます 1,2,5。全身性病変を伴わない眼病変のみが、眼球 MMP 患者の 27.4% に見られます6。MMPの診断には、基底膜2,5の自己抗体の存在を示すために結膜生検が必要です。直接免疫蛍光法(DIF)は、MMPなど、結膜に影響を与える自己免疫疾患を特定するための極めて重要な診断ツールです。DIFは、MMPの特徴である基底膜ゾーン(BMZ)での免疫グロブリンと補体成分のin-situ沈着を検出するのに役立ちます。DIFの陽性率は30%から80%までさまざまです1,5。ただし、一部の患者、特に眼のみのMMPの患者は生検が陰性である可能性がありますが、疾患の進行の臨床記録は生検陽性の眼MMP症例と同様に扱われます7,8。したがって、Dartらは、眼のみのMMP8に対して個別の診断基準が必要であることを強調しました。

研究全体で陽性率が低い理由として提案されているのは、広範囲にわたる眼表面の瘢痕化を伴う進行性疾患、不十分な組織処理または染色技術、および生検陰性の疾患バリアント8,9,10,11です。眼のMMPが疑われる27人の患者の生検の遡及的分析では、陽性率はわずか30%で、63.7%は眼への関与のみであったことが明らかになりました12。DIF には特定のプロトコルが必要です。すべての診断ラボがそれに対応しているわけではありません。生検部位、片眼または両眼から生検を行うかどうか、およびサンプル移送溶液13,14,15に関しては違いがあります。当センターでの結膜生検の遡及的分析では、DIF陽性率は54.1%であり、両側生検では陽性率が高かった(59%対45%)8。生検は重要ですが、臨床徴候と進行性の眼表面瘢痕形成は、MMPの診断を決定づけるのに役立ちます。口腔や皮膚などの眼外部位が関与している場合、診断が容易になり、それぞれ患者の40%と18%で報告されています5。

既存の文献にはバリエーションがあり、ここで提示されたプロトコルは、独自の転写媒体14の必要性を減らすために導入された修正を伴う参照ガイドとして役立つことができる。生検は、最適な切断温度(OCT)培地で移され、病理検査室の同じ移管カートリッジで急速冷凍されるため、追加の移管培地は必要ありません。本稿では、結膜組織のDIF染色、組織採取、およびサンプル移送プロトコルの方法論について概説しています。

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プロトコル

このプロトコルは、LV Prasad Eye Instituteの人間研究倫理委員会の人間研究倫理委員会のガイドラインに従っています。

1.結膜生検技術

  1. 局所麻酔または局所麻酔および手術用顕微鏡下で類天疱瘡が疑われる患者の両眼からの計画生検。
  2. 患者からインフォームドコンセントを取得し、出血、瘢痕化、および手術後に局所ステロイドを開始する必要性の可能性のある副作用をリストアップします。
  3. 0.5%プロパラカインを1〜2滴両目に入れ、5分間待ってから手順を開始します。.
  4. 患者が細かい鉗子で結膜に触れたときに痛みを感じないようにしてください。局所プロパラカインを適用した後も患者が痛みを感じる場合は、結膜下2%リドカイン0.2 mLを1 mLのツベルクリン注射器で注射します。.
  5. 右目または左目のいずれか早い方に検鏡を留置します。
  6. 眼の表面に瘢痕化と角質化の領域がないか調べます。関与がなく、瘢痕化または角質化していない生検領域を選択します。
    注: この研究では、辺縁部から離れた上球結膜が生検部位として好まれ、続いて下眼球結膜が好まれます。
  7. リムの鉗子を使用して強膜を結膜から持ち上げ、長さ4〜5 mm、幅2〜3 mmのウェストコットのはさみで直線的に切除します。
  8. 生検全体を直ちに最適な切断媒体(OCT)に移します。
    注:生検は、通常の生理食塩水またはMichel輸送培地で移すことができます。
  9. カートリッジと中央に井戸があるプラスチック製のティッシュ型を取り、生理食塩水できれいにし、風乾します。
  10. カートリッジに右目と左目用に別々にOCTメディウムを入れます。切除した結膜組織をOCT培地に浸し、病理学に送ります。
  11. 反対側についても同様の手順を繰り返します。

2. 組織の移し替え

  1. 結膜の生検標本をOCT培地に埋め込むことで、Michelの輸送培地または生理食塩水で受け取った場合に組織構造と抗原性を維持します。
  2. 液体窒素またはドライアイスを使用して包埋されたサンプルを急速凍結し、-80°Cで一晩保存します。

3. 調製と組織切片作成

  1. 凍結した組織を、-20°C〜-25°Cのクライオスタットを使用して4〜6μmのスライス(数7)に切片化します。
  2. 正に帯電したポリリジンコーティングされた顕微鏡スライドに切片を取り付けて接着を確保し、アルミホイルで染色するまで-80°Cで保存します。

4. 免疫蛍光染色

  1. スライドを室温(RT)で10分間解凍し、冷たいアセトン(100%)で10分間固定することで、抗原を保存し、組織の損傷を防ぎます。
  2. 1x PBSで3回、毎回5分間すすぎ、余分なOCT培地とアセトンを取り除きます。
  3. 抗IgG、抗IgA、抗IgM、および希釈した抗C3抗体(フィブリノーゲン-1:10[ポジティブコントロール]、IgG-1:10、IgA-1:10、IgM-1:10、C3-1:5、C4-1:10)をスライド上に塗布します。
    注:抗体は1x PBSで希釈されます。
  4. ネガティブコントロールの場合は、標識抗体の適用をスキップし、以下の残りの手順に従ってください。
  5. 抗体の希釈に関するメーカーのガイドラインに従い、既知のポジティブコントロールとネガティブコントロールで標準化してください。
  6. スライドを加湿チャンバー内で37°Cで45〜60分間インキュベートします。
  7. スライドをPBS(3×各5分間)で洗浄し、結合していない抗体を除去します。
  8. DAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニリドール)含有封入剤で対比染色し、核の可視化を行います。
  9. スライドの上にカバースリップを置き、20分間硬化させます。
  10. 使用する蛍光色素に適したフィルター(488 nmの励起緑色フィルター)を装備した蛍光顕微鏡を使用してスライドを検査します。
  11. デジタル顕微鏡写真で調査結果を文書化します。

5. 急速過ヨウ素酸 - シッフ染色

  1. 過ヨウ素酸シッフ(PAS)の調製
    1. 1 gの塩基性フッシンを100 mLの熱い蒸留水に溶かします。
    2. 塩酸10mLとジスルファイ酸カリウム2gを加えて染料を脱色します。
    3. 冷却後、0.5 gの活性炭を加え、溶液を攪拌し、ろ過して透明な過ヨウ素酸シッフ試薬を得ます。暗いボトルに保管してください。
      注:シフ試薬をテストするには、時計のグラスに10 mLの37%ホルマリンを注ぎ、テストするシフを数滴加えます。.良いシフ試薬は急速に赤紫色に変わります。シッフ試薬が劣化すると反応が遅れ、深い青紫色になります。
  2. PAS染色技術
    1. スライドを水で水和させます。
    2. 0.5%過ヨウ素酸溶液で5分間酸化します。
    3. 蒸留水ですすいでください。
    4. Schiff試薬に15分間置く(このステップでは切片が淡いピンク色に見える)
    5. ぬるま湯で5分間洗います(セクションは濃いピンク色に変わります)。
    6. メイヤーヘマトキシリンで1分間対比染色します。
    7. 水道水で5分間洗います。
    8. 次の溶液でスライドを脱水します:80%エチルアルコールで1分間1回、90%エチルアルコールで1分間2回、100%エチルアルコールで1分間2回。
    9. スライドをキシレンで3回、それぞれ1分間脱水します。
    10. 合成封入剤(DPX封入剤など)を使用してスライドにカバースリップを貼ります
    11. PASの結果を明視野顕微鏡で観察します。

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結果

DIFの解釈には、組織切片に基底膜が存在することを確認する必要があります(図1)。PAS染色スライドでは、基底膜は結膜上皮の基底領域に位置する明るいピンク色の膜として現れます(図1C)。基底膜の連続性と構造についてもコメントする必要があります。DIF陽性は明るい緑色のBM(図1B)として表示され、IgM(図2A)、IgA(図2B)、IgG(図1B)、C3、またはC4の沈着を示します。この5つの抗体のうち、1つの抗体でも陽性であれば、DIF陽性とみなします。PAS染色で基底膜が存在しない場合は、結膜生検を繰り返す必要があります。フィブリノーゲンで染色したポジティブコントロールは、基底膜に明るい緑色の蛍光を示します(図2C)。陰...

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ディスカッション

ここで説明する結膜生検の技術は、OCT培地を転写媒体として使用するため、追加の転写培地が不要になり、凍結切片のためにOCT培地に移すための生検の取り扱いを回避できます。培地と生検を充填したプラスチックカートリッジ型を直接凍結して組織ブロックを作成し、切片化します。OCTの利点は、結晶形成による損傷を最小限に抑えて急速に凍結し、組織標本をカプセル化することです。直接免疫蛍光法の最も重要なステップは、サンプルの移載です。結膜生検はホルマリンで送るべきではありません。.しかし、ある研究では、免疫組織化学16を用いて処理されたホルマリン固定パラフィン包埋標本の生検陽性率が評価されている。いずれの生検でもIgGまたはIgAに陽性はなく、C3dまたはC4dに陽性であったのは生検の56%のみであった。外部委託された検査施設を有する診療所では、通常の生理食塩水も輸送媒体として使用されてきた13。DIFの結果は、生理食塩水で24時間輸送された25件の皮膚生検の92%で決定的であり、生理食塩水で...

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開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

この研究を支援してくれたインドのハイデラバード眼科研究財団に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1 N塩酸 フィナー ケミカルリミテッド 7647-01-0
アセトン クオリゲン質問33517
アルブミンダコF0117
ベーシックフクシンクオリゲン質問39402
C3c診断バイオシステムズ F003
C4c診断バイオシステムズ F005
カートリッジポリサイエンス25376-500
木炭活性 シグマC-5260
クライオスタット ライカ CM1860UV 
クライオトームブレード ライカ 818
DAPIのアブカム AB104139
フィブリノーゲン 診断バイオシステムズ F006
蛍光顕微鏡オリンポスCX43
鉗子 ジョジャ外科手術JS1528A
湿度チャンバー 診断バイオシステムズ SM365
IgA診断バイオシステムズ F007
IgG診断バイオシステムズ F008
IgM診断バイオシステムズ F009
IHC粘着スライドガラス トモ 33140455
リムの鉗子スピードウェイ S-7223
ミシェルのタンスポートミディアムフィッシャー・シニティクス NC0253304
顕微鏡カバーガラス青い星https://www.bluestarslides.com
OCTミディアム クライオマトリックス 6769006
PBS ダコDM831
過ヨウ素酸 シグマ375810-25G
二亜硫酸カリウムシグマP2522-500G
プロパラカイン 0.5%サンウェイプライベート G/1118A
ウェストコットのハサミピリグ・グルジカル・イントラメンツ 423480

参考文献

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  2. Vazirani, J., et al. Chronic cicatrizing conjunctivitis: a review of the differential diagnosis and an algorithmic approach to management. Indian J Ophthalmol. 68 (11), 2349-2355 (2020).
  3. Singh, S., et al. Drug-induced cicatrizing conjunctivitis: a case series with review of etiopathogenesis, diagnosis and management. Ocul Surf. 24, 83-92 (2022).
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