健康および虚血 性ex vivo ラット心臓における双方向電気および光電子界面

サマリー

このプロトコルは、光学的および電気的双方向バイオインターフェーシングのための高度な材料製造と ex vivo ラット心臓法の概要を説明し、バイオエレクトロニクス研究のための正確な心臓刺激、記録、および梗塞モデリングを可能にします。

要約

電気生理学的研究は、材料と心臓バイオインターフェースとの間の相互作用を探求する上で極めて重要です。近年の進歩により、心臓モデルとの双方向インターフェースのためのさまざまな新しい導体および半導体材料が導入され、低強度のペーシングと高い時空間および高い信号対雑音比(SNR)記録が容易になりました。 ex vivo げっ歯類の心臓モデルは、新しい材料やデバイスの機能を検証するための効果的なプラットフォームとして機能し、倫理的および管理上の懸念を最小限に抑えながら、 in vitro の知見をトランスレーショナルな洞察に橋渡しします。このプロトコルでは、ランゲンドルフ装置を使用した成体ラット心臓の単離と ex vivo 灌流を詳しく説明し、ナノポーラスシリコン、ナノポーラスカーボン、フレキシブルメッシュ状微小電極アレイなどの高性能半導体と導体による正確な双方向刺激と記録を確立します。さらに、虚血再灌流(I / R)損傷によって引き起こされる心筋梗塞モデルを提示し、マルチチャネルの記録とマッピング、および梗塞染色を通じて評価し、心疾患に関連する研究と潜在的な治療法の探索を可能にします。この方法論は、材料-生体界面の研究と次世代の心臓バイオエレクトロニクスの開発に貴重な洞察を提供します。

概要

心臓バイオエレクトロニクスの分野は、心臓との正確で効率的な双方向通信を可能にする材料とデバイスを開発する必要性に駆られて、急速に進歩しています1,2,3,4。電気生理学的研究は、この取り組みにおいて極めて重要な役割を果たし、材料が調節とセンシングを通じて心臓バイオインターフェースとどのように相互作用するかについての重要な洞察を提供します。培養HL-1細胞株やげっ歯類の初代心筋細胞などのin vitroモデルは、初期評価5,6,7,8のための制御された環境を提供しますが、その単純さはしばしば生きている心臓の複雑で動的な状態を再現することができません。これらのモデルは、協調的な電気伝導と機械的な力の生成に不可欠な心臓の3D構造を欠いており、リズミカルな収縮-緩和サイクルや酸素と栄養素の供給に不可欠な灌流ダイナミクスを模倣することはできません⁹。逆に、in vivoモデルは、最も生理学的に関連性のある洞察を提供しますが、広範なトレーニングの必要性、高度な外科的セットアップ、厳格な規制の枠組みへの準拠など、倫理的、管理的、および技術的な重大な課題を伴います¹⁰。

このギャップを埋めるために、ランゲンドルフ灌流成体ラット心臓などのex vivo心臓モデルは、科学研究^11,12に代わる魅力的な選択肢を提供します。これらのモデルは、in vivoシステムの生理学的関連性と、in vitroセットアップの制御性およびアクセシビリティを兼ね備えています。ランゲンドルフの装置は、心臓を分離し、機能的な状態に維持することで、研究者が正確に制御された条件下で心臓の電気生理学に関する高忠実度の研究を行うことを可能にします。神経入力や循環ホルモンなどの全身変数がないため、心臓生理学の重要な側面を維持しながら、結果の解釈が簡素化されます。さらに、ex vivoモデルは多くの倫理的懸念を軽減し、リソースの負担を軽減するため、トランスレーショナルリサーチのための多用途で実用的なプラットフォームとなっています¹³。

このプロトコルは、そのトランスレーショナルポテンシャルに加えて、材料性能評価のベンチマークを設定します。無線光刺激用の光電子プラットフォームや有線刺激および記録用の電子システムなど、代表的な材料戦略を組み込むことにより、比較研究のための再現性のあるフレームワークを確立します。この標準化は、イノベーションを促進するだけでなく、研究グループ間での知見の再現性と信頼性も向上させます。過去には、PEDOTなど、多くの高性能光電極および電極が生体電気研究に大きな期待を寄せていました:PSS¹⁴、MXene¹⁵、酸化イリジウム¹⁶、白金¹⁷、モリブデン¹⁸、シリコン19,20,21、量子ドット22,23,24、有機半導体²⁵.ここで、このプロトコルは、ナノポーラスシリコン²⁶、ナノポーラスカーボン²⁷、および柔軟なメッシュ状の金多電極アレイ(MEA)^28,29を含む代表的で最先端の材料を提示し、プロトコルに統合して、双方向の心臓インターフェースにおけるそれらの能力を実証する。これらの材料は、低強度の閾値上刺激、高い時空間分解能、および高いSNR記録を可能にし、心臓バイオエレクトロニクスを進歩させる可能性を示しています。さらに、I/R損傷によって誘発される心筋梗塞モデルを含めることで、疾患関連研究や治療探索のための強固な枠組みが提供されます。

この研究では、リードレス光刺激およびex vivoラット心臓による電気刺激およびセンシングのための先端材料を製造および適用するための詳細な方法を紹介します(図1A)。ナノ多孔質シリコン膜は、フォトリソグラフィーパターニング、反応性イオンエッチング(RIE)、および5μmのデバイス層を持つシリコンオンインシュレータ(SOI)ウェーハからの緩衝フッ化水素酸(HF)放出によって作製され、続いて染色エッチングおよび軟質ポリジメチルシロキサン(PDMS)膜²⁶に転写された。電気刺激および記録のために、ナノポーラスカーボンは、塩インキュベートされたセルロース基質のレーザーアブレーション、続いて水相移動および熱ラミネートによって開発され、従来の金電極と比較して電荷貯蔵および注入能力が向上した²⁷。さらに、フレキシブルMEAは、フォトリソグラフィー、電子ビームメタライゼーション、エッチング、カプセル化、およびリリースプロセスを使用してポリイミド被覆Siウェーハ上に製造され、空間的に分解された心外膜の記録とマッピングを可能にしました^28,29。

製造を超えて、このプロトコルは、成体ラットの心臓の分離、灌流、モニタリング、および光学および電気デバイスとのインターフェースのための段階的なプロトコルを提供します。これらのデバイスは、分離された心臓でテストされ、電気生理学的評価のためのペーシングと記録で代表的な結果を示しました。このプロトコルでは、I/Rを通じて心筋梗塞モデルを作成する方法も紹介し、生理学的記録、染色、および形態学的評価によって検証します。この包括的な方法論は、心臓バイオインターフェースの材料とデバイスを評価するための再現性のあるフレームワークを確立します。図1B-Dは、このex vivo心臓モデルでの評価のための材料製造のワークフローの概要を示しています。図2A-Cは、製造時のデバイスの写真で予想される結果を示しています。

プロトコル

すべての動物処置は、シカゴ大学の動物管理および使用委員会(プロトコル番号72378)によって承認されました。

1. ナノポーラスシリコン膜の作製(図1B、 図2A、 図3)

1. AutoCADソフトウェアでフォトマスクパターンを設計します(図3)。デバイスのサイズが生物学的ターゲットの長さスケールと一致していることを確認してください。ラットの心臓には、2〜10 mmのデバイスサイズを使用してください。設計では、直径 20 - 100 μm の小さなホールアレイを追加して、バッファード HF の Si デバイス層の放出を容易にします。直径 200 - 1000 μm の 3 つの大きな穴を作り、膜の正しい面を識別するのに役立つキラルな文字 L を形成します。
2. 超音波浴でアセトンとイソプロピルアルコール(IPA)でそれぞれ3分間、SOIウェーハを洗浄します。ホットプレートで200°Cで20分間脱水ベーキングを行います。
3. 厚質ポジレジストAZ40XT-11Dを3000rpmで45秒間スピンコートし、115°Cで3分間ベーキングします。ウェーハにフォトレジストを注ぎすぎないように注意してください。スピンコーティング後、アセトンスワブを使用してウェーハの裏側の残留物をクリーンアップします。
   注:AZ40XT-11Dは非常に粘性のあるポジ型フォトレジストです。
4. ハイデルベルグMLA150ダイレクトライターを使用して、フォトレジストパターンを375 nm、800 mJ/cm²の線量で露光します。露光後のベーキングを110°Cで2分間行います。
5. AZ 300MIF現像液でパターンを2分間現像します。ウェーハを脱イオン(DI)水で60秒間すすぎ、次にN₂ 空気で乾燥させます。
6. チャンバー圧力10mTの誘導結合プラズマフッ化物エッチング装置で、600 Wの誘導結合プラズマと60 Wの無線周波数を使用して、SF₆/CHF₃ (20 sccm:50 sccm)RIEプロセスを使用して12分間、カバーされていないSOIをエッチングすると、エッチング速度は約660 nm/minになります。
7. AZ NMPを使用してフォトレジストを80°Cの超音波浴で10分間ストリッピングし、超音波浴でアセトンで3分間、続いてIPAで3分間洗浄し、圧縮窒素で乾燥させます。
8. サンプルを室温で緩衝HFに浸して、埋もれた酸化物層を排除します。デバイスは4〜8時間でリリースされます。溶液の温度をわずかに上げ(40°C)、放出を促進します。
9. 放出されたメンブレンを1 cm x 1 cmの濾紙で2つの別々のDIウォーターバスに順番に慎重に移し、残留HFを除去します。
   注: ここで実験を一時停止できます。メンブレンをIPAバスに浸し、4°Cで保存します。
10. 濾紙を使用してメンブレンを脱イオン(DI)水を入れたペトリ皿に移します。膜は、疎水性と表面張力により水面に浮かびます。
    注:シリコン膜は、マランゴニ効果³⁰により、IPAから水に厳密に移動することができます。
11. 別のシャーレで、濃縮HFと濃硝酸の体積比が100:1のステインエッチング液(例:10 mLのHFと0.1 mLのHNO₃)を含有する染色エッチング液を調製します。エッチングする前によく混ぜてください。
12. 濾紙でメンブレンを染色エッチング液に移し、30秒間エッチングします。Si膜の側面には、3つの主要な穴によって形成される文字Lの向きに注意してください。Si膜はエッチング液上に浮かび、膜の片側のみがエッチングされます。
13. 濾紙でメンブレンを2つの別々のDI水皿に移し、残留物HFを洗い流します。
    注: ここで実験を一時停止できます。メンブレンをIPAに移し、4°Cで保存します。
14. 薄いPDMSで支持基板を作製します。パートA(ベースポリマー)とパートB(硬化剤)を10:1の重量比で混合し、30分間脱気します。
15. スライドガラス上にPMMA(495 A6)犠牲層をスピンコートし、2,000 rpmで45秒間塗布します。180°Cで60秒間焼きます。
16. PMMAコーティングされたガラスにPDMSを4,500rpmで45秒間スピンコートすると、厚さは10〜20μmになります。80°Cのオーブンまたはホットプレートで2時間硬化させます。
    注:機械的損傷を軽減するために、PDMSはナノ多孔質シリコン膜を収容するための軟質基板として使用され、ピンセットによる直接の取り扱いによる潜在的な損傷に対する保護を提供しました。
17. 汚れエッチングしたSiメンブレンをIPAからPDMSに移します。清潔なティッシュを使用して余分なIPAを取り除くと、IPAが蒸発した後、Si膜がPDMSにしっかりと付着します。Si膜の側面には、3つの主要な穴によって形成される文字Lの向きが識別されます。エッチングされた多孔質Siは外側を向いており、エッチングされていないSiはPDMSとインターフェースする必要があります。
18. Siメンブレンを含むカミソリの刃を使用して、PDMSを円周方向に切断します。十分なスペースを確保し、Si膜を傷つけないように注意してください。
19. Si/PDMSが放出されるまで、デバイスをアセトンに浸します。長時間浸しすぎるとPDMSの腫れの原因になりますので避けてください。DI水ですすぎ、_N2で乾かします。O2プラズマ処理を400Wで10分間行います。

2. フレキシブル微小電極アレイの作製(図1C、 図2B、 図4)

1. AutoCADでフレキシブルMEAの構造を設計します(図4)。電極の投影面積が同じで基板構造が異なる2つの異なる設計を紹介します(図2B、 図4)。
2. シリコンウェーハ基板をアセトンとIPAで超音波浴でそれぞれ3分間洗浄します。
   注:このプロトコルでは、ポリイミド(PI)とSiウェーハ間の接着性を高めてデバイスの離型を促進するための追加の表面処理は必要ありません。酸素プラズマ処理は、必要に応じて接着力を高めるために使用できます。
3. ポリ(ピロメリット酸二無水物-co-4,4'-オキシジアニリン)のPI前駆体溶液を4 mLウェーハに注ぎます。ウェーハを1,500rpmで45秒間スピンコートします。NMPまたはアセトンを使用して、ウェーハの裏側にある前駆体を除去します。
4. 110°Cで3分間、次に180°Cで3分間プレベークします。PIコーティングされたウェーハをプロファイルモードのレジストオーブンで硬化させます。室温から開始し、4°C/minのランプ速度で250°Cまで加熱し、30分間保持します。次に、ウェーハを2.5°C/minのランプ速度で350°Cに加熱し、350°Cで60分間保持した後、ゆっくりとRTまで冷却します。その結果、厚さ約5μmのPI膜が得られます。
5. PIコーティングされたウェーハをAZ nlof 2020で2,000rpmで45秒間スピンコートします。ウェーハを110°Cで2分間焼きます。ハイデルベルグMLA150ダイレクトライターを使用して、375 nm、200 mJ/cm²の線量でフォトレジストパターンを露光します。
6. 露光後のベーキングを110°Cで2分間行います。AZ 300MIF現像液でパターンを1分間現像します。ウェーハをDI水で60秒間すすぎ、次に_N2 空気で乾燥させます。
7. 電子ビーム蒸発器を使用して、10 nmのチタンと200 nmの金を堆積します。AZ NMPを使用してフォトレジストを80°C浴で3時間ストリッピングし、超音波浴でアセトンで3分間洗浄した後、IPAで3分間洗浄し、圧縮窒素を使用して乾燥させます。
8. 厚手のポジレジストAZ40XT-11Dを3,000rpmで45秒間スピンコートします。ウェーハ裏面のフォトレジストをアセトンで洗浄します。ウェーハを115°Cで3分間焼きます。
9. ハイデルベルグMLA150ダイレクトライターを使用して、フォトレジストパターンを375 nm、800 mJ/cm²の線量で露光します。露光後のベーキングを110°Cで2分間行います。
10. AZ 300MIF現像液でパターンを3分間現像します。ウェーハをDI水で60秒間すすぎ、次に_N2 空気で乾燥させます。
11. チャンバー圧力 10 mT の誘導結合プラズマフッ化物エッチャーで、600 W の誘導結合プラズマと 60 W の無線周波数で、SF₆/CHF₃ (20 sccm:50 sccm) RIE プロセスを使用して 20 分間、カバーされていない PI をエッチングします。
12. AZ NMPを使用してフォトレジストを80°C浴中で10分間ストリッピングし、アセトンで3分間マイルドな超音波処理を行い、続いてIPAで3分間洗浄し、圧縮窒素を使用して乾燥させます。
    注意: デバイスの脱落を避けるために、低電力の超音波処理を使用してください。PIが剥離の兆候を示している場合は、超音波処理を避けてください。
13. ウェーハをヘキサメチルジシラザン(HMDS)オーブンで処理し、HMDS処理を施します。SU-8 2002 を 2,000 rpm で 45 秒間スピンコートします。これにより、SU8の厚さは約2.5μmになります。
14. ウェーハを95°Cで20分間焼きます。ハイデルベルグMLA150ダイレクトライターを使用して、フォトレジストパターンを375nm、950mJ/^cm2の線量で露光します。
15. SU-8 Developerでパターンを1分間展開します。IPAとDI水ですすぎ、_N2 ガスで乾燥させます。IPAリンス中にウェーハに白い汚れが現れた場合は、白い汚れが消えるまでウェーハをSU8現像液に浸します。
16. 160°Cで一晩ハードベークします。急性実験には、より短いベイク時間 (~30 分) を使用します。150°C未満または200°Cを超えて焼かないでください。 フレキシブルPI支持のフレキシブルMEAを基板から剥がします。

3. ナノポーラスカーボンの作製(図1D、 図2C、 図5)

1. 設計ソフトウェアでカーボンフィルムパターンを設計します(図5)。
   注:この方法には、ナノポーラスカーボンベースの刺激電極と検出電極の2種類の電極の製造プロトコルが含まれています。
2. 濾紙をホウ酸ナトリウム(0.15 M、pH 9.4)の水溶液に1時間含浸させた後、60°Cで一晩乾燥させます(図1D)。
   注:グレード1のWhatman濾紙は、主に代表的な繊維ベースの多孔質基材として機能しました。ホウ酸ナトリウムは、含浸および乾燥プロセス後にセルロース繊維に組み込まれます。塩は、レーザー合成²⁷の下で光化学的炭化を促進する触媒として作用する。
3. 事前に設計されたパターンを持つ_CO2 レーザーを使用してレーザー合成を行います(図5A)。最適化されたパラメータを使用してラスターモードでパターニングを実行します:電力= 1.8 W;速度 = 1.6 cm/s;ポイント/インチ = 1000。
4. 厚さ50μmのポリエチレンテレフタレート(PET)フィルムを調製し、アセトンとイソプロピルアルコール(IPA)でそれぞれ3分間超音波浴で洗浄します。
5. 電子ビーム蒸発器を使用して、5 nmのチタンと100 nmの金を堆積させます。水相転写手順を適用して、MEAをPETフィルム(12.5μm)に転写します。
   (注)水相移動は、水相分離と毛細管移動の2つの連続したプロセスを用いて行いました。
6. 紙基材をDI水に徐々に沈め、水相分離時に層間剥離します。
   注:セルロースの膨潤によって誘発されるひずみエネルギーにより、炭素膜が支持基板から1秒未満で分離し、水面に浮遊するようになりました。
7. 支持基板、例えばPETフィルムを使用して、毛細管転写中に水媒体中のパターンを転写します。基板を水に浸し、目的の炭素膜の一端に接触させて接触線(転写面)を形成します。次に、基板を手で持ち、ゆっくりと傾いた方向または垂直方向に移動します。
   注:疎水性支持基材の場合、外力またはO₂ プラズマ処理を適用して、コンタクトラインの形成を支援することができます。
8. 移し替え後、約20 μLのパーフルオロスルホン酸(PFSA)ポリマー溶液(低級脂肪族アルコールと水の混合物に~5%の濃度)をカーボンパターンに塗布し、室温(23°C)および圧力(1気圧)の条件下で乾燥させて固定します。
9. ナノ多孔質炭素系刺激電極を導電性銀接着剤を用いてCuワイヤに接続し、固定します。Cuワイヤと電極との間の露出した接合部をシリコーン接着剤でカプセル化して、絶縁性と安定性を確保します。室温で3時間硬化させた後、刺激電極を使用する準備が整います。ここで実験を一時停止できます。
10. AutoCAD でカーボン パターンと MEA パターンを設計します(図 5B)。ステップ2で説明した標準的なフォトリソグラフィー手順を使用して、25μmのPIフィルム上に4 x 4の微小電極アレイを作製します。
    注:PI膜は、PI前駆体を介して、またはAZ2020フォトレジストを使用してSiウェーハ上に市販のPI膜をラミネートすることによって作成できます。フォトリソグラフィーと金属蒸着のプロトコルは、ステップ2と同じです。
11. ステップ3.1〜3.3のように、塩を含浸させてレーザー描画した後、紙基板上にモノリシックカーボン膜(2 cm x 2 cm)を作成します。ステップ3.6〜3.9のように、標準的な水相転写法を使用して、カーボンパターンを事前に設計されたPETサポートフィルムに転写します。
12. ヘキサン中の10重量%ポリエチレン-co-酢酸ビニル(EVA)溶液をカーボンパターンに塗布し、室温(23°C)および圧力(1気圧)の条件下で乾燥を待ちます。厚さ10 μmのPETテンプレート(下側にEVAコーティングを施したもの)を設計し、レーザーカットし、MEAパターンに16個の穴をあけてカプセル化層として機能します。
13. MEA、PETカプセル化層、およびカーボンメンブレンをPETサポートに位置合わせします。市販のホットラミネーターを使用して、120°Cの処理温度でアセンブリをプレスし、転写とカプセル化を行います。
14. ナノポーラスカーボン対応センシング電極を室温まで冷却し、残留物を取り除き、エタノールと水で3回すすいでから使用してください。

4. ラットの心臓の分離、灌流、およびモニタリング(図6)

1. 心臓を抜く前にラットを準備します(図6A)。このプロトコルは、チャールズリバーから入手した生後3〜4か月の雄のCD / SDラットを使用しました。
2. 表1に従って化学物質を溶解することにより、N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N'-2-エタンスルホン酸(HEPES)チロード溶液を調製します。pHを2M NaOHで7.2-7.4に調整します。酸素ガスを0.5〜1時間泡立てて酸素化し、実験終了まで酸素化を続けます。
3. ハンクスのバランス塩溶液(HBSS、カルシウム、マグネシウムなし)のチューブを3本氷の上に置きます。清潔な手術器具(鋭利なはさみ、曲がったはさみ、止血剤2本、鋭利なピンセット、小さなピンセット2組)を準備します。
   注:手術は生存を目的としたものではないため、不妊症は必要ありません。
4. 体重400〜500gの成体のCD/SD雄ラットを動物施設から引き取ります。0.5 mLのヘパリン(1000 IU / kg)を下腹部に腹腔内投与します。.厚い手袋を使用して、保護のためにネズミを保持します。
5. 腹部が露出するように、ネズミの背中の上部をつかみます。ラットをしっかりと保持しますが、動物を傷つけないように過度の力を加えないでください。ヘパリン溶液を迅速かつ正確に注入します。20〜30分待ちますその間にランゲンドルフ装置を準備します。
   注:ラットは、適切な外科的処置の準備ステップを確保するために、事前に麻酔をかけることができます。
6. HEPES Tyrode's Solutionを補充する前に、静脈内療法(IV)バッグを水で洗い、完全に乾燥させて、適切な最終的な組成を確保します。.事前に酸素化されたHEPESチロード溶液をバッグに入れます。
7. ランゲンドルフ装置のサーモスタットと水循環を37°Cでオンにします(図6A)。カニューレ、縫合糸を準備し、組織切片のためにペトリ皿をコールドパックに置きます。切片化する前に、カニューレを氷冷HBSSでプライミングします。
8. ラット開胸術を実施する準備をします(図6B)。ベルジャー構成のイソフルランで動物を麻酔します。ガーゼパッドで満たされた50mLのチューブに8〜10mLのイソフルランを入れます。.開いたチューブ(イソフルラン入り)で動物を容器に入れます。
9. つま先のつま先つまみ反射をテストして、麻酔の進行状況を観察します。動物は麻酔下に置かれ、2〜3分以内に意識を失います。ラットの状態を注意深く観察し、意識を失った直後に手術用ボードに移します。長時間の麻酔はラットの死につながる可能性があります。
10. 動物を操作ボードに移します。背中につけて、ガーゼパッドで満たされた50mLのチューブに5mLのイソフルランをラットの口の上に置きます。片方の足をつまんで全身麻酔を確認します。応答がなかった場合にのみ続行します。
11. 上腕と下腕を針で手術用ボードに固定します。胸のすぐ下にあるラットの胸郭を開くために切開(~5cm)を行います。横隔膜を慎重に切り込み、心臓と肺を露出させます。
12. 両側のリブを切開して胸郭を完全に開き、完全なアクセスを提供します。止血器を使用して胸骨の胸郭を固定します。止血器を使用して心臓の下から大静脈を保持します。胸郭の底にできるだけ近いところで曲がった鈍いハサミで止血剤の下を切り取って心臓を取り出します。
13. 心臓を氷のように冷たいHBSSに移します。収縮する心臓への酸素供給が長時間中断されるのを防ぐために、ステップの持続時間を最小限に抑えます。
14. ランゲンドルフの灌流とモニタリングを行う準備をします。カニューレとペトリ皿に氷のように冷たいHBSSを完全に満たします。システムに気泡が存在しないことを確認します。
15. 心をHBSSで予め充填されたペトリ皿に移し、切片化します。ピンセットとはさみを使用して、肺やその他の結合組織を取り除きます(図6C)。
    注:鈍的解剖は、心臓への潜在的な損傷を防ぐために、切片化手順に推奨されます。隣接する組織の切片化には、2つのはさみを使用して、組織を慎重に引き裂きます。
16. 心臓を圧迫し、大動脈が出る血液の経路をたどって、大動脈の位置を特定します。最初の上行動脈の下を切断し、抜歯中に大動脈弓が保存されている場合は大動脈をカニューレ状にします(図6D)。大動脈をカニューレに二重結び目で固定します。
    注意: バルブが閉じたままになるように、カニューレを深く挿入しすぎないでください。縫合糸を低くしすぎると、冠状動脈が閉塞する可能性があるため、配置しないでください。
17. ランゲンドルフ装置を事前に酸素化された作業溶液でプライミングします。バッファフローを開き、カニューレを装置に取り付けます(図6E)。気泡が発生していないことを確認します。このステップで心臓が収縮し始めます。
    注:最初は、一部のバッファーが心室から飛散する可能性がありますが、過度の漏れは予想されません。必要に応じて縫合糸を調整し、バッファーの漏れを防ぎます。手術と準備が適切に行われていれば、このステップで心筋細動は観察されません。
18. 心房を切り取ります。バルーンを左心室に挿入する前にバルーンを収縮させ、接続された注射器を使用して水で満たします。
19. BP-100プローブを灌流ラインと水充填バルーンに接続して、灌流と左心室圧(LVP)をそれぞれ監視します(図6F)。
    注意: BP-100プローブは、使用前にキャリブレーションが必要です。バルーン内の気泡は、正確な圧力感知を確保するために排出する必要があります。
20. HEPES Tyrodeの緩衝圧とLVPのベースラインを監視します。バッファー圧力が80〜100 mmHgの最適範囲内に維持されていることを確認してください。バルーンに注入される水量を変更して、ベースラインLVPを約20mmHgに調整します(図6F)。
21. ECG電極を接続します。カニューレを接地し、好みに基づいて電極を側面、上部、または頂点に配置します(図6F)。
22. IA-400Dアンプを使用してすべての信号(灌流、左心室圧、およびECG)を増幅し、Clampexソフトウェアを備えたデジタイザを使用してコンピュータとインターフェースします(図6F)。

5. IRプロセスを用いた心筋梗塞の作製(図6G、 図7)

1. 加熱チャンバーに、あらかじめ加温した37°CのHEPES Tyrodeバッファーを充填します。心臓を加熱されたチャンバー内のバッファーに沈め、ストップコックを調整してバッファーの流れを止め、全体的な虚血を誘発します。実験の特定の目標に基づいて虚血の期間を調整します。
2. 活栓を回して、虚血の30分後に心臓への緩衝液の流れを回復させ、再灌流を開始します。梗塞のサイズを評価するための染色のための実験を終了する前に、心臓の再灌流を45分間待ちます(図6G)。
   注:虚血または再灌流時間は、実験目的に基づいて決定されます。
3. 心拍数の低下と不規則なECGパターンを観察することにより、虚血誘発の成功を確認します(図7A)。不整脈または心室細動が観察されます。
4. 10mLの4°CHBSSをストップコックのサイドポートからゆっくりと投与し、心臓を停止させます。灌流カラムから心臓を取り出し、残っている心房組織を切り取り、心臓を組織スライスマトリックスに入れます。
5. マトリックスを透明フィルムで覆い、心臓を-80°Cで約8分間、またはマシュマロのような粘稠度に達するまで凍結します。冷凍庫からティッシュスライスマトリックスを取り出し、カミソリの刃を挿入して心臓を2mmの厚さにスライスします。
6. スライスマトリックスから組織スライスを1つずつ取り出し、生化学実験に必要になるまで-80°Cで保存します。
7. 梗塞染色を行います(図7B)。ハートスライスを1% w/v トリフェニルテトラゾリウムクロリド(TTC)10 mLで37°C、30分間インキュベートします。
8. ティッシュスライスを10%緩衝ホルマリンに移し、室温で一晩固定します。最良の結果を得るには、ホルマリンから心臓を取り出し、24時間以内に組織を画像化します。このステップでは、汚れの劣化を防ぐために、光への露出を最小限に抑えてください。
9. 染色したスライスを撮影し、ImageJなどのソフトウェアを使用して梗塞のサイズを推定します。

6. デバイスと心臓組織との間の双方向光電気インターフェースの確立(図8、 図9)

1. シリコン光電子膜を刺激のために目的の場所に置きます。シリコン膜は、毛細管現象の力で心外膜に自己付着します(図8A)。付着が難しい場合は、ウェットティッシュ接着剤を使用して接着を助けます。
   注:灌流率を下げると、心臓表面の水分量が減少し、取り付けが容易になります。心臓の表面に付着すると、シリコン膜は通常、手術中に所定の位置に付着します。
2. 電極をRHDシステムまたはその他の電気生理学的プラットフォームに接続して、データ記録を行います。MEAは、一端が0.5mmピッチの16チャンネルI/Oパッドを備えており、ゼロ挿入力(ZIF)コネクタを介してアダプタボードに接続されています。その後、アダプターボードはOmneticsコネクタを介してヘッドステージにリンクされます。
3. 柔軟なMEAを単離されたラット心臓の心室表面に配置します(図8A)。窓の形をしたシリコン膜を使用している場合は、MEAを窓の内に配置します(図8B)。
4. トランジスタ-トランジスタロジック(TTL)信号を使用して、635nmレーザー光源を目的の周波数(例:4 Hz)とデューティサイクル(例:0.4%、1 msパルス幅)でプログラムします。レーザースポットをシリコン膜に集束させ、スポットサイズは約1mmにします。保護レーザー安全ゴーグルを着用してください。ピントを合わせるために、低強度から始めます。
5. 記録および刺激プロトコルを開始します。レーザー強度を徐々に上げて、中断のないオーバーライドペーシングが観察されるようにします(図8C)。
   注:このプロトコルの規格では、レーザーが10秒間の中断のないペーシングを可能にするしきい値強度を定義しています。
6. 異なるパルス幅でレーザープロファイルをプログラムして、強度と持続時間プロファイルを取得し、デバイス性能をベンチマークします(図8D)。このセットアップにより、ECG、TTL、およびLVPのマルチチャンネル記録が可能になります(図8E)。
7. シリコンメンブレンまたはライトスポットの位置を変更し、手順6.3〜6.6を繰り返して、さまざまなペーシング位置がペーシング波形と心臓伝導にどのように影響するかを調べます(図9A)。
8. 各記録サイトからペーシングされたQRSピークを特定し、等時線または活性化遅延マップを構築します。最も早いQRSピークを特定し、その位置をゼロ遅延として設定して、活性化遅延マップをプロットします(図9B-C)。
   注:洞調律(ペーシングなし)の活性化遅延マップは参照として役立ちますが、そのパターンは心臓の状態とMEAの配置によって大きく異なる場合があります^18,30。結果は、外部ペーシングなどの明確な刺激源が存在する場合に、より意味があります。

7. デバイスと心臓組織との間の双方向の電気的インターフェースの確立(図10)

1. 刺激電極(0.5cm x 0.5cm)を2電極構成で接続し、作用電極を左心室壁に配置し、対電極を右心室壁に配置します。
2. 矩形電流波形(1mA、1msのパルス幅など)をポテンショスタットを介して、ペーシングが成功するまで供給します(図10A-B)。テストを実行して、刺激電流対パルス持続時間および刺激電圧対パルス持続時間のプロットを取得し、材料刺激の有効性を評価します(図10C-D)。
3. 4 x 4微小電極アレイ(電極間2 mm間隔)を使用して電気記録を実行し、RHD USBインターフェースボードとRHD 16チャネル入力記録ヘッドステージを使用して記録します。0.1〜100Hzの帯域幅で10kS/sで信号を録音します。
4. 各記録電極のノイズを測定します(図10E)。次式を使用して SNR を計算します (図 10F)。
   又は
   ここで、Signalは信号の振幅、std_noise はノイズレベルの標準偏差です。録音では、生の結果を反映するために 60 Hz のノッチ フィルターがオフになっています。
5. Pythonを使用して、電気伝搬の追加の解析と等時性マップのプロットを実行します。
6. 各収縮のピークたわみ (ペーシング QRS コンプレックス) のタイムスタンプを決定し、複数の信号の平均を計算します。マップのレンダリングにガウス補間を使用して、読みやすさを向上させます。

結果

さまざまな光電子材料および電子材料の刺激電気生理学は、 ex vivo 心臓システムを使用して効率的に検証でき、便利で制御されたセットアップを提供します(図1A)。多孔質シリコンや多孔質炭素などの高電荷注入材料は、低光強度と低電圧刺激による生体電気変調を容易にし、安全性と電荷バランスの取れた容量性動作を確保します。

ナノポーラスシリコンは、そのポロシティ対応ヘテロ接合²⁰、強化された電荷蓄積容量、インピーダンスの低減、および光吸収の改善により、pnまたはp-i-n接合(図11A)などの従来のシリコン構造と比較して、大幅に高い光電流発生を示します。これらの主に容量性光電流は、バイオセーフで電荷バランスのとれた刺激³¹(図12A-B)を可能にし、光強度0.51mW/mm²、パルス持続時間1ms(図8C)、またはパルス持続時間10ms(図11B)で0.167mW/mm²の光強度で240bpmでのex vivoラット心臓の光ペーシングを達成する(図11B)--光遺伝学的方法と同等またはそれ以下の値で、レーザー安全閾値をはるかに下回る^31、32.これらの強度を下回ると、光パルスの部分的または非捕捉が発生する可能性があります。対照的に、p-i-nシリコン膜や金で装飾されたp-i-nシリコン膜などの他の材料は、ペーシングを引き出すために大幅に高い光学強度を必要とします(図11B)。ナノポーラスシリコンによる連続的なペーシングは、LVPの上昇で示されるように、機械的収縮を増加させます(図8E)。さらに、そのモノリシックな形態では、このデバイスは、局所的な光パルス下での高空間分解能の光電流注入を実証し、マルチサイトおよび潜在的なランダムアクセス刺激研究を可能にする²⁶。

双方向の窓形状シリコン膜研究(図3D、 図8B)では、マルチサイト刺激により、異なる多電極記録プロファイルと心臓伝導パターンが生成され、各刺激ポイントからの波動伝播の独創性が検証されます(図9)。この特徴は、複雑な心臓伝導経路を高精度に解析するシステムの能力と、心筋梗塞などの異常な心臓状態を診断する能力を浮き彫りにしています。

作製されたMEAは、約10μmの厚さで、マクロ多孔質構造または蛇行性相互接続を組み込んで、曲げ剛性を最小限に抑え、柔軟性または伸縮性を向上させます(図4)^33,34。アレイは、6 mm x 6 mmの領域をカバーする4 x 4構成に配置された16の独立した記録サイトで構成されています。これらのアレイは、心臓表面の複数の部位で直接心外膜信号を記録することができます。代表的な16チャンネルの録音を図13に示します。記録から構築されたアイソクロネマップは、局所的な刺激の有無にかかわらず、心臓表面全体の電気伝導を視覚化します。局所的な刺激は、多くの場合、ex vivo心臓の内因性洞リズムと伝導経路を無効にする伝導の遅延を誘発します(図9B)。

ナノ構造カーボン材料は、その高い電荷貯蔵容量と低インピーダンスにより、バイオエレクトロニクスデバイスの性能を向上させる効果的なソリューションを提供します(図14)。当社の塩アシストレーザー転写法は、ナノポーラスカーボンデバイスをフレキシブル基板や従来の金電極上に容易にパターニングし、瞬時に転写することで、バイオエレクトロニクスの性能を向上させることができます。インピーダンスの特性評価により、カーボンコーティングにより、ECG信号に関連する100Hzの周波数で、Au電極のインピーダンスが7244.4 Ωから63.1 Ωに約2桁大幅に減少したことが確認されました(図14A-B)。Au電極のヘルムホルツ容量は、カーボンコーティング後に0.025mF/cm²から1.98mF/cm²に大幅に増加しました(図14C)。このマイクロキャパシタコーティング戦略を使用して静電容量を増加させることで、従来のAu電極と比較して分極電圧を効果的に下げることができます(図14D)。

このプロトコルは、心臓系の電気的調節またはセンシングに向けた効果的な生体インターフェースのためのナノ多孔性炭素ベースのプラットフォームを確立します(図10)。心臓刺激のためのナノポーラスカーボンエレクトロニクスの性能を評価するために、AuまたはAu−C電極を左心室(LV)壁に配置し、二相性方形電流波形³⁵(図10A)で電荷注入を行った。4Hzの刺激(1mA)により、Au電極とAu-C電極の両方が効果的なオーバードライブペーシングを達成しました(図10B)。しかし、収縮強度を示す著しく高いECG振幅がAu-Cグループで観察されました。両方の電極は、パルス持続時間による刺激の閾値電流の指数関数的な減少を示しました。また、有効な周波数変調のための最低電圧を示す刺激閾値も、さまざまなパルス幅で測定されました(図10C-D)。強度-持続時間の曲線は、次の式を使用してモデル化されました。

ここで、I(t)はパルス幅(t)での刺激電流を指し、I_{レオベース}は無限に長いパルス持続時間(レオベース)でのしきい値電流、τは膜時定数³⁶です。この計算では、クロナクシーでの刺激を成功させるために必要な最小電荷を利用します。Q_分値は、Au電極とAu-C電極でそれぞれ0.79μCと0.71μCと決定されました(図10C)。4mA/cm²の刺激電流では、Au電極とAu-C電極でそれぞれ1.32Vと0.90Vで効果的な刺激のしきい値電圧が観察されました(図10D)。閾値電圧の30.3%の減少は、長時間の刺激³¹の間に酸化ストレスが潜在的に減少することを示唆しており、したがって、組織の損傷を最小限に抑えたより安全なバイオエレクトロニクスアプリケーションを容易にする。さらに、心外膜ECG信号検出を強化するために、カーボングラフト16チャネルAu電極を開発しました(図10E-F)。ナノ構造の炭素移動は、従来のAu電極と比較して、S/N比を8.0倍も大幅に改善し、ナノポーラスカーボンベースのコーティングが高忠実度のバイオエレクトロニクスに有効であることを示しました。

I/R梗塞モデルの誘導が成功したかどうかは、実験中に現場で検証されたか、実験後に生理学的シグナルモニタリングまたはTTC染色を通じてそれぞれ検証されました。スライスして染色した後、梗塞した心臓は、心筋の損傷を表し、梗塞のサイズに対応する白色の領域を示します(図7B)。対照的に、健康な心臓は染色後に白い領域を欠くことになります。リアルタイムのモニタリング中、虚血モデルが成功すると、心拍数が大幅に減少し、LVPおよびECGの測定値で明らかになります。さらに、虚血性心臓のMEAマッピングは、心外膜を横切る電気伝導速度の低下を明らかにし、遅延時間³⁷ (図7A)を増加させます。

図1:プロトコールと製造ワークフローの概略図。 (A) ex vivo ラットの心臓のセットアップとデバイスのインターフェースの概略図。(B)多孔質シリコン膜の作製プロセス(ステップ1)。多孔質Si膜の作製は、SOIウェーハから始まり、フォトリソグラフィーによってフォトレジスト層をパターニングし、六角形の特徴を定義します。RIEは、露出したシリコンを選択的に除去し、続いてバッファードHFでリフトオフプロセスを行い、Si膜を放出します。メンブレンはHFベースの溶液中でステインエッチングを受け、ナノポーラスSi構造を生成します。得られた多孔質Si膜は、慎重に剥離され、機械的に支持するためにPDMS基板上に移されます。最後に、プラズマ処理は、光電流を強化するための表面特性を変更します。(C)フレキシブルマクロポーラス多電極アレイの作製プロセス(ステップ2)。フレキシブルMEAの製造は、シリコンウェーハ上にPIコーティングを施してフレキシブル基板層として機能することから始まります。フォトパターニングは、AZ 2020フォトレジストを使用して電極領域を定義します。金属蒸着(Au/Ti)は、電子ビーム蒸着によって導電性トレースを作成し、続いてAZ 40XT-11Dを使用して選択した領域をRIEから保護し、マクロ多孔質基板を形成するための別のフォトパターニングステップを行います。SU-8フォトパターニングとハードベークステップにより、最終的なリフトオフプロセスでSiウェーハからフレキシブルMEAが放出される前に、カプセル化が追加されます。(D)炭素膜のパターニングと転写のワークフロー(ステップ3)、塩含浸による繊維加工、レーザー合成による微細加工、および紙基板から他の支持体への水支援パターン転写を含む。 図1D は²⁷から修正されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:製造時のデバイスの光学画像とSEM画像。 (A)ナノポーラスSiの断面SEM(上)と光学顕微鏡像(下) (B)中空(上)と蛇行(下)のマクロポーラス多電極アレイの光学像。(C)炭化基板の断面光学顕微鏡画像(上)と写真(下)。 図2A は²⁶から修正されている。 図2C は²⁷から修正されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:Si膜デバイスのCAD設計。 この図は、(A)小型、(B)中型、(C)大型、および(D)オープンウィンドウ型シリコン膜デバイスのパラメータを詳しく説明しています。単位:mm。この数値は²⁶から修正されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:マクロポーラスMEAのCAD設計。 (A)中空形状のMEAの設計図と注釈。(B)蛇行したMEAの設計図と注釈。単位:mm. 図4A は²⁶から修正されています。 図4B は²⁸から修正されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:心臓インターフェース用のカーボンベースの電極アレイの回路図と設計。 (A)刺激電極界面の設計(ステップ3)。典型的な刺激では、刺激電極は2電極構成で接続されていました。作用電極(蛇行ナノ多孔質カーボンパターン)を左心室壁に配置し、対電極を右心室壁に配置して地面に接続しました。方形電流波形はポテンショスタットを介して供給されました。(B)カーボン電極のマスキングと転写のための16チャンネルMEA(ステップ3)。レイヤー1は、PI基板上の16チャネルMEAのAuパターンを示します。レイヤー2はPETカプセル化フィルムを示します。この数値は²⁷から修正されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図6: ex vivo のセットアップと実験プロセスの概略図と写真による描写。 (A)コニカルフラスコ容器、手術器具、灌流システム、温度制御システム(ステップ4)など、 ex vivo セットアップに使用される装置およびツール。(B)ラットの心臓抽出プロセス:イソフルランで動物を麻酔します。ネズミの腕を固定します。ラットの胸郭を開きます。ネズミの心臓を収穫します。(C)抽出した心臓から周囲の脂肪組織を除去して、実験セットアップの準備をします。(D)抽出した心臓の ex vivo 灌流システムへの取り付け。(E)生理学的状態をシミュレートするためにシステムに接続された心臓を示す灌流セットアップ。(F)心臓の心電図記録のセットアップ。(G)虚血再灌流(I / R)プロセスは、セットアップ(ステップ5)を通じて実証されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図7:健康な孤立した心臓とI / R心臓の比較。 (A)LVP、ECG、およびECG伝播遅延は、偽の健康な心臓、および虚血/再灌流(I / R)心臓から記録されました。(B)トリフェニルテトラゾリウムクロリド(TTC)染色された健康な心臓とI / R心臓の切片の代表的な写真。白い部分が梗塞領域の大きさを示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図8:多孔質シリコン膜とフレキシブルMEAを用いたex vivoラット心臓の双方向光電子ペーシングと電気記録 (A)シリコン膜の付着と、心臓のシリコン膜の隣に蛇行した形状のMEAの配置を示す写真。(B)Si窓内にはめ込まれた開放窓形状のシリコン膜と中空形状のMEAの取り付けを示す写真。(C)ex vivoラット心臓の光学ペーシングは、240bpm、および1msのパルス持続時間で3つの異なる強度で非捕捉、部分捕捉、および完全捕捉を示します。(D)デバイスのペーシングしきい値を評価するための強度と持続時間のプロット。(E)0.24 mW / mm²強度および10ミリ秒のパルス持続時間未満の光ペーシングプロファイル。図8B-Dは²⁶から修正されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図 9: 双方向インターフェイスでのマルチサイト ペーシングとマッピング。 (A)ペーシングサイトとレコーディングサイトの位置。(B)アイソクロンマップは、オープンウィンドウ構造のモノリシックSiデバイス上の8つの異なる場所の光刺激後の電気信号活性化遅延を示しています。(C)異なるペーシング位置での模範的な制御およびペーシングされた16チャネルECGトレース。さまざまな場所を刺激することにより、空間活性化は、異なる記録部位の組織で検出されるQRS進化の時間的遅延を誘発しました。これらは活性化遅延マップとして描くことができ、心臓表面の伝導経路を調べることができます。この数値は²⁶から修正されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図 10.心臓の刺激と記録のためのナノポーラス炭素ベースのバイオエレクトロニクス。(A)多孔質炭素膜グラフトAu(Au-C)電極の心臓刺激用光学像。挿入図は、金電極上の蛇行構造マイクロキャパシタの拡大図を示しています。(B)4Hzの周波数での二相性矩形電流波形刺激に対する単離ラット心臓のECG応答。同じ電流密度4.0mA/cm²では、Au電極とAu-C電極の刺激により、心臓の心電図反応が異なりました。(C)AuおよびAu-C刺激電極の持続時間-強度曲線およびそれらの曲線フィッティングは、4Hzの刺激周波数で存在する。(E)Au電極およびAu-C電極デバイスで記録されたECG信号のベースライン曲線。(F)信号対雑音比(S / N)は、記録されたECG曲線から計算されます。挿入図は、ECG記録に用いるAuとAu-C電極アレイの光学像を示しています(電極サイズ:1mm、ステップ7.5)。この数値は²⁷から修正されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図11:さまざまなSiデバイスの光電流比較とペーシング閾値評価。 (A)4つのSiベースのデバイス間の光電流の大きさの比較。青色のトレースは、N = 8個の独立したデバイスからの平均光電流を表し、重ね合わせた灰色のトレースは、個々のデバイスの測定値を示しています。添付の棒グラフは、光電流のピーク値(青色)と積分電荷注入(オレンジ色)を示しています。棒グラフは平均±s.d.で表されます。スケールバー、10ミリ秒 (B) Ex vivo 心臓ペーシングは、3つの異なるデバイスを使用して実行されました。ペーシングは、240 b.p.m.の速度と10 msのパルス幅で実施されました。この数値は²⁶から修正されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図12:注入された電荷と戻された電荷を統合することによる電荷バランスの特性評価(A)特性光電流トレースの充放電プロセスの図。(B) チャージ注入およびチャージ返却に関連する合計チャージの計算。その結果、異なる刺激時間の下で全体的に良好な電荷バランスが示されました。この数値は²⁶から修正されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図13:16チャンネルMEAの各電極によって収集された代表的な電気信号。 16チャンネル(Ch)の電気信号は、ex vivoで鼓動している心臓の心電図(ECG)情報を示しています。^{フィギュアは28}から変更されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図 14.ナノポーラスカーボンベースのバイオエレクトロニクスの電気化学的特性。 (A)興奮性組織とパターン化されたカーボン界面との間の電気化学的界面。(B)Aに示されている回路に従った近似曲線を持つAuおよびAu-C電極のインピーダンスおよび位相スペクトル(C)同じ形状のAuおよびCパターンのCV測定、-0.2〜0.4Vの電圧範囲で、標準のAg/AgCl電極と比較。(D)二相性ガルバノスタティック刺激サイクル中のAuおよびAu-C電極の電圧変化。この数値は²⁷から修正されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

化合物	おすすめの品種	コンク [mM]	MWの	1リットルあたり	2リットルあたり
NaClの	シグマ(S9625)	126	58.4	7.36	14.7
KClの	シグマ(P4504)	5.4	74.6	0.4	0.8
グルコース	シグマ(G7021)	10	180	1.8	3.6
ヘープス	シグマ (H4034)	10	238	2.383	4.766
MgCl2.7H2O	シグマ(M9272)	1	203	1 mLの	2ミリリットル
				在庫 1 M	在庫 1 M
CaCl2。2時間2分	シグマ(C3881)	2	147	1 mLの	2ミリリットル
				在庫 2 M	在庫 2 M
NaH2PO4	シグマ(S0751)	0.39	120	1 mLの	2ミリリットル
				ストック 0.39 M	ストック 0.39 M

表1:HEPES Tyrodeの溶液成分。

ディスカッション

このプロトコルは、ex vivoラット心臓プラットフォーム(図1A)とI / Rモデルを導入し、バイオエレクトロニクス³⁸の急成長する研究努力と需要に伴う迅速で便利な臓器レベルの電気生理学研究を提供しました。この研究では、ナノポーラスシリコン、フレキシブル多電極アレイ、ナノポーラスカーボン(図1B-D)の3つのデバイスシステム(図1B-D)の作製と検証を、双方向の電気生理学的調査のベンチマークとして詳しく説明しました。ナノポーラスシリコンは、低強度、容量性、および高時空間ペーシングを可能にし、柔軟な多電極アレイは、心外膜活動のマルチチャネル記録とマッピングを可能にし、ナノポーラスカーボンは、^MEAs27と組み合わせると、低電圧刺激と高SNR記録につながります。

光ペーシングは、標的組織³³において光感受性イオンチャネルを発現するために遺伝子改変を必要とする方法である光遺伝学を用いて以前に実証されている。オプトジェネティクスは効果的ですが、ウイルスベクターやトランスジェニックアプローチの必要性により非常に複雑になり、特に臨床応用において、安全性、倫理的、規制上の懸念が生じます。対照的に、半導体ベースの非遺伝的生体刺激は、より単純で翻訳的に実行可能な代替手段^{を提供します}39,40,40,42。シリコンやその他の有機半導体などの材料は、遺伝子を改変することなく組織を直接光電子的に調節することを可能にし、容量性光電流を活用してバイオセーフで電荷バランスの取れた刺激を実現します。このアプローチは、ペーシング強度の点でオプトジェネティクスと同等またはそれ以上の性能を達成し、レーザーの安全閾値をはるかに下回って動作し、組織の損傷を最小限に抑えます^31,32(図8)。半導体ベースの生体刺激の非遺伝的性質は、遺伝子組み換えに関連する障壁を排除し、臨床現場でのより広範な採用と、組織工学および生体電子医学における多様なアプリケーションへの道を開きます。ただし、デバイスは組織と統合するように慎重に設計する必要があり、生体適合性を慎重に考慮する必要があり、効率的な刺激と記録のためのインターフェースの場所も考慮する必要があります(図8A-B)。さらに、組織表面上の材料の存在は、デバイスが特定のイメージング剤の励起放出ウィンドウに対して透明になるように設計できない限り、リアルタイムイメージングの可能性を妨げる可能性があります。

ナノポーラスシリコンは、以前に報告された材料²⁶とは異なり、人工的なリターン電極を必要としないため、半導体光刺激装置の中で際立っています。このユニークな特性は、光スポットのサイズと位置に基づいて空間的に分解された陰極および陽極領域を形成する能力から生じます。照らされた表面は陰極注入部位として機能し、周囲の周辺領域は陽極電流の戻りを促進します。このメカニズムにより、モノリシックなピクセルレスメンブレンでのマルチサイト刺激が可能になり、正確で局所的な刺激が可能になります。特に、グローバル照明ではなく局所的な光刺激は、効率的なバイポーラ刺激プロファイルを作成するために重要です。さらに、デバイスのサイズはパフォーマンスに大きく影響します。より大きなデバイスは、同じ刺激条件下でより高い電流を生成し、その機能の多様性をさらに高めます。

光ペーシングの失敗は、健康な生物学的モデルであっても、主にデバイスの完全性と生体インターフェースの結合に関連するさまざまな要因から生じる可能性があります。まず、心臓に刺激を与える前に、徹底的な光電流特性評価が重要です。予想よりも低い光電流は、長期保存後の材料の劣化⁴³ 酸化物の不動態化、染色エッチングプロセス中の過剰エッチング、取り扱いまたは転写中のデバイス破損、またはインターフェース中のデバイス向きの誤りから生じる可能性がある。機械的損傷を軽減するために、PDMSはナノ多孔質シリコン膜を収容するための軟質基板として使用され、ピンセットによる直接の取り扱いによる潜在的な損傷に対する保護を提供しました。第二に、このセットアップで生体液が灌流される心外膜とのシームレスなインターフェースを確立することが不可欠です。生体液層が厚いと、適切な接着が妨げられ、ペーシング効果が損なわれる可能性があります。生体界面結合を強化するために、生体接着剤^42、43 または縫合剤を使用して、接続を安定させ、信頼性の高い刺激を確保することができる。特に、私たちの研究で使用されたナノポーラスシリコンは生分解性であり、一時的なペーシングアプリケーションをサポートしますが、生理学的条件下では1〜2日以内に性能が低下します。長期的な安定性のためには、表面の不動態化⁴⁴ またはより耐久性のある半導体材料の使用を検討すべきである。

ex vivoペーシング中、より高い周波数(例えば、4Hz)での緩やかなLVP増加(図8E)は、心筋の収縮性、カルシウム蓄積の増強、およびフランク・スターリング機構⁴⁵に起因する可能性が高い。ペーシング速度の上昇は、細胞内カルシウム循環と心室充満ダイナミクスを改善し、予負荷と収縮強度を増加させます⁴⁶。これにより、心筋の酸素要求量と不整脈のリスクが高まる可能性がありますが、これらの影響は、十分な事前酸素化、綿密な心電図モニタリング、および制御されたペーシングパラメーターによって軽減できます。私たちの実験では、有意な悪影響は観察されませんでした。

多電極記録では、心臓上の電極位置とペーシング電極に対するそれらの相対位置を特定することは、有意義な分析のために重要です。電極間のクロストークを排除して、明確な波形と時間的に分解されたパターンを確実にキャプチャすることが不可欠です。柔軟な電極アレイは、通常、心外膜との良好なインターフェースを確立します。しかし、接着性は、薄いヒドロゲル層^28,43のようなイオン伝導性接着剤コーティングを使用して、安定性および信号品質を改善するためにさらに強化することができる。

ナノ構造のグラフェン/カーボン材料は、電荷貯蔵および注入のための大きな表面積を有し、電極-生理食塩水接合部でのインピーダンスを低減し、電荷注入能力を向上させることにより、バイオエレクトロニクスデバイスの性能を向上させることができる³⁵。グラフェン材料をフレキシブル電極(例えば、Au)上にパターニングするための現在の方法には、電着、スピンコーティング、およびスクリーン印刷^{が含まれる47}。しかし、これらの方法は通常、複雑な製造プロセス、限られたパターニング機能、およびバインダーのデッドボリュームによる性能の低下に関連しています。レーザー合成法を利用して、セルロース基板上にナノ構造のカーボンパターンを生成し、それらを他の軟質フィルムに転写して準拠した生体界面を作成し、バイオエレクトロニクス製造の容易で効果的な方法を提供しました。局所的な電場を増加させる単一細胞レベルまでの小さな幾何学的サイズを持つパターン化されたカーボンコーティングと、電極-組織界面での抵抗を減らすためのカーボン膜の高多孔質構造の組み合わせは、将来的に効率的な生物学的刺激と記録を相乗的に達成するでしょう⁴⁸。

ランゲンドルフ のex vivo I/Rモデルは、便利な疾患モデルではありますが、全身的な相互作用を欠いており、神経ホルモン反応や免疫応答から心臓を隔離し、バッファーを用いた人工灌流に依存しているため、酸素供給や内皮機能などの生理学的条件を変化させる可能性があります。その生存率は限られているため、研究は急性イベントに限定されます。それにもかかわらず、このモデルは、正確なパラメータ調整と優れた再現性を備えた高度に制御された環境を提供します。また、リアルタイムの心機能測定も可能であり、虚血性心疾患の新しい治療戦略を探求するための貴重なツールとなっています。例えば、電気化学デバイスは、心臓をプレコンディショニングし、重度の活性酸素種(ROS)環境に耐えるように訓練したり、回復を促進するためにROSレベルを軽減することを想定することができます。このような治療の有効性は、心拍パターン、ECG波形、伝導速度などの指標を通じて評価できます。さらに、マルチサイト刺激プラットフォームは、心筋梗塞に関する空間情報を提供し、患部のより詳細な評価を可能にすることができます。このアプローチは、梗塞の重症度と相関する刺激閾値の改善も示し、治療評価と最適化のための包括的なフレームワークを提供する可能性があります。

このプロトコルでは、3つのデバイスを双方向の ex vivo 心臓モデルで使用することが強調されていますが、その適用性は心臓組織をはるかに超えています。これらのデバイスは、神経組織、骨格筋、消化器系など、正確な電気調節が重要な他の電気的興奮性組織や臓器での使用に容易に適応できるため、バイオエレクトロニクス医学の研究とトランスレーショナルアプリケーションの両方に対応する汎用性の高いツールとなっています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
16チャンネルヘッドステージ	インタンテクノロジーズ	C3334
2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロリド	シグマ・アルドリッチ	T8877-5G	塩化トリフェニルテトラゾリウム
2-プロパノール(IPA)	フィッシャーサイエンティフィック	A451-4
635 nmレーザー、500 mW	レーザーグロー	NA
アセトン	フィッシャーサイエンティフィック	A18-4
オングストローム Evovac 電子ビーム蒸発器	オングストローム	NA
AZ 300MIF開発者	マイクロケミカル	18441123163	ディベロッパー
AZ nlof 2020	マイクロケミカル	1A002020
AZ NMP	マイクロケミカル	NA	フォトレジストリムーバー
AZ40XT-11D	マイクロケミカル	1000300	フォトレジスト
バッファHF	サーモサイエンティフィック	AA44627K2
CaCl2.2H2O	シグマ・アルドリッチ	(C3881)
CO2レーザー	ユニバーサルレーザーシステム	VLS 4.60
導電性銀塗料	ペルコ	16062	電極と接続Cu線間の導電性接着
銅線カプセル化0.1mm	アマゾン	https://www.amazon.com/Enameled-Temperature-Resistance-Transformers-Inductors/dp/ B09TNM51S5/ref=asc_df_B09 TNM51S5?mcid=155de761ea4 c389ea86d45ba61a83e8d&タグ =ハイプロド-20&linkCode=df0&hvadid =693675076770&hvpos=&hvnetw =g&HVRand = 664358781094905 4431&hvpone=&hvptwo=&hvqmt =&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint =&hvlocphy=9021716&HVTARGID= PLA-1878323158943&PSC = 1
Digidata 1550デジタイザ	分子デバイス	NA
グルコース	シグマ・アルドリッチ	G7021
HBSS、カルシウム、マグネシウム、フェノールレッドなし	サーモサイエンティフィック	14175095
ハイデルベルクMLA150ダイレクトライター	ハイデルベルク	NA
ヘパリン(1000 IU / kg)	エージェントファーマシューティカルズ	1009655
ヘペス	シグマ・アルドリッチ	(H4034)
ヘキサン	シグマ・アルドリッチ	52750-10ミリリットル	溶媒
HFの	フィッシャーサイエンティフィック	A513-500	微量金属グレード
HMDS ヴェイパープライムオーブン	歩留まりエンジニアリングシステム	NA
HNO3	フィッシャーサイエンティフィック	A509P500	微量金属グレード
ホットラミネーター	オフィスデポ	L410-A	多層カプセル化
インタンRHDシステム	インタンテクノロジーズ	C3100
iWorx 心電図	アイワークス	IA-400D
iWorx LVDプローブ	アイワークス	BP-100
iWorxプリアンプ	アイワークス	C-ISO-256 認証取得
KCl	シグマ・アルドリッチ	(P4504)
ラテックスバルーン(サイズ4)	ラドノティ	170404
MgCl2.7H2O	シグマ・アルドリッチ	(M9272)
NaCl	シグマ・アルドリッチ	(S9625)
ナフィオン117含有溶液	シグマ・アルドリッチ	31175-20-9	ナノ多孔質カーボンパターン用固定試薬
NaH2PO4	シグマ・アルドリッチ	(S0751)
ナオウ	シグマ・アルドリッチ	221465
PDMSの	フィッシャーサイエンティフィック	NC9285739
プラズマ-サーム誘導結合プラズマフッ化物エッチャー	プラズマサーム	NA
PMMA(495 A6)	マイクロケミカル	M130006
ポリ(ピロメリチン酸二無水物-Co-4,4'-オキシジアニリン)	シグマ・アルドリッチ	575801	PI前駆体
ポリ(エチレン-co-酢酸ビニル)	シグマ・アルドリッチ	437247-250G	浸透用ポリマー
ポリ(ビニルアルコール)	シグマ・アルドリッチ	341584-25G
ポリエチレンテレフタレート(PET)	アマゾン	KS-6304-21-11	タイプ D クリア PET シート .0005 インチ 厚さ x 27 インチ幅 x 10 フィート 長さ 1 個
ポテンショスタット	生物 学 的	SP-200	電気刺激
レジストオーブン	派遣	LCC1-15-5
走査型電子顕微鏡	カールツァイス	コチョウゲンボウ	形態特性評価のための機器
シリコンウエハ	NOVA電子材料	HS39626
シリコーン接着剤	WPIの	KWIK-SIL-S型	カプセル化
ホウ酸ナトリウム	シグマ・アルドリッチ	SX0355型
SOIウェハ	ウルトラシル	3-10541	タイプオリエント:P / B(100)DT:7+/-1um DR:<。005オームCM HT:300+/-10um HR:1-30オームボックス:1um+/-5%UD-13998/UH-13962
SU-8 2002年	マイクロケミカル	SU-8 2000シリーズ
SU-8 現像液	マイクロケミカル	SU-8 2000シリーズ
ウェットティッシュ接着剤	3メートル	1469SBの
Whatman 定性濾紙、グレード 1	シグマ・アルドリッチ	WHA1001150	カーボンパターニング用基板