ミニ脳卒中マウスモデルにおける神経免疫相互作用の単離とフローサイトメトリー評価

サマリー

ここでは、ミニ脳卒中モデルでのフローサイトメトリー分析を使用して、虚血性脳卒中後の免疫細胞機能を評価するためのプロトコルを紹介します。この方法は、神経免疫相互作用の詳細な調査を可能にし、他の神経変性疾患の研究にも適応できるため、脳卒中病理における免疫応答の理解を深めることができます。

要約

脳卒中は、世界中で主要な死因と長期障害の原因であり、虚血性脳卒中が大半を占めています。虚血性脳卒中になると、常在免疫細胞と浸潤免疫細胞が活性化され、さらなる神経細胞の損傷に寄与します。しかし、虚血性脳卒中の病理における免疫系の役割は、主に神経炎症中の微小環境の変化に反応する免疫応答の複雑で動的な調節のために、完全には理解されていません。したがって、虚血性脳卒中後の常在免疫細胞と浸潤免疫細胞の活性化を経時的に監視および分析することが不可欠です。この研究では、ミニ脳卒中モデルでのフローサイトメトリー分析を使用して、虚血性脳卒中後のこれらの免疫細胞の機能を評価するためのプロトコルを提示します。梗塞した脳組織を特定の位置でマイクロダイセクションし、機械的方法と酵素的方法の両方を用いてシングルセル懸濁液に解離します。細胞を70 μmのセルストレーナーに通し、蛍光タグ付き抗体カクテルで標識してから、フローサイトメトリー分析で定量します。このアッセイは、虚血性脳卒中後の神経免疫相互作用を研究するために特別に開発されましたが、多発性硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病などの他の神経変性疾患の神経免疫メカニズムの研究にも容易に適応させることができます。

概要

脳卒中は、世界中で死亡と長期障害の主な原因であり、虚血性脳卒中が症例の大部分を占めています ^1,2,3。この方法の全体的な目標は、ミニ脳卒^{中マウスモデル4,5}において、常在免疫細胞と浸潤免疫細胞の両方の活性化を評価するための洗練されたアプローチを提供することにより、虚血性脳卒中後に発生する神経免疫相互作用の理解を深めることです。これらの免疫細胞と神経微小環境との間の複雑な相互作用は、虚血性脳卒中の病態生理を理解するために重要です。しかし、これらの神経免疫相互作用の根底にある正確なメカニズムは、主に神経炎症によって引き起こされる免疫応答の動的かつ多面的な性質のために、ほとんど解明されていません⁶。この手法は、神経炎症の文脈における免疫応答の複雑なダイナミクスと、その後のニューロンの損傷と回復結果への影響を解明することを目的としています。

この技術の開発の背後にある理論的根拠は、免疫細胞が神経細胞の損傷を悪化させ、虚血イベント後の回復に影響を与えるという重要な役割に由来しています。これらの相互作用を研究する従来の方法では、免疫細胞の活性化の時間的および空間的なニュアンスを捉えるために必要な解像度が不足していることがよくあります。このプロトコルでは、微小解剖した梗塞脳組織に由来する単一細胞懸濁液のフローサイトメトリー解析を採用することで、免疫細胞プロファイルの経時的な評価をより詳細かつ動的に行うことができます^7,8。このアプローチにより、特定の免疫細胞集団とその機能状態の同定が可能になり、虚血性脳卒中の病態生理を理解する上で極めて重要です。

組織学的染色やバルクRNAシーケンシングなどの代替技術と比較して、免疫細胞タイプの個々の寄与に関する洞察が限られている可能性がありますが、このフローサイトメトリー法にはいくつかの利点があります。例えば、これまでの研究では、フローサイトメトリーにより複数のマーカーを同時にハイスループット解析することができ、免疫細胞の表現型と機能のより包括的な特性評価が容易になることが示されている^{9,10,11,12,13}。さらに、この方法が多発性硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病などのさまざまな神経変性疾患に適応する能力は、神経免疫相互作用を扱った幅広い文献において、その汎用性と関連性を示しています。

この手法の応用を検討している研究者にとって、研究の具体的な目的を評価することは不可欠です。この手法は、虚血性脳卒中または関連する神経変性疾患の文脈における免疫応答の詳細な時間的分析を必要とする研究に特に適しています。ユーザーは、フローサイトメトリーの基礎的な理解とマウスモデルの経験を持っていることが推奨されます。これにより、このプロトコルを効果的に実施し、得られたデータを解釈することができます。この方法は、神経免疫相互作用を研究するための堅牢なフレームワークを提供することにより、脳卒中の病理における免疫関与の複雑さを明らかにするための継続的な取り組みに大きく貢献しています。

プロトコル

すべての動物実験は、首都医科大学北京友好病院の動物実験委員会(IACUC)によって承認されました。すべての溶液を滅菌ろ過し、使用するすべてのチューブを滅菌することをお勧めします。

1. 試薬とバッファーの調製

1. 消化酵素ミックス:コラゲナーゼIVを溶解して0.25%の濃度を取得し、DNase Iを希釈して最終濃度2 U/mLに到達します。
2. 磁気活性化細胞ソーティング(MACS)バッファー:ウシ血清アルブミン(BSA)とエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を溶解して、1x PBSでそれぞれ0.5%と2 mMの濃度に到達します。

2. 限局性虚血性脳卒中モデル

注:C57BL/6 Jマウス(8-10週齢)を用いて、前述したように、限局性虚血性脳卒中モデルを確立した¹⁴。マウスは、体重10gあたり0.2mLの投与量で1.25%アベルチンの溶液を使用して代替的に麻酔することができます。

1. 3%イソフルランを使用してマウスに麻酔をかけ、ガス麻酔装置で1.5%の投与量を維持します。加熱パッドを使用して、手順全体を通して体温を37°Cに保ちます。
   注:この研究は、手術の開始前に手術面の達成を確認することの重要性を強調しています。このステップは、標的領域への最適なアクセスを確保し、手術中の潜在的な合併症を最小限に抑えるために重要です。
2. 電気カミソリを使用して、右目と右耳の間の領域の毛皮を切り取ります。解剖顕微鏡で、目に隣接する指定された領域に垂直切開を作成します。
3. すべての組織を穏やかに分離して頭蓋骨を露出させ、垂直の「Y」字型の血管構造を特徴とする右中大脳動脈(MCA)の遠位枝を特定します。電動ドリルを使用して頭蓋骨を貫通し、慎重に取り除くように注意してください。
4. マイクロ鉗子で髄膜を繊細に切除します。
5. 右中大脳動脈 (MCA) の遠位枝を露出させ、10-0 縫合糸を使用して右 MCA の遠位枝の永久結紮を行います。
6. 組織を元の状態に再配置し、ティッシュ接着剤で顔の皮膚切開部を閉じます。
7. マウスを仰臥位に置き、電気カミソリで首の部分の毛皮を切り取ります。
8. 首の領域に水平切開を作成し、顎下腺をそっと引き離します。
9. マイクロ鉗子で頸動脈鞘を慎重に解剖し、総頸動脈を特定し、それを迷走神経から分離します。
10. 4-0縫合糸を総頸動脈に通し、スリップノットで固定します。
11. 反対側の総頸動脈で手順10を繰り返します。両側総頸動脈(CCA)を一時的に7分間閉塞します。
12. 顎下腺組織を元の位置に戻し、組織接着剤で首の切開を閉じます。
    注:偽手術群は、脳卒中群と同じ手順を受けましたが、遠位MCAとCCAは結紮されていないままであったという唯一の例外があります。
13. 手術中および手術後のマウスを、呼吸や体温など、マウスを監視します。マウスが完全に目覚めるまで、マウスをウォーミングパッドの上に置いておきます。

3.脳の灌流と解剖

1. 50mLのシリンジを用意し、その端に26Gの針を取り付けます。シリンジに生理食塩水を入れます。
2. マウスに深い麻酔を達成するために、1.25%アベルチンの2回投与を投与します。
   注意: 次のステップに進む前に、マウスが完全に麻酔されていることを十分に確認する必要があります。
3. 発泡スチロールボードの上でマウスを仰臥位に置き、前肢と後肢を伸ばして、26Gの針で固定します。
4. マウスに十分な麻酔をかけたら、眼科用鉗子で腹部の皮膚をつかみ、横切開して肝臓を露出させます。肋骨の両側に沿って切り込み、心臓を露出させます。
5. 26Gの針を左心室に挿入して耳介を切断し、注射器を押し下げて血液が流出するのを待ちます。
6. 耳介から排出される血液が透明になるまで、灌流プロセスを続けます。
7. まっすぐな手術用ハサミを使用して、脊髄のすぐ上でマウスの首を切ります。
8. 頭蓋骨を露出させるために、頭の皮膚に前後切開を作成します。側壁と頭蓋骨の基部の接合部に2つの横方向の切開を行います。
9. 矢状縫合糸に沿って頭蓋骨を切開し、眼窩の間に切開を行います。
10. 鉗子を使用して、各半球を覆う頭蓋骨を取り除き、それによって脳を露出させ、マウスの鋼の脳マトリックスに移します。その後、脳を連続して2mmの厚さの冠状スライスに切片化します。

4. 皮質組織の単一細胞懸濁液への消化とフローサイトメトリーのための抗体染色

1. 500 μLの消化酵素ミックスを12ウェルプレートの各ウェルに導入します。
2. 梗塞組織を繊細に分離し、マイクロ鉗子を使用して消化酵素ミックスに移します(図1)。
3. 眼科用ハサミで組織を可能な限り小さな断片に微細に断片化し、37°Cで20分間インキュベートします。
4. P1000ピペットを使用して、溶液を10回穏やかに吸引して分注し、組織を個々の細胞に解離させた後、溶液を70μmのセルストレーナーに通します。12ウェルプレートと細胞ストレーナーの両方を、カルシウムとマグネシウムを含む氷冷HBSSで連続的にすすぎます。
5. 500 × g 、4°Cで5分間遠心分離し、上清を慎重に廃棄します。
   注:生成されたペレットは非常に緩く、簡単に外れますので、細胞の損失を防ぐためにそれらを乱すことはご遠慮ください。
6. ペレットを1x PBSの1 mLに再懸濁し、ステップ5を繰り返します。その後、ペレットを150 μLの1x PBSに再懸濁し、懸濁液を底が丸い96ウェルプレートに移します。その後、再び500 × g で4°Cで5分間遠心分離します。
7. 96ウェルプレートをしっかりとつかみ、素早く反転させて上清を捨てます。
8. 細胞生存率蛍光色素を1x PBSで1:100の比率で希釈し、ペレットを150 μLアリコートに再懸濁します。光から遮蔽された室温(RT)で10分間インキュベートします。
9. 500 × g 、4°Cで5分間遠心分離し、上清を捨てます。細胞表面抗体カクテルをMACSバッファーで希釈します。細胞を洗浄せずに、細胞表面抗体カクテルを添加し、4°Cでさらに15〜20分間インキュベートします。
10. 500 × g 、4°Cで5分間遠心分離し、上清を捨てます。ペレットを150μLのMACSバッファーに再懸濁します。
11. 手順4.10を繰り返し、懸濁液を1.5 mL遠心分離管または5 mL丸底ポリスチレン試験管に移します。

5. フローサイトメトリーの解析とソーティング

1. 手動技術またはオンライン設計ツールのいずれかを利用して、装置の構成に従ってマルチカラーフローサイトメトリーパネルを設計し、抗体に結合した蛍光色素の選択を最適化し、スペクトルのオーバーラップを最小限に抑えます。
   注:マルチカラーフローサイトメトリーパネルを設計する際には、いくつかの重要な考慮事項を考慮する必要があります。まず、開始前に、レーザーやフィルターなど、使用中の機器の構成に精通することが不可欠です。次に、低存在量の抗原については抗体に明るい蛍光色素標識を使用し、高発現抗原を標的とする抗体には薄暗い蛍光色素標識を選択します。最後に、データから非生存細胞や破片を効果的に除外するために、パネルに細胞生存率色素を含めることが不可欠です。特に、存在量が少ない抗原または特性評価が不十分な抗原の適切なゲーティングを確保するために、蛍光マイナス1(FMO)コントロールを利用するべきである¹⁵。FMOコントロールは、関心のあるものを除く全ての系統マーカーを包含し、陽性染色細胞と陰性染色細胞¹⁶との間の正確な描写を容易にする。
2. 前方散乱光(FSC)検出器と側方散乱光(SSC)検出器の設定を調整して、目的の細胞がスケールに適切に表示され、必要に応じてゲート化できるようにします。
3. FSCとSSCを細心の注意を払って微調整し、破片や異音を排除します。FSCの面積と高さの両方を示すドットプロット内で、ダブレットを単一のセルから区別します。細胞生存率蛍光色素陰性シグナルに基づいて生細胞を単離します。
   注意: さまざまな機器の設定により、わずかな違いが見られる場合があります。例えば、セルソーターの中には、ダブレットと単一セルを区別するためにFSCの幅と高さを使用するものもあれば、同じ目的でFSCの面積と高さを利用するものもあります。
4. 各チャンネルの補正を調整します。
   注:細胞サンプルと市販のコンペンセーションビーズの両方を、蛍光スピルオーバーコンペンセーションの目的で使用することができます。
   1. 自家蛍光コントロール(未染色細胞)と染色細胞ポジティブコントロールを比較して、染色細胞が各パラメーターに対して適切にスケーリングされていることを確認します。さらに、マルチカラーの細胞サンプルを分析し、2色のドットプロットをモニタリングし、補正設定を上向きまたは下向きに調整して、細胞集団が互いに垂直または水平に整列するようにすることで、補正を微調整します。
   2. CD45およびCD11bシグナルを利用して、リンパ球(CD11b-CD45^高)、ミクログリア(CD11b ⁺ CD45^int)、骨髄細胞(CD11b ⁺ CD45^高)、およびアストロサイト(CD11b-CD45-GLAST ⁺)^17,18を区別します。
   3. 偽の脳組織を自家蛍光制御およびリンパ球を識別するための参照として採用します。特定のターゲットが検討中の場合は、脳卒中後の脳組織を用いたFMOコントロールを利用します。
5. 制御データとサンプルデータの収集を開始し、保存されていることを確認します。
   注:ここで説明するミニ脳卒中モデルが小さな梗塞をもたらすことを考えると、通常、中大脳動脈閉塞(MCAO)モデルよりも収集される細胞が少なくなります。一般に、5個×10個の⁵ 個の細胞を採取すると、それぞれ約5個の×10個の³ 個のミクログリアおよび1個の×10個の⁵ 個のアストロサイトが得られます。
6. 目的の細胞集団を選択し、5 mLの丸底ポリスチレン試験管または15 mLの円錐形遠心チューブに選別します。
   注:500μLのPBSを加え、チューブを細心の注意を払ってすすいで、細胞の生存率を確保し、細胞ペレットの形成を助けます。

6. 選択した細胞集団における遺伝子発現の解析

注:Total RNA抽出は、メーカーのガイドラインに従って市販のキットを使用して実施することもできます。

1. ステップ5.6の細胞を500 × g 、4°Cで3分間遠心分離し、上清を捨てます。細胞を1 mLのTRIzol試薬に再懸濁します。
   注:選別された細胞の数は、培養細胞や組織と比較してかなり少なくなります。その結果、遠心分離速度が速いほど、よりコンパクトな細胞ペレットの形成に役立つ可能性があります。このステップから得られた細胞は、細胞培養やシングルセルRNAシーケンシングパイプラインなどの後続のアプリケーションに利用できます。
2. サンプルを室温で5分間放置して、核タンパク質複合体の解離を促進します。
3. 0.2 mLのクロロホルムをサンプルに加え、チューブを固定します。チューブを15秒間激しく振とうし、その後RTで2分間インキュベートします。
4. サンプルを10,000 g で4°Cで15分間遠心分離します。 RNAは上部水相にのみ残ります。
5. 界面を乱さないように注意しながら、上部水相をきれいなチューブに慎重に移します。
   注:水相の容量は約500μLである必要があります。
6. 0.5 mLのイソプロパノールを導入し、チューブを数回反転させて穏やかに混合することにより、水相からRNAを沈殿させます。サンプルをRTで10分間インキュベートします。
7. サンプルを10,000 g で4°Cで10分間遠心分離し、RNAを収集します。
8. 上清をデカントし、吸引して残留液体を完全に取り除きます。
9. RNAペレットを75%エタノールで1回洗浄し、75%エタノールを最低1mL加えます。サンプルを十分に混合し、7500 × g で4°Cで5分間遠心分離します。
10. エタノールの痕跡をすべて取り除きます。RNAペレットを5分間風乾します。
11. ピペッティングで上下させて、RNAを10 μLのRNaseフリー水に溶解します。
12. メーカーの指示に従ってリアルタイムPCRの実施に進みます。

結果

この研究では、ミニ脳卒中モデル内のフローサイトメトリー分析を使用して、虚血性脳卒中後の免疫細胞の機能を評価するための洗練されたプロトコルを提示します。ミニ脳卒中は、右中大脳動脈 (MCA) の遠位枝の永久結紮によって誘発され、続いて両側総頸動脈 (CCA) の 7 分間の閉塞が引き起こされました。この方法論は、病変量が少なく、一貫しており、死亡率が非常に低いことを特徴とする軽度の脳卒中をもたらします。さらに、このモデルは長期的な神経免疫相互作用を調査する能力を備えているため、脳卒中後の回復過程における炎症の役割を調べるのに非常に適しています。

ミクログリア誘発性神経炎症は、虚血性脳卒中の病態生理学において中心的な役割を果たしています¹⁹。虚血性脳卒中後のミクログリアトランスクリプトームの動的変化を解明するために、まずフローサイトメトリーを用いてミクログリアを単離し、リアルタイムPCRでその純度を確認しました。 図2 は、脳卒中後の1日目(

ディスカッション

この研究では、ミニ脳卒中モデルでのフローサイトメトリー分析を利用して、虚血性脳卒中後の免疫細胞の機能を評価するための詳細なプロトコルを提示します。このプロトコルの重要なステップには、右中大脳動脈 (MCA) の遠位枝の永久結紮による限局性虚血性脳卒中の確立と、両側総頸動脈 (CCA) の 7 分間の閉塞が含まれます。この外科的アプローチは、一貫した病変量と低い死亡率を特徴とする軽度の脳卒中をもたらすため、神経免疫相互作用の長期的な研究に適しています¹⁴。外科的ステップの正確な実行は、変動が一貫性のない脳卒中の重症度につながる可能性があり、その後の免疫学的評価の妥当性を損なう可能性があるため、不可欠です²⁴。

ここで説明する技術の修正は、細胞の解離と精製を最適化するために必要でした。機械的方法と酵素的方法の両方を使用して、マイクロディスセッションされた梗塞脳組織からシングルセル懸濁液を作成することは、高い細胞収量と生存率を...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1.5 mLマイクロ遠心チューブ	ネスト	615601	ラボ資料
1×PBSの	コーニング	21-040-CM	試薬
96ウェルクリアラウンドボトムTC処理マイクロプレート	コーニング	3799	ラボ資料
APC抗マウスCD19	バイオレジェンド	152410	抗体
APC/シアニン7抗マウスCD45	バイオレジェンド	103116	抗体
アバーチン (1.25%)	南京アイベイバイオテクノロジー	M2920	試薬
BD FACSAria II	BDの	642510	備品
ブリリアントバイオレット421抗マウスCD4	バイオレジェンド	100437	抗体
ブリリアントバイオレット605抗マウス/ヒトCD11b	バイオレジェンド	101237	抗体
BSAの	シグマ・アルドリッチ	A1933-1G	ケミカル
コラゲナーゼIV	シグマ・アルドリッチ	C4-28-100MG	酵素
DNase I	ニューイングランドバイオラボ	M0303L	酵素
EDTAの	シグマ・アルドリッチ	EDS-100G	ケミカル
Falcon 5 mL 丸底ポリスチレン試験管	コーニング	352052	ラボ資料
ファルコン 15 mLコニカル遠心分離管	コーニング	352095	ラボ資料
フロージョーV10	BDの		ソフトウェア
GLAST (ACSA-1) 抗体、PE	ミルテニー・バイオテック	130-118-344	抗体
イソフルラン	RWDライフサイエンス	R510-22-10	試薬
PE/シアニン7抗マウスCD3	バイオレジェンド	100220	抗体
PE/Dazzle 594 アンチマウス NK-1.1	バイオレジェンド	156518	抗体
TRIzol試薬	サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社	15596026	試薬
UltraPure DNase/RNase フリー蒸留水	サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社	10977015	試薬
Vetbond ティッシュ接着剤	3メートル	1469SBの	ラボ資料
ゾンビアクアフィックス可能な生存能力キット	バイオレジェンド	423102	アミン反応性蛍光色素