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研究記事

チベット医学Jiangtangleを含む血清がRIN-m5F膵臓β細胞のミトコンドリア機能に及ぼす保護効果

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DOI：

10.3791/68319

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2025年6月27日

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1Department of Tibetan Medicine, University of Xizang Medicine, 2School of Pharmacy/School of Modern Chinese Medicine Industry, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3TCM Regulating Metabolic Diseases Key Laboratory of Sichuan Province, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4College of Life Sciences, Sichuan University, 5Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy/Academy for Interdiscipline, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

この研究は、チベットの薬である江絡みを含む血清が、ミトコンドリアと解糖のATPレベルを高めることにより、ミトコンドリアの機能障害を改善できることを示しました。

要約

ミトコンドリアの機能障害によって引き起こされるβ細胞不全は、2型糖尿病(T2DM)の中核的な特徴です。チベット医学Jiangtangleは、Berberis kansuensis、Curcumaelongae Rhizoma、Malvae Fructus、Tribuli Fructus、Thlaspi arvense L.、Phyllanthus emblica L.からなり、T2DMの治療に使用できます。しかし、ミトコンドリア機能への影響は不明のままです。本研究は、チベット医学「ジャンタングル」のミトコンドリアに対する薬理学的効果を明らかにすることを目的としています。チベット医学Jiangtangleの事前投与から7日後に、腹部大動脈採血によりラット血清を得た。ラット膵島β細胞(RIN-m5F)を、コントロール群、モデル群、およびJiangtangle含有血清群に分けた。モデル群とJiangtangle含有血清群は、50 mMグルコースを含有するDMEM培地で24時間損傷を誘発しました。対照群は、グルコースを含まないDMEM培地で24時間処理されました。次に、培地をコントロール群とモデル群に加え、Jiangtangle含有血清群を2.5%、5%、および10%のJiangtangle含有血清を含有する培地と24時間インキュベートしました。UPLC-ESI-Q-Orbitrap-MSの結果は、Jiangtangleに90の化合物が示され、そのうち6つの典型的な化合物が血液中に入ることが示されました。CCK 8を使用して細胞生存率を測定し、Seahorse XFeを使用してミトコンドリアのエネルギー代謝を評価し、RIN-m5F細胞の高血糖モデルに対するJiangtangle含有血清の効果を評価しました。Jiangtangle含有血清は、RIN-m5F細胞の生存率、ミトコンドリアATPレベル、解糖ATPレベル、基礎解糖、代償性解糖、OCR、プロトンリーク、および最大呼吸を増強しました。

概要

糖尿病は、世界で広く蔓延している慢性代謝性疾患です。その複雑な病因は、人間の健康に深刻な脅威をもたらし、緊急に解決すべき主要な公衆衛生問題です1。糖尿病は、主に1型糖尿病、2型糖尿病(T2DM)、妊娠糖尿病、および特定のタイプの糖尿病2型に分けられます。ライフスタイルの変化と老化プロセスの加速に伴い、糖尿病の有病率は過去数十年で急激に上昇傾向を示しています。中国は世界最大の糖尿病人口を抱えており、1億1800万人以上が糖尿病に苦しんでおり、世界全体の約22%を占め、90%以上が二型糖尿病3,4,5です。報告されたすべての病因において、膵島β細胞機能障害は、2型糖尿病のプロセスにおける極めて重要なメカニズムであると発表されています6,7。

細胞エネルギー代謝の中心であるミトコンドリアは、膵島β細胞8の基本機能に関与する副細胞小器官である。現在の研究では、T2DMの発生と発症は、ミトコンドリアの活性、機能、および酸化ストレスと密接に関連していることが示されています。ミトコンドリアの機能障害によって引き起こされるβ細胞不全は、T2DM9の中核的な特徴です。膵島に位置するβ細胞は、血糖値を調節するために必要なホルモンであるインスリンを合成して分泌する役割を担っています。2型糖尿病の発症過程では、異常なミトコンドリア機能、強化活性酸素種、および酸化ストレス反応がβ細胞のミトコンドリア動的バランスを壊し、インスリン10の分泌と代謝に影響を与えます。

チベット医学のJiangtangleは、Berberis kansuensis、Curcumaelongae Rhizoma、Malvae Fructus、Tribuli Fructus、Thlaspi arvense L.、Phyllanthus emblica L.で構成されています(図1)。香りと苦味が特徴の黄色い粉末です。口渇、多飲症、衰弱、多尿症、糖尿病性足、皮膚のかゆみ、および糖尿病によって引き起こされるその他の症状の治療に使用できます。既存の臨床的証拠は、ベルベリス樹皮アルカロイドが血糖値を下げ、インスリン抵抗性を改善し、炎症を軽減することにより、2型糖尿病を効果的に緩和できることを示しています11。クルクミンは、血糖値を下げ、インスリン感受性を高め、脂質プロファイルを調節し、抗炎症作用と抗酸化作用を発揮することにより、2型糖尿病を改善する可能性があります12。さらに、Malave Fructus、Tribulifructus、Thlaspi arvense L.およびPhyllanthus emblica L.もまた、抗糖尿病活性または抗酸化活性を有する13,14,15。現在、T2DMの治療におけるチベット医学Jiangtangleの有効性、材料的根拠、およびメカニズムはまだ明らかにされていません。中国のチベット医学の構成は複雑であり、その病気の予防と治療は、全体的かつ体系的な視点での薬物使用の理論に基づいています。現在、中国マテリアメディカ血清の薬理化学は、血液中の吸収成分を部分的に説明することができ、チベットの医薬品の物質的基礎を探求するための重要な手段となっている16。この研究は当初、チベット医学Jiangtangleのミトコンドリアに対する保護効果をin vitroで解明し、Jiangtangle含有血清が高グルコースストレス下でのラット膵島β細胞(RIN-m5F)のミトコンドリア機能障害を軽減できるという新しい仮説の検証に焦点を当てていました。

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プロトコル

Sichuan Scientist Biological Testing Biotechnology Co., Ltd.の管理委員会は、動物プロトコルを承認しました(レコード番号:SYST-2024-019)。8〜10週齢、体重260〜300gの雄Sprague Dawley(SD)ラットを、この研究では23〜2°C、相対湿度55%〜60%の制御された環境で独立した換気ケージに飼育±。これらの特定の病原体を含まない動物は、商業供給業者から供給されました( 材料の表を参照)。すべてのラットは、実験開始前に新しい環境に順応するために1週間の適応給餌を受け、水と食物への無制限のアクセスを得ました。

実験の準備

必要な薬物および試薬は、実験フローチャート( 材料表参照)に従って調製した。この研究では、SPF SDラット(8-10週、260-300g)を使用しました。すべての動物は商業供給業者から購入されました( 材料の表を参照)。検疫後、動物は12:12時間の明暗サイクルで一定の室温に保たれ、標準的なげっ歯類の食事と水を与えられました。

動物治療と血清採取

適応摂食を受けたすべてのラットに、チベット医学のJiangtangleを7日間強制経口投与しました。臨床用量は0.6g / dであり、これをラット用量1.26g /kg17に変換しました。最後の投与から1時間後、ラットはイソフルランで3%〜4%の誘導と2%の維持のために麻酔されました。.次いで、麻酔をかけたラットを手術台に固定し、手術部位をヨードフォアで消毒した。腹部の大動脈を露出させるために、腹部の正中線に沿って切開が行われました。血液は、大動脈からヘパリン化シリンジ(8 mL)を使用してゆっくりと採取し、遠心チューブに移して遠心分離しました。採取した血液を2360× g で4°Cで10分間遠心分離し、血清を分離した。その後、血清サンプルをチューブあたり 5 mL の極低温チューブに分注し、その後の分析のために -80 °C の医療用冷蔵庫( 材料の表を参照)に保存しました。

UPLC-ESI-Q-ORBITRAP-MS分析

薬用材料サンプルの調製:チベットの薬Jiangtangle(140.0 mg)を正確に秤量し、25 mLのメタノール( 材料の表を参照)に溶解した後、40 kHz、300 Wで30分間超音波処理しました。得られた溶液を0.22μmのメンブレンでろ過して、試験サンプルを得ました。

血清サンプル調製:100 μL の血清を 400 μL の冷メタノールおよびアセトニトリル (v/v、1:1、 材料表を参照) とボルテックスにより完全に混合しました。混合物を氷浴中で1時間超音波処理(40kHz、300W)により処理した。次に、混合物を-20°Cで1時間インキュベートし、4°Cで20分間、14,000 x gで遠心分離しました。その後、上清を回収し、真空下で乾燥させて、UPLC-ESI-Q-Orbitrap-MS分析を行いました。

クロマトグラフィー条件:上清は UPLC-ESI-Q-Orbitrap-MS システムで測定しました( 「材料の表」を参照)。LC 分離には、ACQUITY UPLC HSS T3 カラム(2.1 mm × 100 mm、1.8 μm)を使用しました。移動相は、A(0.1% ギ酸水溶液)と B(100% アセトニトリル)で構成されていました。流速は 0.3 mL/分で、特異的グラジエントプログラムは 5%-95% B(0-30 分)、95% B(30-35 分)でした。注入量は 5 μL で、MS データはポジティブ ESI モードとネガティブ ESI モードで別々に取り込まれました。HESI源には、噴霧電圧、毛細管温度、ガス流量などの条件が設定されていました。装置はm/z 70-1050 Daでスキャンされ、フルMSとMS/MSで異なる解像度でスキャンされ、生のMSデータはMS-DIALを使用してピークアライメントのために処理されました。チベット医学Jiangtangleの組成は、公的データベースに対する精密質量とMS/MSデータによって同定されました。少なくとも 1 つのグループで 50% を超えるゼロ以外の値を持つ変数のみが保持されました。

細胞培養と治療

RIN-m5F細胞( 材料表を参照)を、DulbeccoのModified Eagle培地(DMEM)、10%ウシ胎児血清、および1%ペニシリン/ストレプトマイシンとともに、制御された5% CO2 インキュベーター( 材料表を参照)で37°Cで培養しました。対数増殖段階のRIN-m5F細胞を採取し、消化後にカウントし、1 x 105 で96ウェルプレートに接種しましたウェルあたりの細胞数。10-60 mMのグルコースを使用して、T2DMの高グルコース環境を模倣するために細胞誘導を行いました。RIN-m5F細胞は、コントロール群、モデル群、および2.5%、5%、および10%Jiangtangle含有血清群に分けられました。対照群の細胞をDMEMで処理し、他の群をグルコースを含むDMEMで24時間誘導しました。コントロール群とモデル群を培地で添加し、各血清群に 2.5%、5%、および 10% の Jiangtangle 含有血清を含む DMEM を添加し、5% CO2 で 37 °C で 24 時間インキュベートしました。

CCK 8 解析

細胞生存率はCCK 8で測定しました( 「材料の表」を参照)。RIN-m5F細胞を96ウェルプレートに接種し、グルコース(0、10、20、30、40、50、および60 mM)で処理しました。次に、100 μL の DMEM と Jiangtangle 含有血清をウェルに添加し、5% CO2 と共に 37 °C で 24 時間インキュベートしました。各グループには6つの複製井が含まれていました。グルコースと24時間インキュベートし、Jiangtangle含有血清と24時間インキュベートした後、10 μLのCCK 8溶液を添加し、さらに1.5時間37°Cでインキュベートしました。全波長マイクロプレートリーダー( 材料の表を参照)を使用して、450 nm16 で各穴の吸光度値を検出しました。

ミトコンドリア機能解析

以前に報告した18と同様に、Seahorse XFe 24アナライザー( 材料の表を参照)を使用して、リアルタイムのATP産生速度と解糖速度を評価しました。RIN-m5F細胞をSeahorse XFe24 V24マイクロプレートに接種しました。細胞をXF24細胞培養プレートに播種したのは、100μLの細胞懸濁液を各ウェルに分注し、プレートを1時間放置するという2段階のプロトコルで行いました。次に、プレートを37°C、5%CO2インキュベーターに4時間移し、初期接着を促進しました。次に、150 μL DMEMを各ウェルに添加しました。24時間モデリングし、24時間薬物投与した後、1%グルコース、1%ピルビン酸、および1%グルタミンをSeahorse XF DMEM培地に添加することにより、検出溶液を調製しました。次に、細胞を1 mLの検出溶液で2回洗浄しました。リアルタイムATPレート測定キットおよび解糖レートアッセイキットを使用するために、56 μLのオリゴマイシンおよび62 μLのロテノン/アンチマイシンAを再懸濁し、それぞれセンサーカートリッジウェルAおよびBに添加しました。そして、細胞培養プレートをCO2フリー細胞培養インキュベーターに60分間置いた。最後に、ATP産生速度と解糖速度を自動注入システムによってリアルタイムで監視しました。すべての実験は37°Cで行われ、データはXF Waveソフトウェア19を使用して分析されました。

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結果

UPLC-ESI-Q-Orbitrap-MS は、チベット医学の Jiangtangle にフェノール、アルカロイド、フラボノイド、ヌクレオシド、有機酸、アミノ酸、テルペノイド、クマリン、配糖体、タンニン、リグナン、ステロイドなどの化合物が含まれていることを示しました。(図2、 表1)。SDラットには、1日1回、チベット医学Jiangtangle1.26g / kgを経口投与しました。血清ゲーティング戦略の概要を 図3に示します。UPLC-ESI-Q-Orbitrap-MSで検出されたJiangtangle含有血清では、プロリン、クエン酸、サリチル酸、没食子酸、イソプロピルマル酸、パルマチンの化合物が明らかになりました(図4、 表2)。Jiangtangle含有血清がミトコンドリア機能の調節に果たす役割を明らかにするために、グル...

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ディスカッション

2型糖尿病は一般に、隠れて発症し、有病率が高い慢性代謝性疾患と見なされており、眼、心血管、腎機能障害などの多くの糖尿病関連合併症を伴います20,21,22,23。その臨床症状には、血糖値の上昇、多尿症、多飲症、体重減少、さらには失明が含まれ、人々の生命と健康を深刻に脅かしています24,25。質の高い食生活の改善と平均余命の延長に加えて、グルコース代謝の乱れ、インスリン抵抗性、およびβ細胞機能障害は、T2DMの主な病態生理学的特徴の中で典型的で認識されている病原性因子です。T2DMの浸潤は、膵島の機能の継続的な進行性低下を刺激することが示されています

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開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

この作業は、チベット医科大学の第14次5カ年計画のConnotation建設プロジェクト(2023ZYYGH05)と四川省科学技術局(2024NSFSC1845)の支援を受けました。一方、著者らは、Innovative Institute of Chinese MedicineおよびPhamacy/Academy for Interdisciplineのシニア機器エンジニアであるLu Yang博士に、Seahorse XF技術の技術サービスを提供していただいたことに感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
 -80 °C医療用冷蔵庫MetherMDF-86H118
0.22 & micro;m水性膜JintengJTMF0445
0.22 µm針型微多孔質フィルター膜JintengJTSFM013001
アセトニトリルアラジンA104440
Agilent OpenLabソフトウェアAgilentVersion 2.X
バイオセーフティキャビネットエアテックBSC-1004 II A2
細胞計数キット-8バイオグラウンドBG0025
CelMate CO2インキュベーターEsco Micro Pte Ltd.CLM-240B-8
クロマトグラフィーカラムアジレントSB-C18
脱色シェーカーキリンベルTS-2
ダルベッコの改質イーグル培地ギブコ8121587
電気泳動バッファーNCM Biotech20230801
ギ酸アラジンF298778
グルコース成都ハーブピュリファイ株式会社P012-180-180222
GraphPad プリズムソフトウェアGraphPad software, LLCバージョン 9.5.1
高速冷蔵遠心機サーモフィッシャーサイエンティフィックレジェンド マイクロ 17R
低速遠心分離機ハロンNH5
メタノールアラジンM116118
ペニシリン-ストレプトマイシンNCM BiotechC125C5
リン酸緩衝生理食塩水(1回;)Gibco8120485
ラット膵島 β-cellsATCCCRL-11605
ReadMax 1500 光吸収全波長酵素 フラッシュReadMax 1500
タツノオトシゴ XF 解糖速度アッセイキットアジレント103344-100
タツノオトシゴ XF リアルタイム ATP 速度測定キットアジレント103592-100
タツノオトシゴ XFe 24 アナライザーアジレントXFe24
トリプシン (0.25%、1回;)HyCloneJ210045
UPLC-ESI-Q-Orbitrap-MS 分析計Thermo ScientificQE Q Exactive
Vortex ミキサーKylin-BellXW-80A

参考文献

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