哺乳類細胞におけるGodanti Bhasmaによって引き起こされる食作用の連続的な細胞イベントの探索

サマリー

本研究では、哺乳類細胞におけるGodanti Bhasma(GB)粒子の食作用処理を解明し、その細胞への取り込み、液胞動態、酸性化、分解を特徴づける。これらの知見は、基本的な食作用メカニズムの理解を前進させるだけでなく、GBを新しい治療戦略を開発するための有望なモデルシステムとして確立します。

要約

食作用は、細胞が異物、病原体、または破片を飲み込んで分解する重要な細胞メカニズムであり、免疫防御と組織の恒常性の維持に重要な役割を果たします。このプロセスの混乱は、さまざまな病気に関連しています。食作用経路に関与する複雑な事象を探るには、高度なスマートパーティクルと効果的なモニタリング技術が不可欠です。Godanti Bhasma(GB)は、生理活性な硫酸カルシウム粒子で構成される伝統的なインド医学で、哺乳類細胞の食作用によって急速に内在化され、細胞質の空胞化を著しく引き起こします。ここでは、GB誘発性食作用の主要な病期を、フローサイトメトリー(FC)、生細胞イメージング、および特異的染色技術を用いて評価しました。フローサイトメトリー解析により、粒子の内在化に関連する食作用カップ様構造の形成が実証されました。ライブセルイメージングにより、粒子の取り込み、液胞形成、巻き込まれた物質の分解、液胞の代謝回転など、食作用のプロセスをリアルタイムで観察することができました。中性赤とアクリジンオレンジによる染色を使用して、液胞の酸性化を評価しました。興味深いことに、GB処理細胞におけるリソソーム阻害剤BFA1による治療は、中性の赤色の取り込みの欠如によって証明されるように、空胞化をもたらさなかったことからも明らかであり、空胞化が起こるためには酸性環境が必要であることが強調されています。これらの知見は、GB誘発性食作用が、この過程に関与する連続的な細胞イベントを解明するモデルとしての可能性を強調しており、これは、宿主と病原体の相互作用、細胞内輸送を理解し、食作用に関連する疾患の革新的な治療戦略を開発するために重要です。

概要

食作用は、マクロファージや樹状細胞などの組織に常在する専門の食細胞と、上皮細胞や線維芽細胞などの非専門の食細胞によって行われる重要な細胞プロセスであり、異物を飲み込んで分解します。これらの細胞は、異物、病原体、または細胞の破片を内在化して排除し、免疫防御と組織の恒常性に大きく貢献します¹。このプロセスは、病原体関連分子パターン(PAMP)²に結合するToll様受容体(TLR)などのパターン認識受容体(PRR)を通じて、病原体、破片、または粒子を認識することから始まります。この認識は、原形質膜の突起が標的粒子³の周囲に広がる食作用カップの形成を引き起こす。アクチンフィラメントは、このステップで重要な役割を果たし、粒子の巻き込み4に必要な膜のリモデリング^{を促進します。}粒子がファゴソームに包囲されると、膜結合小胞が形成されます。ファゴソームは成熟し、初期エンドソーム、次いで後期エンドソームとの融合を特徴とし、続いて加水分解酵素⁵を含むリソソームが組み込まれる。これらの酵素(カテプシン、リゾチーム、ヌクレアーゼなど)は、液胞ATPアーゼ(V-ATPase)によってファゴソーム内で酸性化され、pHが4.5〜5.5に低下することで活性化されます。分解プロセスは、細胞からの残骸のエキソサイトーシスで終了します。この動的で複雑なプロセスにおける機能不全は、重大な免疫課題をもたらす可能性がある^6,7,8。

食作用の複雑な細胞プロセスを正確に評価するためには、食作用の主要な細胞イベントをモニタリングするための改良された簡単な方法が必要です。従来、食作用の定量化のためのモニタリング法は、顕微鏡的可視化のために所定の時間間隔で食細胞を固定する、イメージングまたはフローサイトメトリーによる色素標識標的の内在化を測定する、または特定の食作用の期間後に残存する標的細胞の数を数えるなどの技術を含むが、これらの方法は、食作用プロセス中に生じる分刻みの変動を捕捉しない⁹.さらに、色素の取り込みのような間接的な指標に依存する方法は、潜在的な受動的な色素移動¹⁰のために、実際の食作用イベントを正確に反映していない可能性がある。

近年の生細胞イメージング、フローサイトメトリー、染色技術の進歩により、高い時空間精度で食作用をモニタリングする能力に革命がもたらされました。例えば、生細胞イメージングは、シーケンシャルイベントトラッキング¹¹により、動的プロセスの連続観察を可能にします。フローサイトメトリーは、臨床研究における哺乳類細胞の解析やバイオマーカーの検出に広く使用されています¹²。しかし、従来のFC法は、個々の細胞の形態学的および空間的特性を評価するための設備を備えていない¹²。イメージングフローサイトメトリー(IFC)は、単一細胞から詳細な情報を収集できる堅牢な代替手段として機能します。IFCは、フローサイトメトリーの解析機能と高分解能イメージングを組み合わせ、形態学的および空間的な詳細性を備えたシングルセル解析を可能にします。蛍光ラテックスビーズ、ザイモサン-APC、合成ナノ粒子などのさまざまな粒子が、食作用の研究に一般的に使用され、受容体の関与、ファゴソーム形成、および免疫応答に関する洞察を提供します¹²。

従来の生化学的手法では、通常はエンドポイント分析に頼るのに対し、生細胞イメージングでは細胞プロセスを連続的かつ動的にモニタリングすることができます。この方法は、高い時空間分解能と、食作用における連続的なイベントを観察する能力を提供します。その結果、食作用の複雑なプロセスを研究するための強力なツールとなり、細胞の挙動とメカニズムについてより正確で詳細な洞察を得ることができます¹³。

イメージングシステムの進歩に加えて、食作用イベント、特に食作用体内で発生する分解ステップを明確に強調できるスマートな食作用粒子が必要です。食作用研究では、ラテックスビーズ、ザイモサン、バクテリア、アポトーシス細胞、合成ナノ粒子などの粒子を利用して、受容体の関与、ファゴソーム形成、免疫応答などのメカニズムを探求することがよくあります。これらの粒子は貴重な洞察を提供しますが、完全な分解プロセスを追跡したり、ファゴソームの成熟を直接評価したりするには限界があります。例えば、ラテックスビーズは非生分解性であり、分解を示すことができないが、ザイモサンとバクテリアはしばしば複雑な標識を必要とし、一貫した分解プロファイルをもたらさない可能性がある^14,15。

私たちの以前の研究では、硫酸カルシウムを主成分とする伝統的なアーユルヴェーダ製剤であるGBが、ファゴソームの成熟と分解を研究するための理想的な粒子として有用性を実証しました¹⁶。GBはファゴソームの酸性環境内で経時的に溶解するため、粒子の分解を明確に可視化できます。さらに、GBの堅牢な液胞形成を誘導する能力は、初期形成から酸性化、最終的な解決まで、ファゴソーム成熟の明確な段階の調査を容易にします。他の粒子とは異なり、GBは外部標識の必要性を排除し、ファゴソームの全ライフサイクルを研究するための自立型システムを提供し、食作用および関連障害のダイナミクスを理解するための理想的なモデルとなる¹⁶。

この研究は、専門的(RAW 264.7)および非専門的(HeLaおよび3T3-L1)食細胞株の両方でGodanti Bhasma(GB)を使用して粒子誘発性食作用および液胞形成を評価するために設計された標準化された再現性のあるプロトコルを示しています。この方法の全体的な目標は、異なる細胞タイプにわたる細胞取り込みメカニズム、液胞生合成、および細胞内粒子処理を研究するための堅牢なプラットフォームを提供することです。GBを10 mg/mLの濃度でDMEMに懸濁し、均一性を確保するために、より大きな粒子を沈降させ、上部画分を実験用に回収しました。フローサイトメトリーアッセイでは、1ウェルあたり2 x 10⁵ 細胞の密度で細胞を12ウェルプレートに播種し、各ウェルに300μLのGBワーキング懸濁液を添加しました。イメージングベースの分析では、ウェルあたり5,000〜10,000個の細胞を96ウェルプレートまたはチャンバースライド上に播種しました。この方法は、GBを多様な細胞タイプにおける液胞形成と粒子内在化を調査するための信頼性の高いモデルとして確立します。

プロトコル

1. 細胞培養と播種

1. 10%熱不活化FBSと抗生物質(100 μg/mLペニシリン、100 μg/mLストレプトマイシン)を添加した完全なDMEM培地を調製します。使用前にすべての試薬と機器を滅菌してください。
2. DMEMを使用して、3T3-L1、HeLa、およびRAW 264.7細胞を25 cm² フラスコおよび35 mm培養皿で培養します。5% CO₂ を入れた加湿インキュベーターで培養物を37°Cに維持し、48時間ごとに培地を交換します。
3. 継代培養では、細胞をPBSで2回洗浄し、500μLのトリプシン-EDTAを使用して接着細胞を剥離し、5分間インキュベートします。1 mLのDMEMを加えてトリプシン-EDTA溶液を中和し、ピペットでシングルセル懸濁液を作成し、新鮮なDMEMで容量を10 mLに調整します。300 x g で5分間遠心分離し、ペレットを1 mLの新鮮な培地に再懸濁します。
4. 10 μL の細胞懸濁液を 0.4% トリパンブルー (1:1) と混合し、血球計算盤を使用して生細胞をカウントし、密度を Cells/mL = Avg. count x 10⁴ x 2 として計算します。
5. 96ウェルプレートの場合:100 μLの細胞懸濁液(10,000個の細胞を含む)を各ウェルに分注します。キャビティスライドの場合、細胞懸濁液(5000個の細胞を含む)の50μLを2つのキャビティに播種し、中央のキャビティを空にします。播種した各空洞に50 μLのDMEMを加えます。
6. プレートとスライドを37°Cで5%_CO2 中で24時間インキュベートし、細胞の接着と安定化を可能にします。倒立顕微鏡で20倍の倍率で細胞を検査し、実験を進める前に形態、密度、汚染を評価します。

2. 細胞培養用GB原液/カクテルの調製

1. GBを調達し、粉末100mgを正確に計量します。10%ウシ胎児血清(FBS)と1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加したDMEM10mLに粉末を懸濁します。.
2. 懸濁液を渦巻きにして1分間放置し、より大きな粒子が沈殿するのを待ちます。次に、懸濁液の上部5 mLを滅菌遠心チューブに移します。
3. この5 mL調製したGB懸濁液を、その後の細胞培養実験用のストック溶液として指定してください。懸濁液を十分にボルテックスして、粒子が均一に分散するようにしてから、細胞に添加します。

3. フローサイトメトリー解析

1. RAW 264.7、HeLa、または3T3-L1細胞をトリプシン処理により回収し、完全DMEMで中和し、300 x g で5分間遠心分離し、1 mLの新鮮な培地に再懸濁し、10 μLを0.4%トリパンブルー(1:1)と混合し、血球計算盤を使用して生細胞をカウントし、密度を計算して2 x 10⁵ 細胞/mLに調整します。
2. 1ウェルあたり2 x 10⁵ 細胞を12ウェルプレートに播種し、24時間培養します。37°Cで5%_CO2とインキュベートします。
3. 細胞をGB懸濁液(ウェルあたり300 μL)で、さまざまな時間(30分、1時間、12時間)処理します。処理後、細胞をPBSで5回洗浄して、余分な粒子を取り除きます。
4. ステップ1.3のように細胞をトリプシン化し、PBSで十分に洗浄します。調製した懸濁液をフローサイトメーターのサンプルポートにロードします。ソフトウェアを起動し、適切な取得設定を選択します。イメージングには 明視野モード を選択します。
5. ソフトウェアの 「実行 」をクリックして、データ集録を開始します。システムがフローセルを通過する個々のセルの画像を取得するときに、少なくとも10,000イベントのデータを取得します。
6. 面積対アスペクト比の散布図を使用して、1つの無傷のセルをゲートします。これにより、ダブレットとクラスターを除外できます。画像ライブラリ内の対応する画像を表示します。ソフトウェア画像ライブラリから個々の細胞画像を収集し、処理によって誘発される形態学的変化を研究します。
7. 粒子分析では、1ウェルあたり2 x 10⁵ 細胞を12ウェルプレートに播種し、24時間培養します。細胞をGB懸濁液(ウェルあたり300 μL)で、1時間、7時間、14時間、24時間というさまざまな時間処理します。
8. 処理後、培養プレートを1分間静かに振とうし、培地を1.5mLチューブに集めます。細胞をPBSで5回洗浄して、細胞外粒子を取り除きます。
9. 500 μLのRIPAバッファー(20 mM Tris-HCl、pH 7.5、150 mM NaCl、0.1% Triton X-100、1%デオキシコール酸ナトリウム)を加えて、細胞を完全に溶解します。
10. 培地と粒子を含む溶解細胞サンプルを別々にフローサイトメーターで分析します。サンプルをシステムのサンプルポートにロードします。ソフトウェアを起動し、適切な取得設定を選択します。粒子解析には 明視野モード を選択します。
11. ソフトウェアの 「実行 」をクリックして、データ集録を開始します。システムがフローセルを通過する個々の粒子の画像を取得する際に、少なくとも20,000のイベントのデータを取得します。
12. 面積対アスペクト比の散布図を使用して、すべてのパーティクルをゲートします。散布図ツールを使用して、粒子数を分析します。

4. タイムラプス顕微鏡

1. 3T3-L1細胞(3.0 x 10⁴)を35 mmディッシュで2 mLのDMEMと共に2 mL、5% CO 2で5% CO₂ で70%のコンフルエントに達するまで培養します。
2. 300 μLのGB懸濁液を予熱した新鮮な2 mLの培地に十分に混合し、細胞とGBを入れた培養皿をイメージング顕微鏡ステージに置きます。
3. 10x対物レンズを選択します。ブライトボタンを使用して明視野照明をオンにします。[ムービー]ボタンをクリックして、タイムラプスモードに入ります。インターバル時間を 5 分に設定します。録音を開始して、 録音 ボタンをクリックしてください。
4. 16時間から24時間の間、5分間隔で画像をキャプチャし、_CO2 インキュベーター内の標準条件下での連続イメージングを保証します。
5. ImageJソフトウェアを使用して、キャプチャした画像をタイムラプスビデオにコンパイルします。この技術により、ファゴサイトーシスのさまざまな段階を、内在化から粒子の完全な分解まで区別することができます。

5.ニュートラルレッド染色

1. 96ウェルプレートおよびキャビティスライドで24時間の細胞増殖を行った後、GB粒子懸濁液ストックを完全に混合し、各ウェルまたはキャビティに30 μLの懸濁液を加えます。
2. 37°Cで5%_CO2 と24時間インキュベートし、液胞形成を誘導します。未処理のウェルまたはキャビティをネガティブコントロールとして使用します。
3. ニュートラルレッド(NR)染色では、無血清DMEMで0.5 mg/mL NR溶液を調製し、0.2 μmフィルターでろ過します。
4. 96ウェルプレートおよびキャビティスライド中の液胞のイメージングの場合:培地を取り出し、60 μLのNR色素を加え、37°Cで15分間インキュベートします。PBSで3回洗浄して余分な色素を取り除き、顕微鏡イメージングを進めます。
5. 20倍対物レンズを使用して顕微鏡下で液胞を検査し、液胞のサイズ、形態、および数を評価します。

6. バフィロマイシンA1による液胞形成と酸性化抑制のための治療

1. バフィロマイシンA1(BFA1)のストック溶液を100 μg/mL(160.5 nM)の濃度で調製し、100 μg/mL の BFA を 50 μL の DMSO に溶解した後、950 μL の DMEM で希釈します。このストック1 μLを1.6 mLのDMEMで希釈して、0.1 nMの作業溶液を得ます。
2. 十分に混合し、100 μLの作業用BFA溶液を96ウェルプレートの細胞を含むウェルに加えます。また、30 μLのGB粒子懸濁液を添加して、液胞およびファゴソーム形成の阻害を評価します。
3. ファゴソームの酸性化を阻害するには、あらかじめ形成された液胞(以前はGB粒子で処理)のあるウェルに、100 μLの作業BFA溶液を加えます。すべてのウェルを5%_CO2 とともに37°Cで24時間インキュベートします。
4. 各ウェルに60 μLのNeutral Red(NR)色素を加え、さらに15分間インキュベートして、液胞の形成と酸性化を分析します。

7. アクリジンオレンジ(AO)染色

1. キャビティスライドで培養した細胞を50 μLのGBで処理し、標準的な実験条件下で一晩インキュベートします。
2. 処理後、細胞をアクリジンオレンジ溶液(1 mg/mL)と15分間、37°Cでインキュベートし、液胞および酸性小胞性オルガネラの選択的染色を可能にします。
3. 滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を3回洗浄して、未結合の色素を除去し、バックグラウンド蛍光を最小限に抑えます。
4. 20倍対物レンズと450-492 nmの青色励起フィルター範囲を備えた蛍光顕微鏡でスライドを迅速に分析し、細胞の形態とアクリジンオレンジの取り込みを評価し、液胞のダイナミクスに関する洞察を提供します。

結果

この研究は、哺乳類細胞におけるGB粒子に対する主要な細胞応答を強調しています。イメージングフローサイトメーターを使用して、3T3-L1細胞におけるGB粒子の内在化を調査しました(図1)。細胞は、30分から12時間の範囲の期間、粒子に曝露されました。30分後、細胞表面上の粒子を観察し(図1B)、細胞膜が付着部位で内側に折り畳み始め、内在化の開始を示しました(図1C)。付着部位の周囲に円形の膜伸長部(おそらく食作用カップ)が形成されました(図1C)。最終的に、粒子はより大きな膜結合液胞の内部で発見され、空胞化のダイナミックなプロセスを示しました(図1D)。

私たちの以前の研究では、MTTアッセイの結果は、0〜2.5 mg / mLの濃度範囲でGodanti Bhasma(GB)による3T3-...

ディスカッション

食作用は重要な免疫防御メカニズムとして機能し、粒子、病原体、およびアポトーシス細胞の飲み込みとその後の排除を可能にします。ファゴソームの形成と成熟のプロセスを理解するためには、液胞の進行、酸性化、および巻き込まれた物質の分解などの動的事象を研究するために、高度なイメージング技術と組み合わせたスマート生体適合性粒子が不可欠である^18,19。食作用アッセイシステムには、生体適合性モデル粒子であるGBを採用しました。走査型電子顕微鏡(SEM)分析により、GB粒子は0.5〜5μmの範囲の不均一なサイズ分布を示すことが明らかになりました¹⁶。このばらつきを減らすために、懸濁液はより大きな粒子を沈降させることによって標準化され、その後のすべての実験では上部画分のみが使用されました。この方法により、粒子サイズの均一性が確保され、細胞への取り込みの一貫性が向上しました。特に、GB粒子は、細胞に細胞毒性の影響を引き起こすこと...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
25 cm2 培養フラスコ	NEST, インド	707001
96ウェルおよび6ウェルプレート	Tarsons India Pvt. Ltd.、コルカタ、インド。Thermo Scientific、インド	980040;140675
アクリジンオレンジ	SRL, インド	82407
抗生物質、トリプシンEDTA溶液	ハイメディア、インド	628242;655111
細胞株 - HeLa、3T3-L1、RAW-264.7	国立細胞科学センター(NCCS)、プネー、マハラストラ州
培養皿(35mm)	SPL Lifesciences、インド	101350
ダルベッコ'の修飾イーグル培地(DMEM)	MP Biomedicles、インド	1033126
ウシ胎児血清(FBS)	ハイメディア、インド	651257
フローサイトメーター	Millipore, アメリカ	羊膜	羊膜イメージングフローサイトメーター、
蛍光顕微鏡	DiGi Lab、インド	モデル: DiGi 110 Infinity
ゴダンティ・バスマ	パタンジャリ・アーユルヴェド	240002
ニュートラルレッド染料	CDH, インド	593630
タイムラプス顕微鏡	ナノエンテック株式会社 韓国、ソウル。	ジュリ	JuLiスマート蛍光細胞分析装置、
タイムラプス顕微鏡	リーツマイクロIMA。英国	S.No。LIM225552358A58	EA PRIME倒立顕微鏡