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方法論記事

RNA-Seqが放射線誘発性脳損傷の機序としてTh17細胞分化経路を解明

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DOI：

10.3791/68322

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2025年6月20日

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1Beijing Institute of Radiation Medicine

この記事について

サマリー

この研究は、放射線誘発性脳損傷のマウスにおけるTh17細胞分化経路の活性化を調査することを目的としています。

要約

放射線療法は、頭頸部悪性腫瘍の一般的な治療法です。しかし、それは常に正常な脳組織への放射線誘発性損傷をもたらし、放射線誘発性脳損傷(RBI)で最高潮に達します。放射線誘発性神経炎症に関する広範な研究にもかかわらず、RBIとTh17細胞分化経路との関連は十分に理解されていない。C57BL/6マウスに30Gy頭蓋照射を1回投与し、RBIモデルを構築した。認知機能は、モリス水迷路(MWM)、オープンフィールドテスト、新規物体認識テスト、およびロタロッドテストを通じて評価されました。脳組織の病理組織学的変化を、ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色を用いて解析した。免疫蛍光染色を使用して、ミクログリア(IBA-1)およびアストロサイト(GFAP)の活性化を評価しました。RNAシーケンシングは、発現差のある遺伝子を同定するために行われ、Simple WesternおよびqPCRは、Th17細胞分化に関与する主要なシグナル伝達分子を調べるために利用されました。RBIマウスは、特に空間学習と記憶保持において顕著な認知障害を示しました。組織学的検査では、放射線照射を受けたマウスの皮質および海馬内でのミクログリアおよびアストロサイトの活性化が示された。RNAシーケンシング解析により、RBIグループの皮質におけるTh17細胞分化経路の有意な濃縮が同定されました。Simple WesternおよびqPCR解析によるさらなる検証により、RBIマウスの皮質における TGF-β、 IL-6、 RORγt、 IL-17、および P-STAT3 のアップレギュレーションが確認されました。これらの知見は、Th17細胞分化経路が放射線誘発性脳損傷の病因に極めて重要な役割を果たしていることを示唆しています。Th17細胞が介在する神経炎症は、放射線誘発性認知機能障害の根底にある重要なメカニズムである可能性がある。

概要

放射線療法は、原発性および転移性頭頸部腫瘍の両方にとって重要な治療法ですが、放射線誘発性脳損傷(RBI)は、中枢神経系の損傷を特徴とする重篤な合併症として発生する可能性があります。RBIの発生率は腫瘍の種類と治療法によって異なり、報告された率は、髄膜腫1の定位放射線療法後の28%〜50%、鼻咽頭がん2,3の1.9%〜5%、低悪性度の神経膠腫4,5の1%〜24%、および脳転移の8%〜20%の範囲です6,7.RBIは、急性型、早期遅延型、遅発型に分類され、認知機能障害、特に記憶障害、および学習障害は遅発型で顕著です。放射線誘発性認知機能障害(RICD)は、頭頸部がんの長期生存者の50%から90%が罹患しており、生活の質に大きな影響を与えている8が、その病因は未だによく理解されておらず、効果的な予防・治療戦略が不足している。

神経炎症はRBIの重要な病理学的特徴であり、血液脳関門の混乱を悪化させ、海馬の神経新生を妨げます。Th17細胞は、炎症誘発性サイトカインIL-179を産生することで知られるCD4+ T細胞のサブセットであり、多発性硬化症やパーキンソン病10,11を含むさまざまな神経変性疾患に関連しています。これらの細胞は、特定の炎症条件下では、血液脳関門を通過し、神経炎症に寄与する可能性があります12。2005年の発見以来、Th17細胞は、病原体に対する免疫応答と炎症性疾患への関与の両方における役割で注目を集めており、RBIおよび関連する認知機能障害のメカニズムを研究するための潜在的な標的となっています13。

この研究では、オスのマウスのみを使用しました。女性の除外は、プロゲステロンレベルが周期の異なる段階で最大10倍変動する可能性があるため、発情周期に関連する神経炎症性変動から生じる潜在的な交絡効果を回避することを目的としていました14。さらに、私たちの実験モデルは、患者の約72%が男性15歳である頭頸部がん放射線療法の臨床状況を反映するように設計されました。これと一致して、放射線誘発性脳損傷(RBI)のメカニズムを調査した発表された研究の大部分は、ベースラインの病理学的特徴を確立するために雄のげっ歯類を利用しています16。

RBIの研究にはさまざまなモデルが採用されていますが、病理組織学的染色や単純なウェスタンブロッティングなどの従来の方法論は、感度、スループット、および精度の点で制限に直面しています17。RNAシーケンシング(RNA-Seq)やハイスループットプロテオミクスなどの最近の進歩により、RBI18の根底にある分子メカニズムについてより堅牢な洞察が得られました。これらの技術により、遺伝子発現の変化とタンパク質の変化を包括的に理解することができ、以前の方法よりも正確なデータが得られる19。特にSimple Westernは、キャピラリー電気泳動の利点と化学発光によるタンパク質検出を組み合わせた新しい自動化技術であり、最小限のサンプル量でハイスループット分析を促進し、再現性を向上させます20。従来のウェスタンブロッティングと比較して、Simple Westernは膜転写の必要性を排除し、定量的なタンパク質発現データを提供し、特に低存在量のタンパク質検出において、感度と再現性の点でいくつかの利点を提供します21,22。

RNAの抽出と調製に関する実用的なガイドラインは、高品質なシーケンシングと定量を成功させるために重要です。最適なRNA抽出のためには、高品質のRNA単離キットを使用し、濃度が100〜1000 ng/μLの範囲に収まり、RNA完全性数(RIN)が7.0を超えることを確認して劣化を防ぐことをお勧めします。Simple Westernを使用してタンパク質分析を行う場合、タンパク質サンプルが適切に変性し、キャピラリーあたり約1〜5 μgの濃度でロードされていることを確認することが重要です。qPCRの検証には、少なくとも1 μgのRNAから合成された高品質のcDNAを使用し、一貫した逆転写条件を確保します。ゲノムDNAによる汚染やRNA分解など、RNA調製における一般的な落とし穴は、RNAseフリーの装置を使用し、RNA分解を防ぐために迅速に相分離を行うことで回避する必要があります。

これらの方法を取り入れることにより、この研究は、Th17細胞分化経路がRBIのマウスモデルで活性化されるかどうか、およびそれが放射線誘発性認知機能障害の病因にどのように寄与するかを調査することを目的としています。

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プロトコル

ここで行われる実験手順は、ARRIVEガイドライン(Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments)に厳密に準拠しています。承認は、北京原爆薬医学研究所の動物施設管理委員会から取得されました(承認番号。AF/SC-08/02;日付:2024年2月25日)。

1. マウスの頭蓋照射

  1. 研究では、6〜8週齢の雄C57BL / 6マウスの合計10匹を使用し、5匹の動物をRBIグループに割り当て、5匹を対照群に割り当てました。マウスは、温度、湿度、12時間の明暗サイクルなど、制御された環境条件下で維持します。実験を開始する前に、マウスを1週間順応させます。
  2. 50 mg / kg体重で1%ペントバルビタールナトリウムの腹腔内注射を使用して動物に麻酔をかけます。しっかりとした足のつまみに対する反射的な反応がないことを確認して、適切な麻酔を確認します。麻酔開始直後に獣医用眼軟膏を両眼に塗布し、角膜の乾燥を防ぎます。
  3. 専用の木製拘束装置を使用して動物を腹臥位に置き、体の非標的領域を厚さ3 mmの鉛(Pb)シールドプレート(純度99.9%)で覆って、局所的な照射を確保します。
  4. 2 x 2 cm2の照射フィールドを固有のろ過(1.5 mm Al + 0.25 mm Cu)でコリメートします。統合されたレーザー十字線(λ = 635 nm ± 0.5 mmの精度)を使用して視野を頭蓋正中線に位置合わせし、統合されたCMOSカメラシステムとIRバックライトでリアルタイムの位置決めを確認します。X-RAD 320システムを使用して、320 kVp/12.5 mA、SSD = 50 cmのパラメータで、頭蓋領域に1.325 Gy/minの30 GyのX線を1回照射します。
  5. アイソセンターに配置されたトレーサブルなイオン化チャンバーを使用して、毎週のドーズキャリブレーションを実施します。3.2 mm Cu HVLろ過により、ビームパラメータを320 kVp/12.5 mAに維持し、1.325 Gy/min(± 3%の変動)の線量率を達成します。Gafchromic EBT3フィルムを使用して、ビームの均一性を毎日(フィールド内で>95%)確認します。
  6. メロキシカム(1-2 mg / kg、皮下)を1日1回3日間投与して、術後の痛みを管理します。.動物を事前に温めた回復室に入れ、動物が完全に意識を取り戻し、胸骨の横臥を維持できるようになるまで継続的に監視します。回復期間中、動物を放置しないでください。
  7. 研究全体を通して、すべてのマウスの体重を毎週記録します。マウスを1週間の順応と照射後3週間の合計4週間観察します。

2. 動物行動解析

  1. RBIの3週間後に行動実験を行います。
  2. モリス水迷路
    1. 円形のプール(直径:120 cm、高さ:50 cm)に不透明な水(20-22 °C)を粉ミルクで満たし、水没したプラットフォームを隠します。水面から1cm下に隠しプラットフォーム(直径10 cm)を固定象限に配置します。
    2. 試験前に少なくとも30分間マウスを試験室に順応させます。トレーニングフェーズを開始するには、各マウスを4つの擬似ランダムに選択された開始点(N、S、E、W)のいずれかから水中に配置します。
    3. マウスを最大60秒間泳がせて、隠されたプラットフォームを見つけます。マウスが 60 秒以内にプラットフォームを見つけられなかった場合は、マウスをプラットフォームに誘導し、15 秒間そのままにします。
    4. マウス1匹につき1日4回の試行を、15分間の試行間隔で行います。低体温症を防ぐために、試験の合間に温かいタオルで各マウスを完全に乾かします。学習習得を評価するために、5日間連続してトレーニングを続けます。
    5. プローブの試用日には、プラットフォームを取り外し、マウスが60秒間自由に泳ぐのを待ちます。ターゲット象限で費やした時間、プラットフォームの交差、スイム パスなどのパラメーターを記録します。
    6. 自動ビデオ追跡システムを使用してすべての試験を追跡および分析し、実験者はグループの割り当てを知らされていません。
  3. オープンフィールドテスト
    1. 実験の少なくとも30分前にマウスを試験室に順応させます。不透明なプラスチック製のオープンフィールド装置(50 cm x 50 cm x 40 cm)を使用してください。アリーナを均一に照らし(通常は25〜30ルクス)、強い影を避け、ストレスを最小限に抑えます。
    2. 各動物をテストする前に、70%エタノールでアリーナを清掃して、臭いの手がかりを排除します。マウスをオープンフィールドの中央にそっと置いて、テストを開始します。マウスがアリーナを10分間自由に探索できるようにします。
    3. 自動追跡システムを使用して、自発運動の活動と位置を記録します。中央ゾーンを総面積の内側の20%〜25%として定義します。中央ゾーンで費やした時間と移動した合計距離を測定します。
    4. セッション後、マウスをホームケージに戻し、装置を完全に清掃します。
  4. 新しい物体認識テスト
    1. 実験の少なくとも30分前にマウスを試験室に順応させます。均一な照明(20〜30ルクス)を備えたオープンフィールドアリーナ(50 cm x 50 cm x 40 cm)を使用します。動物の間に70%のエタノールを入れてアリーナを徹底的に洗浄し、嗅覚の手がかりを排除します。
    2. 各マウスを空のアリーナに配置し、10分間自由に探索できるようにします。このフェーズ中は、物を置かないでください。
    3. 24時間後、2つの同一のオブジェクト(AとA ')をアリーナの反対側の角(壁から少なくとも8 cm)に配置します。マウスをアリーナの中央にそっと置き、10分間探索させます。
    4. 自動ビデオシステムを使用してオブジェクトのインタラクションを記録します。オブジェクト探索は、マウスの鼻がオブジェクトから 2 cm 以内にあり、オブジェクトに向けられていると定義します。
    5. 試用後、マウスをホームケージに戻し、アリーナとオブジェクトを清掃します。
    6. 1時間の保持間隔の後、1つのおなじみのオブジェクト(A)と1つの新しいオブジェクト(B)を同じ位置に置きます。マウスをアリーナに戻し、5分間探索します。
    7. 以前と同じ基準を使用して各オブジェクトの探索に費やした時間を記録します。認識インデックスを次のように計算します。
      認識指数(%)=[新規物の時間/(新規物+身近な物の時間)]×100
  5. ロタロッド試験
    1. 試験の少なくとも30分前にマウスを試験室に順応させます。ロッドの直径が~3 cm、ベースからの高さが~30 cmの電動ロータリー装置を使用してください。
    2. 回転モードを加速速度(4rpmから40rpmまで5分間)に設定します。各マウスを配置する前に、ロッドの表面を70%エタノールで清掃してください。
    3. マウスを回転ロッドの中央に、前を向いてそっと置きます。回転を開始し、すぐにタイミングを開始します。
    4. システムによって自動的に低下する遅延を記録します。怪我をしないように、落下時にマウスを安全にキャッチしてください。疲労を防ぐために、トライアルとトライアルの間に少なくとも15分の休憩時間を確保してください。
    5. 1 マウスあたり 1 日あたり 3 回連続して試行を行い、最終結果として遅延を平均化します。すべてのテストが、盲目の実験者が一貫した条件下で実施していることを確認します。テスト後、マウスをホームケージに戻し、装置を完全に消毒します。

3.動物の安楽死とサンプル調製

  1. RBIの5週間後に組織サンプルを採取します。
  2. ペントバルビタールナトリウム(100 mg / kg)と滅菌シリンジを準備します。.ペントバルビタールナトリウムを腹腔内に注射します。.マウスの呼吸が止まり、心拍が止まるのを待って、死亡を確認します。
  3. 後頭接合部で迅速に斬首し、細いハサミを使用して頭蓋縫合糸を矢状に切開し、その後、髄膜の完全性を維持しながら湾曲した鉗子で両側頭蓋フラップを慎重に持ち上げてから、神経接続を切断します。
  4. 無傷の脳を60秒以内に予め冷却したマトリックスに移し、滅菌済みのカミソリの刃を使用して中矢状二分術を行います。精密な計装で、前後寸法(8.2 ± 0.3 mm)、中外側幅(4.5 ± 0.2 mm)、組織質量(112 ± 8 mg)をすぐに記録します。
  5. 氷の上で皮質組織と海馬組織を解剖します。左半球を液体窒素で急速凍結し、RNAシーケンシング、qPCR、およびSimple Westernを行います。
  6. 組織学のために右半球を4%パラホルムアルデヒド(PFA)に固定します。等級付けされたエタノールで固定された脳を70%から100%に脱水し、各ステップは30分間続きます。
  7. キシレンで脳を2時間取り除きます。溶融パラフィンを60°Cで4時間組織に浸潤します。透明化した脳をパラフィンブロックに埋め込み、室温で固化させます。ミクロトームを使用して冠状切片を5μmの厚さで切断します。

4. ヘマトキシリンおよびエオシンの染色

  1. スライドをキシレンに5分間、3回浸すことにより、組織切片を脱パラフィンします。等級付けされたエタノールシリーズ(100%、95%、70%、蒸留水)で切片をそれぞれ5分間再水和します。
  2. 切片をヘマトキシリンで5分間染色します(希望の染色強度に応じて)。流水で切片を5分間すすぎ、余分なヘマトキシリンを取り除きます。
  3. エタノール中の1%塩酸中の切片を数秒間区別して、目的のコントラストを実現します。水道水で5分間再度すすいでください。切片をエオシンで1分間染色します。
  4. 切片を蒸留水で短時間すすぎます。等級付けされたエタノールシリーズ(70%、95%、100%)で切片をそれぞれ5分間脱水します。
  5. キシレンの切片を5分間、3回クリアします。封入剤を使用して、カバースリップでセクションを取り付けます。20倍の対物レンズを備えたNikon Eclipse Ni-U顕微鏡を使用して画像を取得します。

5. 免疫蛍光

  1. スライドを4% PFAに室温で15分間浸漬して組織を固定します。スライドをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で5分間、3回洗浄し、余分なPFAを除去します。
  2. 0.3% Triton X-100とスライドをPBS溶液で室温で10分間インキュベートすることにより、組織を透過化します。スライドを5%正常血清と室温で1時間インキュベートすることにより、非特異的結合をブロックします。
  3. 一次抗体IBA-1およびGFAPとインキュベートし、ブロッキングバッファーで希釈し、希釈率1:2000で、抗体の仕様に応じて4°Cで一晩保存します。スライドをPBSで5分間、3回洗浄し、結合していない一次抗体を除去します。
  4. Alexa Fluor 488に結合したヤギ抗ウサギIgG二次抗体とインキュベートし、暗所で室温で1:1000で希釈します。スライドをPBSで5分間、3回洗浄し、余分な二次抗体を除去します。
  5. DAPIを含む色あせ防止封入剤でスライドをマウントします。カバースリップを透明なマニキュアで密封します。
  6. 20倍対物レンズを備えた共焦点顕微鏡システムを使用して蛍光画像を撮影します。
  7. ImageJを使用して蛍光強度を定量化します。ImageJのAnalyze Particlesツールを使用して、サイズしきい値を50-200 μm2(ミクログリア)および100-500 μm2(アストロサイト)で定量分析します。ローリングボールアルゴリズムを使用して背景を減算します(半径= 50ピクセル)。

6. qPCR解析

  1. RNA抽出キットを使用して、組織から全RNAを抽出します。ホモジナイズ、溶解、およびRNA精製については、メーカーのプロトコールに従ってください。
  2. 分光光度計を使用して抽出したRNAを定量し、濃度を測定し、純度(A260/A280比)を評価します。RNA濃度がcDNA合成に適していることを確認してください(100-500 ng/μL)。
  3. バイオアナライザーを使用してRNAの品質を評価します。RNAが分解を示さず(18Sおよび28S rRNAのシャープバンド)、RNA完全性数(RIN)が7を超えていることを確認してください。
  4. 1 μgのRNA、逆転写バッファー、オリゴ-dT、dNTP、RNase阻害剤、および逆転写酵素を含む20 μLの反応混合物を調製します。
  5. 42°Cで60分間インキュベートし、cDNAを合成します。85°Cで5分間加熱して、逆転写酵素を不活性化します。
  6. cDNA、マスターミックス、フォワードプライマー、リバースプライマー(表1)、およびヌクレアーゼフリー水を96ウェルPCRプレートに組み合わせます。反応20 μLあたり2 μLのcDNAを使用し、最終プライマー濃度を200 nMに保ちます。プレートを光学接着フィルムでシールし、蒸発を防ぎます。
遺伝子プライマー配列(5'-3'、順方向/逆方向)
TGF-β1CCACCTGCAAGACCATCGAC
CTGGCGAGCCTTAGTTTGGAC
TGF-β3GGACTTCGGCCACATCAAGAA
タグガックグトキャットカック
IL-6CTGCAAGAGACTTCCATCCAG
AGTGGTATAGACAGGTCTGTTGG
RORγt(ロルγt)TCCACTACGGGGTTATCACCT
AGTAGGCCACATTACACTGCT
IL-17AのTCAGCGTGTCCAAACACTGAG
CGCCAAGGGAGTTAAAGACTT
IL-17FTGCTACTGTTGATGTTGGGAC
CAGAAATGCCCTGGTTTTTTTTの
ガプドAGGTCGGTGTGAACGGATTTG
GGGGTCGTTGATGGCAACA

表1:qPCR配列プライマー。

  1. 反応プレートをリアルタイムPCR装置にセットし、サーマルサイクラーをプログラムします。次のサイクル条件を使用します:最初の変性を95°Cで3分間行い、その後、95°Cで15秒間、60°Cで30秒間のサイクルを40回繰り返します。
  2. 標的遺伝子の発現を GAPDHに正常化します。ΔΔCt法を使用して相対的な発現レベルを計算し、データを制御グループと比較したフォールド変化として表示します。

7. RNAシーケンシング解析

  1. 施設の動物管理プロトコルに従ってマウスに麻酔をかけ、安楽死させます。すぐに冷たいPBSで灌流して、循環血液を取り除きます。
  2. 氷の上で脳を解剖します。滅菌解剖ツールを使用して大脳皮質を分離します。RNAの完全性を維持するために、解剖時間を最小限に抑えます。
  3. 皮質組織を液体窒素で瞬間凍結します。RNA抽出をすぐに行わない場合は、-80°Cで保存してください。
  4. 凍結皮質(30〜50 mg)を電動ホモジナイザーを使用して、目に見える断片が残らなくなるまで、1 mLのRNA抽出試薬でホモジナイズします。
  5. クロロホルム相分離を行います。200 μLのクロロホルムを加え、15秒間激しく振とうし、室温で2〜3分間インキュベートした後、12,000 x g で4°Cで15分間遠心分離します。
  6. 上層を新しいチューブに移し、等量の70%エタノールを添加し、シリカカラムベースのキットを使用してRNA精製を進めます。
  7. オンカラムDNase消化法を使用して、RNA精製中にゲノムDNAを除去します。30-50 μLで全RNAを採取し、すぐに使用するために氷上に保管してください。
  8. 分光光度計を使用して、RNAの濃度と純度を定量化します。A260/A280の比率が~2.0であることを確認します。1 μL の RNA をバイオアナライザーで分析します。シーケンシングのために RIN が 8.0 より大きいことを確認します。
  9. ポリ(A)選択プロトコルとストランドライブラリー調製キットを使用してください。製造元のプロトコルに従って、300-400 bp のライブラリを生成します。市販のキットで図書館を精製します。
  10. Bioanalyzerを使用してフラグメントサイズを確認し、プールライブラリで等量します。Illuminaプラットフォームを使用してペアエンドシーケンシング(2x、150 bp)を実行します。
  11. Trim Galoreを使用してアダプターをトリミングし、FastQCで品質を評価し、STARを使用してリードをマウスゲノム(GRCm39)にアライメントし、featureCountsで遺伝子発現を定量化します。DESeq2を用いて発現差のある遺伝子を同定します。
  12. DESeq2 からの出力を使用し、有意に差出して発現する遺伝子 DEG をフィルタリングします (調整された p 値 0.05 および |log2FC| > 1) <)。超幾何試験に基づいて、Phyperを使用してGOおよびKEGG経路エンリッチメント解析を実行します。補正された P 値が 0.05 ≤経路を統計的に有意であると特定します。

8. シンプルな西洋分析

  1. マウス大脳皮質をプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含むRIPAバッファーでホモジナイズし、次いで12,000 x g で4°Cで10分間遠心分離してデブリを除去します。BCAアッセイを使用してタンパク質濃度を測定します。
  2. タンパク質サンプルをサンプルバッファーと混合し、95°Cで5分間インキュベートしてタンパク質サンプルを変性させ、完全な変性を確保します。
  3. 3 μLの変性タンパク質サンプルをSimple Westernキャピラリーにロードします。オーバーフローを防ぐために、サンプルが適切にロードされていることを確認してください。キャピラリーをSimple Western機器に入れます。
  4. 分離したタンパク質を、p-STAT3、STAT3、RORγt、TGF-β、IL-6、IL-17などの1:50希釈一次抗体と30分間インキュベートします。
  5. キャピラリーシステムを洗浄バッファーで洗浄し、それぞれ5分間の3回の洗浄を行い、結合していない一次抗体を除去します。ブロッキングバッファーで希釈したHRP標識二次抗体を添加し、30分間インキュベートします。
  6. 洗浄バッファーを用いて各5分間の洗浄を3回行い、余分な二次抗体を除去します。Simple Westernシステムで検出プログラムを実行すると、化学発光を使用してタンパク質が自動的に検出されます。
  7. Compass for Simple Westernソフトウェアを使用してデータを分析します。エレクトロフェログラムの相対的なピーク面積を比較することにより、タンパク質発現を定量化します。データをGAPDHタンパク質に正規化します。

9. 統計分析

  1. GraphPad Prism 9.0.0 を開きます。ソフトウェア。データの読み込みのために 、[ファイル] > [データのインポート ] をクリックします。データを平均±SDとして提示し、2つのグループ間の比較には対応のないt検定を使用します。
  2. Shapiro-Wilk 検定を使用して正規性を評価します。正規性に違反している場合(p < 0.05)、グループ間比較にマンホイットニーU検定を適用します。正規性が満たされる場合 (p ≥ 0.05)、独立サンプルの t 検定を実行して、グループの差を評価します。
  3. 結果を p 値でレポートします。0.05

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結果

RBIマウスの認知障害
30Gyの全脳放射線へのばく露後、マウスの体重を毎週モニターした。認知機能は4週目に 評価されました(図1A)。初期測定では、対照群と打点群の体重は類似していることが示されました。しかし、照射後1週間から3週間の間に、RBIグループは体重の有意な減少を示し(図1B)、全脳照射がマウスの成長と発達に悪影響を与えることを示しました。

モリスウォーターメイズ(MWM)のテスト結果は、対照群の脱出潜伏が時間の経過とともに徐々に減少することを示しましたが、RBI群は脱出時間に有意な変化を示さなかった(図1C)。重要なことに、2つのグループ間のエスケープレイテンシの有意差は、テストの4日目と5...

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ディスカッション

プロトコル内の重要なステップ
このプロトコルには、マウスでのRBIの誘導が含まれ、続いて神経炎症とTh17細胞分化経路の包括的な評価が行われます(図6)。重要なステップは、C57BL/6マウスに30Gy線量を頭蓋に照射することであり、これはRBI1の確立されたモデルです。イオン化チャンバーを使用した正確な線量校正により、再現性が保証されます28。MWMを含む行動アッセイは、認知障害を評価する29が、RNAシーケンシングは、遺伝子発現の変化、特にTh17細胞分化経路の活性化30に関する洞察を提供し、RBI8の詳細な分子的理解を提供する。

技術の変更とトラブルシューティ...

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開示事項

著者は、宣言する利益相反を持っていません。

謝辞

この研究は、北京原爆薬医学研究所によって支援されました

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
12-230 kDa 分離モジュール、8 x 25 キャピラリーカートリッジProteinSimpleSM-W004SimpleWestern
抗 GAPDH 抗体ProteintechHRP-600041:500 希釈/抗体 SimpleWestern
抗 GFAP 抗体Abcamab72601:2000 希釈/抗体 免疫蛍光
anti-IBA-1 抗体Abcam ab1788461:2000 希釈/抗体 免疫蛍光
抗 IL-17 A/F 抗体ThermoMA5-237481:10 希釈/抗体 SimpleWestern
抗 IL-1&β; 抗体CST122421:50 希釈/抗体 SimpleWestern
抗 IL-6 抗体ThermoMA5-238001:5 希釈/抗体 SimpleWestern
抗マウス検出モジュールSimpleWestern
抗P-STAT3(Try705)抗体ThermoMA5-151931:2希釈/SimpleWestern
抗ウサギ検出モジュール抗体 ProteinSimpleDM-001SimpleWestern
anti-ROR&gamma用二次抗体;SimpleWestern
抗STAT3抗体Thermo7100771:20希釈/SimpleWestern
抗TGF抗体 &β;-1,2,3ThermoMA5-237951:10希釈/SimpleWestern
BACアッセイ抗体 ThermoA55860タンパク質アッセイEZ
スタンダードパック1 12-230 kDaProteinSimplePS-ST01EZ-8SimpleWestern
ヤギ抗ウサギIgG H&LAbcamab1500771:1000 希釈/抗体 免疫蛍光
RNeasy KitQiagen74134RNA Extraction
SuperScript IV First-Strand Synthesis SystemThermo Fisher Scientific18091050Reverse Transcription
SYBR Green Master MixTakara Bio RR820AQ-PCR
トリゾール試薬Invitrogen15596026RNA 抽出
用用1:5希釈/抗体 抗体 用用

参考文献

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