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方法論記事

網膜色素変性症マウスモデルにおける光受容体の変性および保存の解析

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DOI：

10.3791/68324

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2025年7月22日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Neural Development and Regeneration Laboratory, Department of Neurobiology, Science and Biotechnology Graduate Program, Institute of Biology, Fluminense Federal University, 2Neural Development and Regeneration Laboratory, Department of Neurobiology, Neuroscience Graduate Program, Institute of Biology, Fluminense Federal University, 3Instituto Estadual de Hematologia Arthur de Siqueira Cavalcanti (HEMORIO)

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

このプロトコルでは、網膜色素変性症のマウスモデルにおける光受容体の変性および保存を分析するための最適化された技術を概説しています。これには、硝子体内薬物投与、クライオスタット切片化、免疫蛍光などがあります。この方法は、網膜の完全性を確保し、治療的介入の有効性に関する定量的データを提供します。

要約

網膜症は、世界中で何億人もの人々が罹患しており、視覚障害や失明の重大な原因となっています。中でも網膜色素変性症(RP)は進行性の網膜変性を特徴とする遺伝性の眼疾患で、全世界で約150万人から200万人が罹患しています。遺伝性網膜ジストロフィーの動物モデルにおける概念実証研究は、疾患の病態生理学的メカニズム、治療の有効性、および安全性に関する研究のエビデンスの重要な基礎を形成します。マウスへの硝子体内注射とクライオスタット切片作製は、硝子体液への物質の正確な送達と網膜変化の詳細な分析のための高品質の組織学的サンプルの調製を可能にするため、RPモデルでの薬物効果を調査するために広く利用されている技術です。また、レフォルメリンに対する抗体を用いた免疫蛍光法による細胞カウントは、網膜光受容体で発現するカルシウム依存性タンパク質であり、最近、RPモデルの網膜変性に関連する細胞変化を研究するために採用されています。これは、このアプローチにより、治療介入後の光受容体喪失と細胞保存の可能性の評価を容易にするためです。硝子体内注射は、眼の完全性と信頼性の高い結果を確保するために最適化されており、細い針を使用して溶液を硝子体チャンバーに投与します。薬物効果を評価するための事前定義された期間の後、組織学的処理が行われ、クライオスタットを使用してサンプルを厚さ10 μmで切片化した後、回収型抗体による免疫蛍光標識が行われます。最後に、細胞計数を行い、光受容体の保存によって証明されるように、薬物による治療が保護効果を発揮したかどうかを評価します。これらの技術は、網膜症の研究で一貫したデータを生成するために広く適用されてきましたが、正確な組織の取り扱いと処理品質を達成するには依然として課題があります。このプロトコルは、硝子体内注射から組織切片の準備まで、各ステップを最適化するための標準化されたアプローチを提供し、再現性のある高品質の結果を保証します。

概要

視覚は、感覚系の最も複雑な感覚の1つであり、環境の視覚刺激を捉えて電気化学信号に変換し、脳内で処理して画像を形成するために不可欠です。老化、遺伝的欠陥、病気など、さまざまな生物学的要因が視力を損ない、生活の質や日常生活に大きな影響を与える可能性があります。

人間の目は、3つの主要な部屋で構成されています。角膜と強膜によって形成される外層は、眼球を構造的に支えます。中間層には、虹彩、毛様体、および脈絡膜が含まれ、脈絡膜は光受容体に血液を供給する役割を果たします。最後に、内層は網膜を含み、光刺激を処理し、光を脳に送られる電気信号に変換して画像形成を行う構造です1,2。

神経網膜は、光受容体、双極細胞、水平細胞、アマクリン細胞、神経節細胞などの特殊な細胞を含むいくつかの細胞層で構成されています。さらに、網膜には、ミクログリア、アストロサイト、ミュラー細胞などのグリア細胞と、色素性上皮細胞が含まれています。後者は網膜の非神経部分に位置し、構造的完全性、保護、および光受容体3,4のサポートを維持する上で重要な役割を果たします。神経部分は、光の捕捉と処理に直接関与する感覚細胞とニューロン細胞を収容しています5,6,7。

視力に不可欠であるため、網膜はしばしば失明につながる可能性のある病状の影響を受けます。これらの状態の中で、網膜色素変性症(RP)は主要な遺伝性網膜症の1つとして際立っており、その病因には80を超える遺伝子が関連しています8,9。RPは不均一な疾患であり、主に常染色体優性または劣性で遺伝しますが、X連鎖として、または自然突然変異によって発生することもあります10。

人口と地理的地域にもよりますが、世界の有病率は3,000人に1人から7,000人に1人と推定されています11,12、RPは通常、青年期または成人期初期に現れ、夜間視力の低下や周辺視野の喪失などの初期症状を伴います。病気が進行すると、中心視力が損なわれ、完全な失明につながる可能性があります9,13。

RPの治療法はまだありませんが、開発中のさまざまな治療法が、疾患の進行を遅らせたり逆転させたりする可能性を示しています。これらのアプローチの中には、遺伝学的、細胞的、薬物学的治療、および電子デバイスがあります。RPの理解を深め、新しい介入を評価するために、網膜変性のマウスモデルが広く使用されています。これらのモデルは、しばしばrd(網膜変性症)と呼ばれ、RPの分子基盤と治療法を研究するための貴重なツールです。網膜色素変性症の研究に用いられた種々のモデルの中で、Pde6βrd10/rd10 (rd10)マウス系統は、ホスホジエステラーゼ14の桿体特異的βサブユニットをコードする遺伝子にミスセンス変異を示し、ヒト15で起こるのと同様の光受容体のゆっくりとした変性を示す。

硝子体内薬物投与は、さまざまな研究で広く使用されています16,17,18。このプロトコルは、特に光受容体細胞の生存に関して、網膜に対する薬物効果を研究する研究者に適しています。このように、このプロトコルの主な目的は、網膜色素変性症 (RP) のマウスモデルにおける硝子体内注射による薬物送達を最適化し、光受容体細胞マーカーであるリカバリーインの免疫蛍光法を使用して光受容体の生存率を評価することです。硝子体内注射は、局所的な薬物投与を可能にし、全身の副作用を最小限に抑え、網膜のバイオアベイラビリティを高め、他の臓器への悪影響を軽減します。一方、リペアリンの免疫蛍光法は、光受容体の生存率の特異的な分析を可能にし、この治療戦略の有効性を評価するための効果的なツールを提供します。ただし、その適用性は、動物モデルの選択、注入精度、治療期間などの要因に依存するため、この方法を他の実験環境に適応させる際には、これらの要素を考慮する必要があります。

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プロトコル

プロジェクトとその中に実施されるすべてのプロトコルは、全米動物実験管理評議会の動物管理ガイドラインに従っており、動物使用倫理委員会(CEUA - UFF)によって1464280219番号で承認されました。

1. 動物たち

  1. 光受容体変性を起こすrd10マウス系統と、rd10の背景であるC57 Black/6系統を使用してください。これらの株を12時間/12時間の明暗サイクルで維持し、水と食物に 自由 にアクセスできます。

2.麻酔

  1. 蒸留水で希釈した80 mg / kgのケタミンと8 mg / kgのキシラジンの用量で調製した麻酔薬を使用して腹腔内注射を行います。.ケタミンはN-メチル-D-アスパラギン酸受容体(NMDA)受容体阻害剤として作用し、鎮痛効果を提供し、キシラジンは麻酔鎮静剤として機能します。
  2. 腹腔内注射の場合、注入する容量を 10 μL x 重量 (g) として計算します。
  3. マウスを拘束して、腹部にはっきりとアクセスできるようにします。腹腔の右下の象限を70%アルコールで洗浄し、ベベルを上に向けて針を挿入する必要があります。
  4. 痛みの反射がないことを確認するために、動物の尻尾または足をそっとつまみます。反応がない場合、これは動物が適切に麻酔されていることを示しています。

3.硝子体内注射。

  1. 動物に麻酔をかけた状態で、目を露出させ、倍率10倍の双眼実体顕微鏡を使用して、注射が行われる角膜と強膜の間の灰色の帯である辺縁部を特定します。
  2. 注射を行うには、他の人の助けが必要です。双眼実体顕微鏡では、1人が動物を保持して針を挿入し、アシスタントがシリンジプランジャーを押して物質を目に挿入します。
  3. まず、針が固定された超極細注射器(31 G x 6 mm)を使用して、針を深く挿入しないように注意しながら、輪部に穴を開けます。ベベルの半分だけを挿入するだけで十分です。
  4. 次に、目的の液体/薬物1μLを含むハンドヘルド滅菌済みマイクロシリンジ(ベベルなしのゲージ26 S)を、インスリンシリンジによる穿刺に挿入します。
  5. アシスタントにシリンジプランジャーをゆっくりと押してもらい、全容量が約30秒にわたって投与されるようにします。
  6. 同じ動物のもう一方の目についてもこのプロセスを繰り返し、時間を記録します。
  7. 実験グループが複数ある場合は、各グループが適切に識別されるように、動物の耳に印を付けます。
  8. 動物の各眼に0.01 M PBS溶液を1滴使用して、乾燥を防ぎます。
  9. これらの手順の後、動物が目を覚ますまで、温度を37°Cに設定した加熱パッドに置きます。1〜2時間かかる場合があります。麻酔をかけられている間、動物を継続的に監視し、目覚めたら、分析の時までケージに戻します。
  10. トリパンブルーなどの可視色素を使用して初期トレーニングセッションを実施し、オペレーターがマウスでの硝子体内注射技術を洗練できるようにします。
    注:この色素は針の経路の視覚化を容易にし、注射の深さと角度を正確に調整できるようにし、眼の構造を損傷するリスクを減らし、手順の安全性を高めます。

4.安楽死と目の準備

  1. 注射後の特定の治療期間の後、5%イソフルランの過剰摂取を吸入して動物を安楽死させます。.呼吸が止まってから少なくとも1分後まで曝露を続けます。.死を確実にするために、首の後ろで動物を保持し、頸部脱臼が達成されるまで尾にしっかりと牽引を加えます。
  2. 目を取り外す前に、側頭極をマークします。マーカーまたはホットニードル/ピンを強膜の側頭領域に慎重に適用し、マーキングが目に見えて正確であることを確認します。このステップは、セクショニングプロセス中のオリエンテーションの基準点として機能します。
  3. 次に、目を露出させ、滅菌メスと虹彩切除はさみで周囲の組織を切断して結合組織と筋肉組織を分離し、眼球を露出させます。マウスでは、目の筋肉を慎重に解剖しますが、これは難しい場合があるためです。手順を容易にするために、目の皮膚の両側の角に滅菌メスを使用して横切開を行います。
  4. 中先端の湾曲した鉗子を使用して、視神経で目を押さえて眼窩から目をそっと取り除き、すぐに組織を室温(RT)の4%パラホルムアルデヒド(PFA)溶液に5分間固定します。
  5. PFA溶液に固定した後、中先端湾曲鉗子を使用して眼球をガラス板に移します。このプレートは解剖プラットフォームとして機能し、0.1 M pH 7.4の濃度でリン酸緩衝液が含まれていることを確認します。
  6. 次に、プレートを倍率10倍の双眼実体顕微鏡の下に置き、メスを使用してリンバス(角膜境界)のすぐ上に小さな切開を行います。その後、角膜を分離するために、マイクロイリデクトミーハサミでリンバスに続いて円周方向のカットを行います。
  7. 角膜を、虹彩とレンズとともに、デュモン#5鉗子を使用して取り外します。最後に、4%PFAの溶液に55分間眼を再び固定します。この後、リン酸緩衝液0.1M、pH7.4で目を3回洗います。

5. 凍結保存と凍結

注:網膜組織クライオスタット切片化は、いくつかの調整19を伴って、前述のように実施された。

  1. 10%、20%、および30%のショ糖勾配を0.1 Mリン酸緩衝液、pH 7.4で希釈して眼を凍結保存します。スクロース溶液に目を順番に浸し、最低濃度(10%)から始めて徐々に最高濃度(30%)まで増やします。各ステップは、目が容器の底に落ち着くまで必要な時間続き、次の濃縮を使用できることを示します。最終濃度では、眼を4°Cで約12時間保存します。
  2. 翌日、余分な30%のショ糖を取り除き、実験グループに従って配置された直径2cmの丸いアルミニウム容器に目を入れます。
    注:実験グループの数に応じて適切なサイズのアルミホイル容器を作成してください。
  3. 倍率10倍の双眼実体顕微鏡で、組織構造を傷つけないように注意しながら、ピペットや濾紙などで眼球の内側や周りの余分なショ糖を取り除きます。
  4. 目の中や周囲に気泡が形成されないように注意しながら、最適な切断温度(OCT)の凍結媒体に目を埋め込み、RTで1時間放置します。
  5. OCTの1時間後、前にマークした基準点を上に向けて目を配置します。アルミホイル容器を小さな発泡スチロールの箱の中の適切なアルミニウムプレートに置き、冷凍します。
  6. ホイル容器の周りのアルミニウムプレートに液体窒素を慎重に注ぎます。窒素が表面全体に均一に広がることを確認します。これにより、組織の均一な凍結が促進されます。液体窒素がホイル容器内の目に直接触れないようにしてください。次に、クライオスタットを使用して眼の切片化を進めます。

6. スライドの準備

  1. ポリ-L-リジン(200 μg/mL)を曇りガラススライドに広げます。
  2. スライドが乾き、使用できるようになるまで12時間待ちます。

7. クライオスタットセクショニング

  1. クライオスタットで、凍結したブロックをプラットフォーム上に配置します。
  2. ハンドホイールを回して、厚さ10μmの切片を作ります。
  3. ブロックの位置を調整して、すべての目がカットに等しく存在するようにします。
  4. 視神経が特定されるまで、明視野顕微鏡を使用して切断を続けます。
  5. poly-L-lysine前処理スライド上の切片を収集します。
  6. 分析までスライドを-20°Cで保存します。

8. 免疫蛍光

注:免疫蛍光法は、いくつかの調整19,20を伴って、前述のように行った。

  1. クライオスタットの切片から得られたスライドを、0.01 M PBS中の0.5% Triton X-100 100 μLと室温で15分間インキュベートし、細胞原形質膜を透過処理します。
  2. スライドを0.01 M PBSで2回、RTで5分間ずつ洗浄し、余分なTriton X-100を取り除きます。
  3. 100 μL 1%ウシ血清アルブミン(BSA)と0.01 M PBS中の室温で30分間インキュベートし、非特異的抗体結合部位をブロックします。
  4. ブロッキング後、切片を1:1500の濃度でBSA 1%で希釈した100 μLの抗回収剤とインキュベートし、光受容体細胞を標識します。4°Cで一晩(冷蔵庫)。
  5. 翌日、切片を100 μLの抗ウサギポリクローナル二次抗体488または抗ウサギポリクローナル二次抗体568 1:500(BSA 1%で希釈)で室温で2時間インキュベートします。
  6. スライドを0.01 M PBSで2回、室温で5分間洗浄します。
  7. 切片を100 μLのDAPI1 mg/mL(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール)と室温で2〜3分間インキュベートします。
  8. スライドを0.01 M PBSで1回、RTで5分間洗浄します。
  9. 最後に、0.1 Mリン酸緩衝液(pH 7.4)中の40 mLのグリセロールに2.5 gの没食子酸n-プロピルを含む封入剤で切片を処理します。それらは、退色防止試薬および封入媒体として機能し、サンプルを保存します。スライドの上にカバースリップ(24 mm 50 mm)を置き、マニキュアでセクションを密封します。その後、顕微鏡下でサンプルの観察に進みます。

9.蛍光顕微鏡顕微鏡写真撮影

  1. 免疫組織化学技術を使用して標識された細胞の画像を取得するには、青、緑、および赤のフィルターを備えた蛍光光学顕微鏡を使用します。また、スライド顕微鏡写真用のカメラを取り付けます。顕微鏡写真を取得するには、LAS V3.7(ライカ)ソフトウェア(イメージングソフトウェア)を搭載したコンピューターを使用します。LAS V3.7は、顕微鏡と同時に視覚化するために開いている必要があります。
  2. スライドを顕微鏡ステージに置きます。最初に、最も低い倍率の対物レンズと青いフィルターを使用します。
  3. 粗いフォーカスノブと細かいフォーカスノブを使用して、青色でラベル付けされた細胞(細胞核)の網膜がはっきりと見えるようになるまでフォーカスを調整します。
  4. イメージングのために網膜の目的の領域を選択します。倍率を徐々に40倍まで上げ、必要に応じてピントを調整します。
  5. ピントを調整した後、バイパスピンを引いて顕微鏡画像をイメージングソフトウェアに転送します。目的のフィルター(A4(青)、L5(緑)、TX2(赤))を選択します。 露出、 ゲイン、 ガンマのパラメータを調整して、画像が鮮明で、顕微鏡で観察されるものにできるだけ近いことを確認します。
  6. 400×の倍率で、網膜の周辺から中心への向きに従って、113×113μmの面積で4つのフィールドをキャプチャします。これらのフィールドのうち 2 つが周辺領域を表し、2 つが網膜の中央領域を表していることを確認します。
  7. 周辺視野顕微鏡写真を取得するには、目の端から約50μmの場所で画像を撮影します。セントラルフィールド顕微鏡写真の場合は、視神経から50μmの位置にある隣接領域を選択し、画像を取得します。定量には右目と左目の両方を使用し、治療ごとに合計8つの分析フィールドが得られます。
  8. すべての顕微鏡写真撮影が完了したら、免疫標識細胞の手動定量に進みます。

10. 細胞定量

  1. ImageJ v.1.54g プログラムを開きます。プログラム内で、[ ファイル]、[ 開く]の順にクリックし、コンピューターに保存された画像を選択します。
  2. 画像がすでに開いている状態で、[ マルチポイント ]をクリックします。このツールを使用して、カウントする各セルを左クリックしてセルを定量化します。
  3. 外核層(ONL)の共局在化細胞、すなわちリカバリーインとDAPI陽性の細胞を定量します。
  4. カウントが完了したら、マウスの左ボタンでダブルクリックして、マークされたセルの合計数を確認します。
  5. リカバリーイン陽性細胞の数を決定したら、Excelの定量表に細胞数を入力し、次の顕微鏡写真に進みます。
  6. 各動物に対応する8つのフィールドに対して、すべての手順を繰り返します。
  7. 網膜全体の 1 つの実験点 (n= 1) に対応する、これら 8 つのフィールドの平均を計算します。網膜末梢グラフでは、末梢野の平均を使用し、左目から 2 つ、右目から 2 つの計 4 つの視野を使用します。この平均は、末梢網膜の 1 つの実験点 (n= 1) に対応します。Retinaグラフの中心は、周辺グラフと同様に、領域のみを変更します。

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結果

光受容体であるリカバリーイン陽性細胞を標識するための免疫蛍光法により、rd10およびC57Bl6動物の光受容体の変性パターンを観察することができ、後者は健康であると考えられています(図1)。見てわかるように、リカバリー陽性細胞の標識は、rd10動物と野生型動物の両方で、これらの細胞の内部セグメントの標識を含め、光受容体が見られる外側の核層(ONL)に限定されています。開発が進むにつれて、両動物で蛍光免疫染色の保存を観察できますが、rd10動物ではONLの厚さが減少します。したがって、この手法は、さまざまな細胞タイプのパターンを観察するのに効果的です。

この点で、プロトコルの肯定的な結果には、この技術が両方のモデル間の明確な違いを検出する能力が含まれ、rd10動物の光受容体の進行性の喪失を示し、網膜色素変性症などの病状を研究するための方法の有用性を検証しています。さらに、得られた結果は、免疫蛍光...

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ディスカッション

網膜は、アクセスが困難なデリケートな組織です。したがって、この組織を標的とした薬理学的治療を行うために使用される技術を検討する必要があります。硝子体内注射は、特に加齢性黄斑変性症21、糖尿病性網膜症22、網膜色素変性症23などの眼疾患の治療において、薬物を網膜に直接送達するための確立された広く利用されている技術です。私たちのプロトコルと一致して、多くの研究はまた、網膜層16,17,18を調べるために免疫組織化学と組み合わせて硝子体内注射を採用しています。これらの知見は、これまでの研究で実証されているように、網膜研究におけるこれらの技術の関連性と有効性を補強するものである。硝子体内注射は、全身の副作用を最小限に抑えながら、薬...

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開示事項

著者は、宣言する利益相反を持っていません。

謝辞

この研究は、全米科学技術開発評議会(CNPq)、リオデジャネイロ州カルロス・シャーガス・フィーリョ研究支援財団(FAPERJ)の支援を受けた研究フェローシップで実施され、ブラジルの国立科学技術開発評議会(CNPq)の支援を受けた研究フェローシップを通じて実施され、ブラジルの金融コード001の財務コード001からも一部資金提供を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.3% Triton-X-100Sigma-AldrichT8787ブロッキングバッファー用溶液
1% BSASigma-AldrichA4503ブロッキングバッファー用溶液
1% ヒト BD Fc ブロックBD Biosciences564220ブロッキングバッファーに必要な Fc ブロック
150 W LED ランプ組織光照射用 Amazon B07VH3CVSF LED 光源
1x PBS Gibco10010-023バッファーと洗浄ステップをブロックするためのソリューション
20 ガロンの保管容器AmazonB001B1C4G0光照射プロセス用容器
40 W RGBW フラッド LED ランプ 組織光照射用Amazon B08QFPJSMD RGB光源
Ag85BAbcamab43019/NA抗体表 1 を参照してください。
ファ平滑筋アクチンDyLight 755Novus BiologicalsNBP2-345221R/NA抗体。表 1 を参照してください。
アビジン/ビオチンブロッキングキットAbcamab64212アビジンおよびビオチンブロッキング溶液
BD Cytofix/CytopermBD Biosciences554714固定溶液
BOND デワックス溶液ライカバイオシステムNC0221076脱パラフィン溶液
BOND エピトープ回収溶液 1ライカバイオシステムズNC0235529クエン酸ベースの pH 6 エピトープ検索溶液 (ER1)
BOND エピトープ回収液 2ライカバイオシステムNC0235530EDTAベースのpH 9エピトープ回収液(ER2)
BOND研究用検出システムライカバイオシステムNC0396648自動研究用染色試薬
BOND RX 研究用染色機ライカバイオシステムNA研究用染色プラットフォーム
BOND 洗浄液ライカバイオシステムズNC0221077バッファーCD15
BD Biosciences347420/AB_400298IBEXイメージング用抗体。表 1 を参照してください。
CD20 eFluor 660Thermo Fisher Scientific50-0202-82/AB_11150959IBEXイメージング用抗体。表 1 を参照してください。
CD4 アレクサ フルオア 488R&D SystemsFAB8165G/AB_2728839IBEXイメージング用抗体表 1 を参照してください。
CD45 Phycoerythrin (PE)Novus BiologicalsNBP2-34528PE/NAIBEXイメージング用抗体表 1 を参照してください。
CD68 iFluor 594Caprico Biotechnologies1064135/AB_2892745IBEXイメージング用抗体表 1 を参照してください。
バ抗ヤギ IgG Alexa Fluor Plus 488Thermo Fisher ScientificA32814/AB_2762838IBEX イメージング用抗体。表 1 を参照してください。
ロバ抗マウス IgG Alexa Fluor Plus AF647Thermo Fisher ScientificA32787/ AB_2762830IBEX イメージング用抗体。表 1 を参照してください。
ロバ抗マウス IgM Alexa Fluor 488Jackson ImmunoResearch715-545-020/AB_2340844IBEX イメージング用抗体。表 1 を参照してください。
ロバ抗ウサギ IgG Alexa Fluor Plus AF555Thermo Fisher ScientificA32794/AB_2762834IBEX イメージング用抗体。表 1 を参照してください。
EasyDip 染色システムNewcomer Supply5300KITスライド染色システム
Fluoromount-GThermo Fisher Scientific00-4958-02封入剤
HoechstBiotium40046IBEX イメージング用核染色。表 1 を参照してください。
Imaris ファイルコンバーター x64 10.2.0Imaris Oxford Instruments無料ファイルコンバーター
ImarisViewer ソフトウェア x64 10.2.0Imaris Oxford Instruments無料画像処理ソフトウェア
ImmEdge Pen VectorLaboratoriesH-4000疎水性バリアペン
素化ホウ素リチウム (1 グラム)STREM Chemicals93-0397染料不活化用の化学物質、この化学物質の少量のアリコート(1グラム)を購入するル
ミカンビオチンR&。D SystemsBAF2846IBEXイメージング用抗体表 1 を参照してください。
マイクロカバーメガネVWR48393-241スライドガラス
サイトケラチン Alexa Fluor 750Novus BiologicalsNBP2-33200AF750/AB_2868569IBEX イメージング用抗体。表 1 を参照してください。
PELCO BioWave Pro マイクロ波システムTed Pella Inc36500-230非加熱科学用マイクロ波
PELCO SteadyTemp ProTed Pella Inc50062科学用マイクロ波の全自動温度制御
SimpleITKオープンソースソフトウェア登録およびチャネル処理ソフトウェア
Streptavidin Alexa Fluor 594Thermo Fisher ScientificS11227IBEXイメージング用標識試薬表 1 を参照してください。
広視野顕微鏡ライカマイクロシステムNAライカマイクロシステムズ LED8 光源と LAS X ソフトウェアを備えた THUNDER イメージャー (3.7.1.21655)。蛍光イメージングでは、外部フィルターホイール(PN:11536075)と2つの追加のシングルバンドフィルター(PN:8118215)を備えたカスタムクアッドバンドフィルターを使用して、パスごとに7つの色素チャネルを画像化しました。フィルター励起線、二色性線、および発光線は、(1)クアッドバンドキューブ:391/32、479/33、554/24、638/31の二色性、励起または発光フィルターなし。(2)外部フィルターホイール位置1:434/32、位置2:520/40、位置3:585/20、位置4:720/60、位置5:パススルー。(3)シングルバンド1—585/22励起、594二色性、625/30発光。(4)シングルバンド2—635/20励起、647二色性、667/30発光。
Zeiss 光学レンズクリーナーAmazonB00GPVQVCO顕微鏡対物レンズクリーナー
抗体
Ag85BAbcamab43019ポリクローナルウサギ IgG、サイクル 1
α-平滑筋アクチン DyLight 755Novus BiologicalsNBP2-345221R1A4/asm-1、サイクル 1
CD4 Alexa Fluor 488R&;DシステムFAB8165Gポリクローナルヤギ IgG、サイクル 1
CD8 Alexa Fluor 647BioLegend372906C8/144B、サイクル 1
CD68 iFluor 594Caprico Biotechnologies1064135KP1、サイクル 1
ロバ抗ヤギ IgG Alexa Fluor Plus 488サーモフィッシャーサイエンティフィA32814ポリクローナルロバ、サイクル 1
ロバ抗マウス IgG Alexa Fluor Plus AF647ThermoFisher ScientificA32787ポリクローナルロバ、サイクル 1
ロバ抗ウサギ IgG Alexa Fluor Plus AF555Thermo Fisher ScientificA32794ポリクローナルロバ、サイクル 1
HoechstBiotium40046核ラベル、サイクル 1
CD15BD Biosciences347420MMA、サイクル 2
CD20 eFluor 660サーモフィッシャーサイエンティフィック50-0202-82L26、サイクル 2
CD45 フィコエリトリン (PE)Novus BiologicalsNBP2-34528PE2B11 + PD7/26、サイクル 2
ロバ抗マウス IgM Alexa Fluor 488Jackson ImmunoResearch715-545-020ポリクローナル ロバ、サイクル 2
ルミカン ビオチンR&D SystemsBAF2846ポリクローナルヤギ IgG、サイクル 2
パンサイトケラチン Alexa Fluor 750Novus BiologicalsNBP2-33200AF750AE-1/AE-3、サイクル 2
ストレプトアビジン Alexa Fluor 594サーモフィッシャーサイエンティフィックS11227N/A、サイクル 2
HoechstBiotium40046サイクル 2
Solutions
ブロッキングバッファー(サイクル1)
Triton-X-100Sigma-AldrichT87870.3%(体積%)
BSASigma-AldrichA45031%(体積%)
トBD FcブロックBiosciences5642201体積%(
1x PBS );Gibco10010-02397.7% (体積別
一次抗体染色液 #1 (サイクル 1)
ブロッキングバッファー (サイクル 1)上記抗体添加後に体積まで補充
HoechstBiotium400461:5000
CD8 AF647BioLegend3729061:10
一次抗体染色液#2(サイクル1)
ブロッキングバッファー(サイクル1)上記を添加した後、容量まで補充
します。AF488R&D SystemsFAB8165G1:10
Ag85BAbcamab43019/NA1:100
二次抗体染色液 #1 (サイクル 1)
ブロッキングバッファー (サイクル 1)上記抗体添加後にボリュームまで補充
Donkey Anti-Goat AF Plus 488Thermo Fisher ScientificA32814/AB_27628381:100
ロバ抗ウサギ AF Plus 555サーモフィッシャーサイエンティフィックA32794/AB_27628341:100
バ抗マウス AF Plus 647サーモフィッシャーサイエンティフィックA32787/AB_27628301:50
一次抗体染色液 #3 (サイクル 1)
ブロッキングバッファー (サイクル 1)上記後にボリュームまで補充抗体
CD68 iF594Caprico Biotechnologies10641351:10
a-SMA DL755Novus BiologicalsNBP2-345221R/NA1:30
BSA フリー ブロッキング バッファー (サイクル 2) 
Triton-X-100Sigma-AldrichT87870.3 体積%
ヒト BD Fc ブロックBD Biosciences5642201 体積%
1x PBS Gibco10010-02398.7% (体積比
一次抗体染色液 #4 (サイクル 2)
BSA フリー ブロッキングバッファー (サイクル 2)上記抗体添加後に体積まで補充
CD15BD Biosciences3474201:30
ルミカン ビオチンR&D SystemsBAF28461:100
CD45 PENovus BiologicalsNBP2-34528PE1:20
CD20 eFluor 660Thermo Fisher Scientific50-0202-821:10
Pan-Cytokeratin AF750Novus BiologicalsNBP2-33200AF7501:10
二次抗体染色液 #2 (サイクル 2)
BSAフリーブロッキングバッファー(サイクル2)上記抗体添加後のボリュームアップ
ロバ抗マウスIgM AF488Jackson ImmunoResearch715-545-020/AB_23408441:100
ストレパビジン AF594サーモフィッシャーサイエンティフィS112271:200
IBEXイメージング用IBEXイメージング用アルズ ズ ズ ズ 自動 洗浄ロ 水カバーパンズ ック ヒBD を参照 を参照抗体CD4 を参照 ロを参照 添加を参照 参照 ック

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