方法論記事

インビボ 麻酔をかけていない ショウジョウバエ の成虫の神経活動のイメージング

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DOI:

10.3791/68332

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2025年6月20日

 , 
1Department of Biology, Georgetown University, 2Interdisciplinary Program in Neuroscience, Georgetown University

この記事について

サマリー

学習や記憶などの認知プロセスにおける細胞活動の研究における大きな障壁は、in vivoイメージング調製のための麻酔薬の使用です。麻酔は、ショウジョウバエを含む複数のモデルで短期記憶と認知を損ないます。この研究は、麻酔なしでin vivoイメージングのために成体のショウジョウバエを調製するためのユニークな方法を提示します。

要約

In vivoイメージングは、ショウジョウバエの神経生物学を研究するために重要であり、無傷で行動するハエ内のニューロンの活動、発達、および可塑性をリアルタイムで視覚化できます。この技術は、シナプス機能や回路接続など、固定製剤やex vivo製剤では正確に捕捉できない動的プロセスに関する貴重な洞察を提供します。in vivoイメージングのためのハエ調製のほとんどの技術には、機能イメージングの直前にハエに麻酔をかけることが含まれます。それにもかかわらず、広範な証拠は、麻酔がいくつかの認知的および生理学的プロセスに影響を与えることを示しています。このため、動物調製中に麻酔薬を使用せずに成虫のDrosophila melanogasterをin vivoでイメージングすることは、困難でありながら非常に望ましいアプローチです。ここで提示されるプロトコルは、真空システムに接続された小さな金属管にテングを吸引することにより、目覚めているハエの頭を固定することを含む。頭部が固定されている間、フライは麻酔を必要とせずに機能的なイメージングのために準備されています。このプロトコルは迅速で再現性があり、フライに害を及ぼすことはありません。この方法の主な利点は、麻酔薬の使用を回避し、それによって麻酔が神経活動に及ぼす潜在的な複雑な影響を説明することにあります。この方法は、安価でカスタマイズ可能なツールを利用して、手頃な価格で適応性が高いです。これにより、生きたハエのイメージングに成功し、動的な認知プロセスに関連する神経活動の急速な変化を捉えることができます。

概要

近年の遺伝的にコード化された活動レポーターの進歩は、ニューロンの活動に関するリアルタイムの非常に特異的な洞察を提供することで、神経科学に革命をもたらしました。カルシウムセンサーや電圧センサー1、2、3、4、5、6、7、8、9などのこれらのレポーターにより、研究者はニューロン内の電気信号と化学信号を前例のない時間精度と空間分解能で追跡できます。これらのツールは、特定の単一ニューロンを異なる脳領域のニューラルネットワークにモニタリングすることを可能にすることにより、ニューロンの発火パターンが学習、記憶、意思決定などの認知プロセスにどのように関連しているかについての理解を深めました10,11,12,13,14。

これらの遺伝的にコードされた指標を活用するために、研究者はin vivoイメージング用のモデル生物を準備するための高度な方法を開発しました。in vivo機能イメージングによるニューロンの可塑性に関する最初の報告は、しばしば「記憶トレース」と呼ばれ、食欲的な嗅覚コンディショニング後のミツバチの触角葉で発見された15。この発見は、遺伝的に汎用性の高いモデル生物であるショウジョウバエ・メラノガスターの研究に影響を与え、革新的なin vivoイメージング技術の開発につながった10,16,17,18。

ショウジョウバエは、古典的条件付けを介して嗅覚記憶を形成する堅牢な能力により、学習と記憶を理解するための優れたモデルとして機能し、匂い(条件付け刺激-CS)が嫌悪刺激または報酬刺激(無条件刺激-US)のいずれかに関連付けられるようになります19,20,21,22。ショウジョウバエでは、匂いは、半球あたり約2,000のケニオン細胞ニューロン(KC)からなる連想記憶の重要な脳領域であるキノコ体(MB)23にまばらに表れています24。嗅覚情報は、がくからMB葉にKC軸索を介して伝達され、KC軸索が束になって葉を形成します。嗅覚条件付け中、電気ショックや糖報酬などの米国は、異なるドーパミン作動性ニューロン(DAN)を介してMBローブに伝達されます:嫌悪刺激のためのPPL1ニューロンと報酬刺激のためのPAMニューロン25,26,27,28,29,30.記憶獲得は、CS経路とUS経路の同時活性化を含み、その結果、記憶をコードするサイクリックAMP(cAMP)が相乗的に増加すると考えられている31,32。このプロセスは、KC→MBONシナプスで可塑性を誘発し、シナプス重量11,12,13,33,34,35,36,37を変更します。DAN媒介可塑性は、最終的にキノコ体出力ニューロン(MBON)を駆動して、学習した匂い34に対する接近または回避行動のいずれかを誘発する。現在のモデルは、KCからMBONへの情報の流れが、KCの臭気同一性からの臭気の表現を、MBONのより抽象的な情報に変換することを示唆している。例えば、以前の経験に基づく臭気の価数などである34,38。KCとは異なり、MBONは臭気反応を広く調整しています。任意の特定の臭いは、ほとんどのMBONs39に反応する結果になります。MBONの匂い調整はシナプス可塑性によって変化し、個々のハエ間で大きく異なることから、MBONは経験に基づいて匂いに対する反応を変えることが示唆されています。34のMBONがあり、MBONネットワークの大部分は、回避行動34のいずれかのアプローチを推進する2つの相互に対立するクラスに分割されているように見える。このため、in vivoイメージングを使用して、さまざまなMBONに記録することにより記憶検索を研究することが広く使用されてきました。

in vivo機能イメージングの初期の方法には、頭部嚢の上部からキューティクルの一部を除去する手術を行うことが含まれ、次いで、それを小さなプラスチックラップ18で覆った。これがショウジョウバエのin vivoイメージングの始まりとなりましたが、それ以来、ハエの調製技術や、学習や記憶などのプロセスを調査するための顕微鏡下での刺激の送達には大きな進歩がありました。しかし、今日でも、in vivoイメージングのためのハエ調製のほとんどの技術は、ハエに麻酔をかけることを含んでいます。麻酔が記憶やその他の認知的および生理学的プロセスにどのように影響するかを示す広範な証拠と研究分野全体があるため、この実践には課題があります。たとえば、実験室で非常に一般的に使用されるさまざまな麻酔薬(二酸化炭素、イソフルラン、セボフルラン、コールドショック)の影響を理解するための研究が行われました。彼らは、麻酔への曝露が長くなるほど、回復時間の増加、自発運動活動の変化、繁殖力の低下があり、水と脂質の貯蔵に影響を与える可能性があることを発見しました40。また、トレーニング直後にコールドショック麻酔を施すと、短期記憶が完全に混乱する可能性があることが報告されている21。この初期の研究から、ショウジョウバエには、6〜8時間以内に減衰する未統合記憶(麻酔感受性記憶)と、学習後に徐々に形成され、約24時間持続する統合記憶(麻酔抵抗記憶)の形態があることが現在わかっています41。これに基づいて、麻酔は認知処理とニューロンの活動に影響を与える可能性があり、最終的には適切な記憶表現が可能になります。

麻酔が記憶に及ぼす影響は、 ショウジョウバエ に限ったことではありません。多くのヒトおよび他の哺乳類の研究でも同様の発見が示されています。例えば、大学病院で行われた横断研究では、全身麻酔の24時間後に患者の短期記憶が有意に減少したことがわかりました42。マウスで行われた別の研究では、全身麻酔が、哺乳類の学習と記憶に関与する重要な脳領域である海馬のCA1領域におけるスパイクダイナミクス、非相関の細胞集団、および脊椎ダイナミクスの変化を強力に減少させることがわかりました43。これらの困難を克服するために、この研究の目標は、 ハ エの準備中に麻酔の使用を排除し、ハエの体を完全に解放する新しいプロトコルを提供することです。このアプローチにより、他のアプローチと比較して、より正確なニューロン活動の記録が可能になり、より長い記録でハエの健康が改善され、麻酔による交絡効果の可能性が排除されます。このプロトコルは、 ショウジョウバエのニューロンからの活動を記録するように設計されており、特に学習体験中および学習後にニューロンがどのように可塑性を示すかを調べます。しかし、解剖プロトコルは汎用性が高く、ライブイメージング研究におけるさまざまなアプリケーションに適応させることができます。

プロトコル

この研究に使用した機器と試薬の詳細は、 資料の表に記載されています。

1.トランスジェニックショウジョウバエ、 Drosophila melanogaster

  1. 雌の処女と雄のハエ(25°C、相対湿度60%、12時間の明暗サイクルで飼育)を交配し、それぞれ所望のGal4およびUASコンストラクトを運び、目的の特定のニューロンが所望の遺伝的にコードされた活性レポーターを発現するハエを産生する。
  2. 上記の交配の子孫を、卵閉後2〜5日の範囲に入るまで老化させます。イメージングチャンバーは男女ともに合うようにカスタムメイドされているため、男性と女性の両方を使用できます。

2. アスピレーターの構築 (ワークフロー:5分)

  1. かみそりの刃を使用して、6mmのシリコンチューブを約8インチの長さにカットします。p200ピペットチップを取り、マウスピース用のかみそりの刃を使用してその約半分を切り取ります(図1A)。カットした先端をチューブに挿入します。p1000ピペットの先端を十分にカットして、ハエが移動できるようにします。
  2. 小さな綿を取り、シリコンチューブを覆います。これは、ハエが実験者の口の中に誤嚥されるのを防ぐためです。カットしたp1000チップを綿で覆われたチューブに置きます。
  3. p1000ピペットチップを新しいp200ピペットチップで覆います。p200ピペットチップを切断するための適切な長さを決定するには、まずp200ピペットチップを取り外し、フライをp1000ピペットチップに吸引します。p200チップを再度取り付けます。フライをそっと吹いて軽くたたいて、p200の先端に入ることができるところまで動かします。
    1. それ以上進むことができなくなったら、解剖顕微鏡を使用して、ハエの頭が終わり、かみそりの刃を使用して胸部が始まるポイントをマークします。フライを吸引してp1000ピペットチップに戻し、マークされた位置でp200ピペットチップをカットします。

3. 金属チューブのテング吸引器の構築 (5 - 10 分のワークフロー)

  1. 22倍ゲージの皮下金属チューブを、ドレメルの工具とダイヤモンドソーブレードを使用して、希望のサイズ(~10cm)にカットします。金属チューブのバフエンドとドレメル420カットオフホイールにより、滑らかでクリーンな開口部を作り出します。この開口部は、ハエの吻に対応します。
  2. チューブを15 mLの遠心分離チューブに巻き付けて、目的の湾曲形状にします(図1A)。曲線は、フライの体がチャンバーと一直線に並ぶことを可能にするフックのような形状を作成する必要があります。
  3. Dremelツールを使用して、12TWゲージの皮下金属チューブの一部(~7 cmの長さ)をカットします(このチューブは2 μLのピペットチップに収まる必要があります)。2 μLのピペットチップを取り、カミソリの刃を使用して端をカットし、22Xゲージの金属チューブに合わせます。大きい方の金属チューブを2 μLピペットチップのもう一方の端にはめ込みます。
  4. 少量の樹脂とエポキシ接着剤の硬化剤を混ぜ合わせます。小さな金属チューブがピペットチップと接する場所、および大きい金属チューブがピペットチップに接続する場所に混合物を塗布します。接着剤を一晩で完全に硬化させてから、アセンブリをマイクロマニピュレーターのホルダーに接続します。必要に応じて角度を調整します。

4. 顕微鏡下での学習および記憶実験のための衝撃および臭気送達ピペットの組み立て(10分ワークフロー)

  1. ドレメルのダイヤモンドツールを使用して、1/100ガラスピペットで1mLを3mLのマークでカットします。寸法が24.5 mm x 8mm、厚さが1/8インチのアクリルシートの小さな長方形の部分を切り取ります。
    注:あるいは、このピースを3Dプリントしてショックグリッドにうまく対応することもできます(stlファイルとobjファイルは Supplementary File 1 と Supplementary File 2にあります)。
  2. 銅製のショックグリッドをカットして、前のステップの長方形のアクリル片に合わせます。銅グリッドの両端に2本の電線をはんだ付けします。銅のグリッドを長方形のアクリルピースに置き、フライの腹部と脚がショックグリッドに収まるように湾曲させます(図1I)。
  3. 電気テープを使用して、銅グリッドを長方形のプラスチックにテープで固定します。ホットグルーガンを使用して、ガラスピペットをショックグリッドにしっかりと取り付け、まっすぐで適切に中央に配置されていることを確認します。デジタルマルチメータを使用して、銅グリッドがハエの脚に効果的に衝撃を与えるように機能していることを確認します。

5. 接着剤溶解用白金抵抗器(ミリスチン酸)の組み立て(ワークフロー20分)

  1. ワイヤーストリッパーを使用して、200 mmのワイヤーを目的の長さに切断し、両方のワイヤーの一方の端をストリップします。プラチナ線を約60mmカットします(この長さは、接着剤を溶かすために使用されるループを作成するのに十分である必要があります)。
  2. はんだ付けガンを使用して、プラチナ線の一端を電線にはんだ付けします。熱収縮チューブを電線に通し、ブンゼンバーナーを使用してチューブをワイヤーに収縮させ、はんだ付けされた部品を覆います。
  3. 内径2.55mmのゴムチューブを2本20mmカットし、プラチナワイヤーに通します(このプロセスを容易にするために、プラチナワイヤーをまっすぐに保ちます)。はんだ付けガンを使用して、プラチナ線のもう一方の端をもう一方の電線にはんだ付けします。新しい熱収縮チューブを使用して、この新しいはんだ付け部品を覆います。
  4. BD tb 1 mLシリンジのプランジャーを取り外し、前のステップのワイヤーをバレルに通します。プラチナはシリンジのバレルエンドから突き出ている必要があります。露出したワイヤーがあってはならず、小さなゴムチューブが最後の最後を除いてプラチナワイヤーを覆っている必要があります。
  5. ワイヤーストリッパーを使用して、電線のもう一方の端を少量剥がします。はんだ付けガンを使用して、各ワイヤがしっかりと接続されるまでバナナプラグにはんだ付けします。
  6. エポキシ接着剤を使用してシリンジバレルの上部とベースを接着し、ワイヤーとバレルを接着します。これにより、シリンジ内部のワイヤーへの張力が回避され、抵抗器の寿命が長くなります。接着剤を一晩硬化させます。
  7. 完成した抵抗器をDC電源に接続します。

6. 記録室の構築 - (2日間のワークフロー)

  1. 補足ファイル3に続いて、黒いシムシート(厚さ0.0125インチ)をレーザーカットします。チャンバーの中央にある開口部のサイズは、ハエのサイズに合わせて変更できます(ファイル内のサイズは一般的にメスとオスに適合します)。
  2. チャンバーのベースとして機能するガラス顕微鏡スライドを取ります。樹脂とエポキシを混ぜ合わせます。黒いアクリルチャンバーを取り、エポキシ接着剤を使用して、ネオジム3 mm x 2 mmの磁石を四隅すべてに取り付けます。マグネットを1個ずつ接着し、ペーパークリップで接着剤が硬化するまで保持しておくのがおすすめです。
  3. 以前にチャンバーに接着した磁石のそれぞれに、2つの新しい磁石を配置します。エポキシを使用して、最後に取り付けた磁石をスライドガラスに接着し、ペーパークリップを使用してキュレーション中に所定の位置に保持します。
    注:接着剤がキュレーションされた後、チャンバーは完成し、実験のためにチャンバーの高さを調整するためにさらに磁石を追加できます。補足ファイル4、補足ファイル5、補足ファイル6は、組み立てられた記録室を示しています。

7. 麻酔なしのin vivo 解剖プロトコール - (5 - 7 分ワークフロー)

  1. p200ピペットチップをアスピレーターから取り外します。吸引器をバイアルに挿入し、p1000ピペットチップに1つのフライを吸引します。p200ピペットチップをアスピレーターに戻します。吸引器をそっと吹き飛ばして、フライがp200ピペットチップの上部に固定されるようにします。
  2. 解剖チャンバーをマニピュレーターホルダーに置きます。バキュームをフライホールディングチューブに接続し、必要に応じて流量を調整します(~500 mL/分)。高速コネクタを使用して、バキュームを簡単かつ迅速に接続および切断します(図1A)。
  3. 顕微鏡を覗くときは、真空金属チューブを視野の中央に動かします。フライを接着する準備ができたら、チャンバーが金属チューブの真上に収まるように、チャンバーが正しく配置されていることを確認します。フライの吻をバキュームホルダーにそっと吸引します(図1A)。
  4. フライが正しい位置になったら、フライの頭がチャンバーの開口部に揃うようにマニピュレーターを動かします。
  5. DC 電源をオンにします。電流は0.40〜0.50アンペアの範囲に設定する必要があります。電流が大きくなると、ミリスチン酸が溶けて粘度が低くなりすぎると、接着剤がハエの頭に広がるリスクが高まる可能性があります。
  6. 白金耐性を使用して、溶融したミリスチン酸を使用して、目と胸部の側面をチャンバーに接着します(図1B)。頭のキューティクルに接着剤が付くのを防ぐために、特に目の側面を接着するときは、接着剤をできるだけ使用しないでください。
  7. 目と胸部が接着されたら、真空チューブを外し、マニピュレーターを使用して記録チャンバーを真空チューブから取り出します。チャンバーを逆さまにし、プラチナ抵抗を使用してテングを下から接着します(図1C)。下から目を接着することはオプションであり、解剖中にフライを所定の位置に保つのに役立ちますが、必須ではありません。
  8. すべてが接着されたら、DC電源をオフにし、チャンバーを直立させて、ガラスサイドベースに取り付けます。はさみで小さなテープを切り取り、ハエの頭の前後に貼り付けます(図1D)。
  9. ヘッドが90で実験者に向くようにチャンバーを回転させます。解剖針を使用して、目の側面に沿って垂直に切り込みを入れます(図1E)。チャンバーを回転させて水平に配置します。解剖針を使用して、キューティクルを横切って切ります(図1E)。
    注意: 作成したばかりのキューティクルの「窓」が解剖針を使用して持ち上げられることを確認してください。抵抗なく持ち上げられる場合は、解剖針をカバーに戻します。ステップ13および14では、カット中に明確な視界を妨げる可能性のある光の屈折を防ぐために生理食塩水は使用されません。
  10. 100 μLの生理食塩水をフライの頭頂部に加えます(図1F)。鋭利な鉗子を使用して、ウィンドウを慎重に取り外します(図1G)。鋭利な鉗子を使用して、残っている脂肪や気管を慎重に取り除きます。これで、脳はイメージングの準備ができているはずです(図1H-1J)。

8. 嫌悪嗅覚コンディショニングによる学習誘発可塑性の可視化(20分ワークフロー)

  1. レーザーと水浸対物レンズを備えた共焦点顕微鏡を使用して、準備したフライを顕微鏡のステージに置きます。必要に応じて、マクロレンズ付きのカメラを使用してフライに焦点を合わせ、フライが健康で動いていることを確認します。
  2. マイクロマニピュレーターを使用してショックグリッド/臭気ピペットの位置を調整し、フライがショックグリッドに座るようにします。
    注:ショックグリッドが脚と腹部にわずかに触れているだけなので、フライはまだ自由に動くことができるはずです(ハエが引っ込められた場合、フライはグリッドから脚と腹部を削除できるはずです)。臭気送達ピペットは、ハエのアンテナに向ける必要があります。
  3. 粗いZ調整ノブを使用して、脳のZ軸をスキャンし、関心のある脳の領域を特定します。フレームサイズを512 x 512ピクセルに調整します。スキャン周波数は、最低2Hzで希望の速度に調整する必要があります。最後に、録音の期間を設定します。
  4. カスタムメイドまたは市販の臭気送達システムを使用して目的のニューロンの記録を開始し、同時に「事前トレーニング」臭気送達を開始します(図2C)。録音を 2 分に設定します。トレーニング前の匂いのプレゼンテーションは、5 秒の 1 回目の匂いパルス (CS-) とそれに続く 5 秒の 2 回目の匂いパルス (CS+) に対する反応を 30 秒のインター 刺激間隔で記録することから始まります。
  5. 事前トレーニングの反応を収集した後、5分間待ってから、臭気送達システムでトレーニングプロトコルを開始します。この例では、トレーニング中に CS+ のみを提示しました。CS+臭気は、臭気送達システムをトリガーしてから30秒後に開始され、1分間表示されます。衝撃刺激装置は、臭気が提示されている間、同時に12、90Vの衝撃を与えるようにプログラムされています。
  6. トレーニング後、5分または15分待ってから、トレーニング後の回答を得てください。ステップ6でトレーニング前の回答を記録したのと同じ方法で、トレーニング後の回答を記録します。すべてのファイルを適切な形式で保存し、その後の画像解析に使用します。

9. 画像解析

  1. 記録を分析するには、ニューロンの領域の周囲に関心領域 (ROI) を描画します。これは、バックグラウンド蛍光の影響を制限するために、可能な限り正確である必要があります。
  2. 測定ツールを使用して、記録の各フレームのROI内の平均蛍光強度データを抽出します。このデータをCSVファイルとしてエクスポートします。
  3. MATLABまたは任意のデータ解析プログラムでデータを開き、各臭気トレースのΔF/Fo値を計算します。データを組み合わせて、個々のフライ全体の平均ΔF/Fo記録を取得し、トレーニング前とトレーニング後の平均臭気反応トレースのグラフを作成します(図2E、F)。

結果

ここでは、麻酔なしの成体ショウジョウバエのin vivoイメージングを利用して、十分に特徴付けられたキノコボディアウトプットニューロン(MBON γ2α'1)12の可塑性を誘発する嫌悪的な嗅覚条件付けを調査します。カルシウム指示薬GCaMP6f2は、赤色蛍光タンパク質TdTomと共に、MB出力ニューロンで発現され、その樹状突起はMB γおよびα'ローブのコンパートメントを神経支配し、スプリットGal4ラインMB077C34(図2A、B)を使用してMBON γ2α'1に遺伝的に標的化されます。

嫌悪的な嗅覚コンディショニング後の可塑性を観察するために、ハエを共焦点顕微鏡の下に置き、腹部と脚をショックグリッドの中央に揃え、臭気送達ピペットをハエのアンテナに向けています。まず、カルシウム臭反応は、4-メチルシクロヘキサノール(MCH)の5秒パルスとそれに続く3-オクタノール(OCT)の5秒パルスに対して記録され、30秒の刺激間間隔で区切られました。5分後、ハエは1分間のOCT(CS+)パルスと12、90Vの衝撃を同時に提示することによって訓練されました。この連想条件付けスケジュールは、堅牢な行動嫌悪記憶を生み出します。最後に、コンディショニングの5分後と15分後に、MCHとOCTに対するカルシウム反応がトレーニング前と同様に記録されました。MBON γ2α'1は、コンディショニング前にMCHとOCTの両方に対してカルシウム過渡現象によって強く応答します(図2D-F)。それにもかかわらず、以前の知見12、CS+に対する5分間のコンディショニング後のカルシウム反応(OCT)は完全に抑制されています(図2D-F)。さらに、CS-(MCH)に対する応答は有意に増強されました。トレーニング後15分でも同様の結果が得られ、CS+に対するカルシウム応答は有意に低下し、CS-は増強されました。これらの結果は、両方の匂いで観察された記憶痕跡が少なくとも15分間続くことを示しています(図2D-F)。これらの反応は、5秒パルス中の平均臭気反応を使用して定量化され、フライ内で比較されました。これらの臭気反応の変化は、嫌悪トレーニング前および嫌悪トレーニング後のGCaMP6蛍光の変化を擬似カラーで表現することによっても視覚化できます(図2E)。対照的に、調製中にフライに麻酔をかけると、CS+とCS-の両方の可塑性が低下します。麻酔動物では、訓練後の反応がまだ存在するため、CS+に対する部分的な抑制のみが観察されます。さらに、CS-応答はトレーニング後に有意差はありません(図2G、H)。これをよりよく観察するために、誘導可塑性をCS+/CS-の比として計算し、麻酔をかけていないハエは麻酔をかけた動物と比較して可塑性が有意に増加することを示しました(図2I)。これらの代表的な結果は、このプロトコルが顕微鏡下での学習と記憶の研究に適しており、ニューロンからのイメージング中にハエの健康を長期間確保することを示しています。このプロトコールは十分に汎用性が高く、他のタイプのin vivoイメージングや関心のある他のニューロンにも適用できます。

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図1:麻酔を使用しないショウジョウバエのin vivoイメージング調製 (A)トップパネル:吸引器調製に関与するステップを示す図。ボトムパネル:フライポジショニング中にマイクロマニピュレーターに保持されたチャンバーを示す図。フライのテングは、吸引器を使用して500mL / minの真空に接続された金属チューブの開口部に配置されます。その後、チャンバーはフライの上に配置されます。(B)目の側面と胸部は、特注の白金抵抗器を使用してミリスチン酸で接着されています。(C)フライの吻を金属チューブから取り除き、チャンバーを反転させてテングを所定の位置に接着できるようにすることで、記録中の動きを最小限に抑えます。(D)チャンバーはガラススライドベースに取り付けられています。チャンバーの上部にはアンテナを覆うテープが貼られ、背面には生理食塩水が漏れないようになっています。(E)複眼近くのキューティクルに沿って2つの垂直カットが行われ、続いて胸部近くのキューティクルを横切る3番目のカットが行われ、脳への「窓」が作成されます。(F)100〜200μLの生理食塩水を、切り傷部位のフライの頭部に加えます。(G)キューティクルウィンドウを持ち上げ、引っ張り、鋭く細い鉗子を使用して取り外して脳を露出させます。(H)脂肪と気管組織を除去し、顕微鏡下で脳細胞を鮮明に可視化します。(I)準備したフライを顕微鏡の下に置き、その本体をショックグリッドの上に揃えて配置します。(J) MBON γ2α'1の発現パターンを示す疑似カラー画像。対象領域は、樹状突起を囲む破線で輪郭が描かれています。スケールバー:50μmこの図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図2:嫌悪的嗅覚コンディショニング後のMBON γ2α'1の学習誘発可塑性。 (A)GCaMPを発現するMB077C-splitGal4ドライバーの発現パターン。脳を解剖し、抗GFPで染色し、抗NC82で対比染色しました。スケールバー:50μm.(B)MBON γ2α′1の擬似カラー画像で、細胞体、拡張プロセス、樹状突起を強調しています。樹状突起領域は、カルシウム応答が収集された領域を表します。スケールバー:50μm.(C)嫌悪トレーニングプロトコルの概略図。ハエは、30秒のきれいな空気を挟んで、MCHとOCTの5秒パルスに曝露されました。5分間のインターバルの後、ハエはOCTを12回の90V電気ショックに関連付けるように訓練されました。MCHおよびOCTに対するカルシウム反応の記録は、トレーニングの5分後と15分後に行われました。(D)MCH(上面)とOCT(下面)への臭気反応の痕跡を、事前学習時と5分後と15分後に示します。太い黒いバーは、臭いが現れるタイミングを示しています。(E)MBON γ2α′1の学習前、および学習後5分と15分後の、MCHとOCTの両方に応じた樹状突起の擬似カラー画像。蛍光の増強はCS-(MCH)で観察され、CS+(OCT)では蛍光が消失します。スケールバー:20 μm. (F) MCHに対する平均臭気反応は、トレーニング後5分および15分で有意に増強されますが、OCT(CS+)に対する反応は有意に抑制されます。ノンパラメトリックWilcoxon対応検定、 N = 12。(G)トレーニング前とトレーニング後5分間の麻酔フライのMCH(上部パネル)とOCT(下部パネル)への臭気反応の痕跡が示されています。太い黒いバーは臭いの伝達を示します。(H)麻酔をかけた動物では、MCHに対する平均臭気反応は訓練後に有意な増強を示さず、OCTに対する反応は麻酔をかけていない動物と比較して部分的な抑制しか示さなかった。(I)CS+/CS-比として計算される訓練誘発可塑性は、麻酔をかけたハエでは、麻酔なしで調製されたハエと比較して有意に低い。ノンパラメトリックWilcoxon対応検定、 N = 8-12。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足ファイル1:Grid_holder(STL)。 電力網を保持するために使用されるカスタム設計コンポーネントのSTLファイル。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル2:Grid_holder(OBJ)。 電力網を保持するために使用されるカスタム設計コンポーネントのOBJファイル。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル3:Chamber_LaserCut。 Adobe Illustrator は、オスとメスの両方のハエの記録チャンバーの上部コンポーネントをレーザーカットするために使用されます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル4:Recording_chamber(STL)。 カスタム設計の録音チャンバーのSTLファイル。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル5:Recording_chamber(OBJ)。 カスタム設計の録音チャンバーのOBJファイル。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル6:Recording_chamber_animation。 組み立てられた記録室のアニメーションを示すMP4ビデオ。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

学習と記憶の背後にある神経回路を理解することは、神経科学の分野の中心的な目標です。ショウジョウバエで利用可能な遺伝ツールキットは、行動試験のシンプルさと汎用性と相まって、これらのプロセスを研究するための理想的なモデル生物となっています。さまざまな研究室から発表された研究では、麻酔を使用せずに機能イメージング用のハエを準備するためのさまざまなプロトコルが説明されています44,45。ただし、これらのプロトコルは大きく異なり、多くの場合、高度に専門化されたカスタムメイドのツールに依存しており、構築方法や使用方法に関するガイダンスは限られています。このプロトコルでは、全身麻酔の交絡効果を回避するハエのin vivo機能イメージングを行う方法が提示されます。さらに、このアプローチにより、同じハエ内のニューロン活動をリアルタイムで捉えることができ、さまざまな刺激への曝露前後の神経応答を直接比較することができます。

このプロトコルを完了する際の重要なステップには、ハエの吻が真空チューブに適切に配置されていることを確認することが含まれます。このステップにより、その後の接着が適切な場所で行われることが保証され、ヘッドが正しい角度にあることを確認して、目的のニューロンを視覚化します。ハエの健康を維持するためには、接着剤の塗布を最小限に抑えることが不可欠です。フライを所定の位置に固定するために必要な最小限の量を使用することが理想的です。このプロトコルでは、目の側面だけを接着して全身が自由になるようにするなど、特定のニーズに合わせていくつかの変更を加えることもできます。同様に、灌流チャンバーを記録チャンバーの上部に取り付けて、リンガー灌流または薬物送達を容易にすることができます。最後に、回転するフローティングトレッドミルは、以前に報告されたようにフライの下に配置することができ、移動指向性の解析を可能にする46,47。

このプロトコルには、ライブイメージングのためにハエを準備するためのマイクロサージェリー中にハエが受けるストレスなど、いくつかの制限があります。小さなハエを扱い、接着剤を控えめに塗布し、脳組織や体を傷つけずにヘッドカプセルを慎重に開くには、かなりの専門知識が必要ですが、これは細心の注意を払って練習し、繰り返しることによってのみ習得できます。この方法は、細胞レベルでの認知プロセスの研究に特に有益ですが、 in vivo イメージングには、電気生理学的記録と比較すると、まだいくつかの制限があります。さらに、私たちのプロトコルでは、イメージング前に麻酔を使用することを避けていますが、ハエは依然として物理的なチャンバーに拘束されているため、常に細胞の応答が変化する可能性があります。それにもかかわらず、私たちの方法論は、最適な in vivo イメージングのためにハエの健康を維持するための最も近い方法を提供します。麻酔を用いてハエを拘束する既存の方法と比較して、私たちの方法は、最小限の動きで細胞からイメージングできるようにしながら、ハエをできるだけ自由に動かし続けることを目指しています。

開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

この研究は、1R01GM147917-01A1については国立総合医科学研究所、30442についてはBrain and Behavior Research Foundationの支援を受けました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.102 mm プラチナ ワイヤーSurepure Chemetals2690
0.25 OD、0.125 ID、プラチナ硬化シリコン チューブVWR89068-474
0.3 mm ID シリコン チューブ フィッシャーサイエンティフィ11-189-14
ナナプラグアマゾン
クリルシートチャンバー用0.0125プレシジョンブランド44250
カルシウムシグマアルドリッチ746495
銅ショックグリッドカスタムメイド
DC電源
ドレメルツール3000-1レメル3000-N / 18
ウジョウバエメラノガスター/ ;;uas-tdtomBDSC36328
ウジョウバエメラノガスター/ ;UAS-GCp6F;BDSC42747この uas ラインは ;;uas-td-tom は、両方の挿入を含むストックを生成します
ショウジョウバエ melanogaster/ ;;MB077C-gal4BDSC68287
エポキシ接着剤 Gorilla4200102
ガス流量計 1.5 LPMAmazonB01N0UWZ2T
ガラス 1 mL 血清学的ピペット フィッシャーサイエンティフィ50-232-9516
ガラスフィッシャーサイエンティフィック 12-550-A3
グルコースシグマ アルドリッチG7528
HEPESシグマ アルドリッチH4034
皮下注射 12TW ゲージ チューブマイクログループ316H12TW
下注射 22X ゲージ チューブマイクログループ304H22X
塩化マグネシウム六水和物グマ アルドリッチM9272
ミリスチン酸Acros Organics156961000
ネオジム磁石 3X2 mmAmazonB0CXSQ387M
P1000 チップGenesee Scientific 23-165RL
P200 チップジェネシー サイエンティフィック 23-150RL
空気圧プッシュ コネクタ 外径 6mmマゾンB07ZHG8Y1Y
塩化カリウムシグマ - アルドリッチP3911
PTFE チューブ外径 6mmアマゾン
カミソリ ブレード  アマゾンB08LYD6645
重炭酸ナトリウムシグマ アルドリッチS5761
塩化ナトリウムフィッシャーサイエンティフィックS271-500
リン酸二塩基性ナトリウムシグマ アルドリッチS0876
スクロースシグマ アルドリッチS9378
トレハロースシグマ アルドリッチT0167
ックバブラックアイン塩化プラチナ抵抗器フィッシャーサイエンティフィックS35740用ドショショックスライド 皮シ ア

参考文献

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