ウサギモデルにおける乳がん予防のための管内エタノールベースのアブレーション注入のX線可視化

サマリー

このプロトコルは、ウサギ乳腺の乳管樹系への画像誘導注入の手順を提示します。X線造影剤を含むエタノールベースのアブレーション溶液を、透視リアルタイムイメージングにより、すべての乳頭開口部に制御注入することを実証します。

要約

乳がんは、女性のがん関連死因の第2位です。平均リスクの女性に対する積極的な介入はほとんどありませんが、予防的乳房切除術は、高リスクの女性にとって最も効果的でリスクを軽減する介入です。ただし、予防的乳房切除術は、周囲の間質、脂肪組織、および/または筋肉組織とともにすべての乳腺上皮細胞を除去する侵襲的処置です。私たちの全体的な研究目標は、乳管ツリー全体を切除液で満たすことにより、乳腺上皮細胞を局所的に殺す非侵襲的な乳管内 (ID) 送達手順を開発することです。我々は以前に、切除液としてのエタノールのID送達がげっ歯類モデル(マウスおよびラット)で有効であることを実証しました。このプロトコルは、X線造影剤としてイオヘキソール(90〜300mg/mL)を含む10〜70%エタノール溶液をウサギ乳腺の多管ツリー系にID送達します。多管系を持つウサギ(Oryctolagus cuniculus)の乳腺は、他の大型動物(牛、羊など)の乳腺よりも人間の乳房に似ています。このウサギプロトコルは、スケーラビリティ、リアルタイムイメージング、および大型動物中間モデルにおける多管ツリーシステムへのID配信の技術的課題に対処します。このプロトコルは、臨床で直接適用できる器具、材料、および試薬を使用した透視ガイド下のマルチダクト ID 送達を確立します。組織分析により、乳がんの一次予防のためのこの切除処置の将来のファースト・イン・ヒューマン評価の出発点として、上皮アブレーションを最大化し、側副組織損傷を最小限に抑えるためにエタノールの濃度を最適化することができます。

概要

乳がん (BC) は、米国で女性にとって最も一般的で 2 番目に多いがん関連死亡です。2025 年の予測では、新たに 316,950 人の乳がんが発生し、42,170 人の女性が BC¹ で死亡すると推定されています。現在、両側予防的乳房切除術は、BCを予防するための最も効果的な処置です。ただし、これは、乳癌が発生する上皮細胞とその周囲の組織を完全に除去する非常に侵襲的な手順です。その侵襲性と、この処置の心理的および社会的影響により、リスクを軽減する乳房切除術を受けるリスクの高い女性は 50% 未満です²。私たちと他の人々は、現在の予防と治療の代替として、げっ歯類モデル ^2,3 における乳がんの一次予防および/^または局所治療のための管内 (ID) 送達手順を開発しました。エタノール (EtOH) は、毒性と安全性が低く、十分に確立されており、静脈奇形の治療のための硬化剤や一部の癌の局所治療のための切除剤など、複数の臨床用途で使用されています³。通常、これらの臨床処置では、数ミリリットルの EtOH が 90-100% の濃度で注入または送達されます。私たちの以前の研究では、マウスおよびラットモデルの乳管ツリー系に直接70%EtOHを送達することは、隣接する正常組織への損傷を限定して乳腺上皮細胞を化学的に切除し、乳房腫瘍の形成を防ぐのに効果的でした4,5,6,7。この手順は、管腔体積と管腔上皮細胞表面積比が大きいウサギのより大きな管ツリーシステムにスケールアップされるため、EtOHの割合が低い(10%〜70%)溶液のアブレーション特性を調査します。臨床翻訳に目を向けると、上皮細胞の切除に効果的なエタノールの割合が最も低いほど忍容性が高く、安全性プロファイルが最も優れていると推論します。

切除液が乳腺上皮細胞と直接接触していることを保証するには、完全な乳管樹充填の確認が必要です。げっ歯類モデルでの以前の研究では、処置後にマイクロCTイメージングによる注入された管樹のX線視覚化が使用されました。画像診断のために動物を麻酔、移送、設定、および配置するのに必要な時間の経過により、FDA 承認のオムニパック (イオヘキソール) または同様のヨウ素含有高速拡散造影剤は、げっ歯類の乳管樹の視覚化には適していませんでした ^6,8。ナノ粒子ベースの造影剤、特に酸化タンタルナノ結晶を含む造影剤は、拡散が遅く、げっ歯類^の管木の視覚化に適していることがわかりました6,7,8,9。ただし、マイクロCTイメージングによるこの事後確認では、注入量の量を監視または制御することはできず、管ツリーの視覚化のためのダクトグラ^{フィー10,11}などの臨床的に確立された診断手順から逸脱します。したがって、このID手順をヒトに変換する技術的実現可能性を確立するための重要なステップは、乳腺のサイズと複雑さが増す動物モデルで注入された乳管ツリーのリアルタイム透視視覚化を実証することです。このプロトコルは、この切除手順をげっ歯類 ^4,5 からウサギ モデルにスケールアップします。進化的、解剖学的、生理学的に、ウサギの乳腺は、げっ歯類や牛や羊などの他の大型動物モデルの乳腺よりも人間の乳房に似ています12,13,14。メスのウサギには4対の乳腺があり、それぞれに4つの乳管の木が含まれていますが、げっ歯類は乳腺ごとに1つの乳管の木しかありません。ウサギの乳首は、ファースト・イン・ヒューマン臨床研究における臨床ダクトグラフィーにおける造影剤のID投与と同様の手順を使用してカニューレ挿入することができます^15,16。したがって、ウサギは、このID切除手順をヒトに翻訳して適用するための実用的で関連性の高い中間大型動物モデルを提供します。このプロトコルは、げっ歯類モデルでは対処できなかった多管ツリーシステムのIDデリバリーとin vivoイメージングの技術的課題に対処します。このプロトコルでは、管の木を視覚化するために、現在の臨床診療と互換性のある器具、試薬、および材料を使用します。したがって、イオヘキソール含有エタノールベースのアブレーション溶液の透視ガイド下注入の記載された手順は、ファーストインヒューマン臨床試験で容易に実施および評価できます。

この方法は、造影剤を含むエタノールベースの切除液をウサギの1つまたは複数の乳腺の4つの乳管ツリーすべてにカニューレ挿入し、順次注入することに成功するために、私たちの研究室で実装されています(図1、 図2、 図3)。この方法では、X線透視台上のウサギ(4か月の処女)の27 Gの鈍い先端の針を使用して、カニューレ付きの乳頭開口部にアブレーション溶液を直接注入します。この手順は、全身麻酔(イソフルラン)下で動物に対して、手術前および手術後の抗炎症治療(ケトプロフェン、非ステロイド性抗炎症薬)で行われます。透視イメージングにより、ダクタルツリーの充填をリアルタイムで監視し、分注量の速度と量を制御し、および/または個々のツリーシステムでID送達がどの程度成功しているかを判断することができます(図1、 図2、 図3)。この透視技術は、切除治療の画像誘導のための意図された臨床応用により近接しており、患者に課せられる全体的な放射線量を制限するのに役立ちます。このプロトコルは、FDA承認のOmnipaque(iohexol)がウサギの管樹の最初の充填を視覚化するのに適した造影剤であることを示しています(図3)。肉眼的検査と組織学的分析による観察により、エタノール濃度が70%になると、乳管樹の内外に急速な組織損傷を引き起こし、乳腺構造を超えて広がることが示されています(図3)。10〜40%の範囲のエタノール濃度は、70%エタノールよりも側副組織損傷が少なく、適切な上皮細胞アブレーションを提供します(図4)。ヒト患者の臨床評価のための切除液の最適なパラメーターを確立するには、アブレーション溶液ごとに適切なパワードのグループサイズと時間制限のある組織収集を使用して、この手順を使用した縦断的研究が必要になります。

プロトコル

記載されているすべての実験は、ミシガン州立大学の施設動物管理および使用委員会によって承認されたプロトコルに基づいて実施されました。ウサギ(Oryctolagus cuniculus)は、実験動物の世話と使用に関するガイドとUSDA動物福祉法に従って、AAALAC認定施設で世話をしました。

注:この方法は、商業的供給源から入手した年齢(4か月から>1歳)および体重(2.6〜4.2 kg)の範囲の処女(未経産)および引退したブリーダー(経産)ニュージーランドの白い動物で実施されました。私たちの経験では、乳首のサイズを予測するには、体重によって決定される動物のサイズは、動物の年齢よりも信頼性が高くなります。一般に、体重が3.3kgを超える動物は、カニューレ挿入に適した乳首を持っています。以下に説明するプロトコルは、長期的な有効性、創傷治癒、毒性、および安全性の研究により適しているため、生後4〜5か月、体重が3.3 kgを超える処女動物に焦点を当てています。

1. 術前の準備

1. 新しい施設に到着後、特に回復手順や長期研究を目的とした動物の場合は、到着後少なくとも1週間は動物を順応させます。この最初の1週間は、ウサギを毎日監視/チェックし、順応プロセスを助けるために、施設のガイドラインで推奨されているように、おやつ、栄養強化を供給します。
2. ウサギ(~生後4ヶ月のニュージーランドホワイト)を認可された住宅施設から入手します。施術前に体重を記録してください。
   注: 体重は、麻酔に必要な計算を準備するために、手順の前日に記録できます。引退したブリーダー(1歳>、>3.5kg)も、乳首が大きく、個々の管のカニューレ挿入が容易であるため、使用できます(図3)。これらの理由から、引退したブリーダーは、管内手順に慣れて最適化するために、最初の実験に使用できます。
3. イソフルラン投与の20分前にケタミン35mg/kgとキシラジン5mg/kgを筋肉内に注射し、動物を鎮静させます。
   注:麻酔はウサギの体重に基づいて投与され、各薬物の範囲は次のとおりです:ケタミンの場合は15〜35 mg / kg、キシラジンの場合は2〜5 mg / kg。脱毛と挿管に進む前に、動物が鎮静されていることを確認してください。これは動物とスタッフの福祉と安全のためです。鎮静が確認された後、ウサギを画像/手術台に背側に置くことができます。
4. 鎮静の臨床徴候が示された後(すなわち、静かな態度、部分的に閉じたピンク色の目)が示された後、鎮痛のために5 mg / kgのケトプロフェンを皮下注射します。.
   注:鎮痛はウサギの体重に基づいて投与され、ケトプロフェンの範囲は2〜5 mg / kgです。
5. 適切な機器(気管内チューブや声門上気道装置など)でウサギを挿管し、ウサギを麻酔するために適切にテストおよび認定されたイソフルランマシン(1〜2%イソフルラン、1.0 L / min酸素)に接続します。動物の呼吸を注意深く監視して、麻酔がイソフルランの1〜2%に維持されていることを確認します。手順全体を通して、SpO₂、心拍数、呼吸数、および体温を介してウサギの酸素飽和度を監視します。
   注:挿管チューブのサイズは、ウサギの体重とサイズに基づいています。ただし、サイズ範囲は必ずしも正確であるとは限らないため、特定のウサギに最も適したサイズを確認するには、さまざまなサイズを用意しておくと役立ちます。ノーズコーンマスクは、麻酔目的で気管内チューブの代わりに使用することもできます¹⁷、このマスクは挿管によってもたらされる動物の気道の保護を提供しないことを認識しています。ウサギの体温を維持するために、37°Cに設定した温水循環ブランケット(ウォーミングブランケット)をタオルの下に置きます。
6. 25 G 静脈カテーテルを辺縁耳静脈に配置して固定し、緊急薬物投与を可能にします。
   注:ウサギの静脈のサイズに応じて、24〜26のゲージ範囲を使用できます。
7. 眼の炎症や角膜の乾燥を防ぐために、両目にアイ潤滑剤を塗布します。
8. 電動カミソリで2対目と3対目の乳首の周りの毛皮を剃ります。綿先アプリケーターを使用して、乳頭部分に脱毛クリームを塗ります。クリームがその領域に15秒間接触するのを待ちます。
   注意: カミソリで乳首を傷つけないように細心の注意を払う必要があります。コードレス掃除機は、清潔な処置エリアを維持するためにも使用できます。
9. ガーゼパッドを滅菌生理食塩水で濡らし、脱毛クリームを塗布して15秒後にクリームをすすぎ、動物の毛皮をほぐすために使用します。毛皮が取り除かれた乳頭の領域への視認性とアクセスが良好であることを確認します。必要に応じて繰り返します。
   注:クリームは、10〜30秒の可能な限り短い間隔でウサギにとどまり、皮膚への化学火傷を避けるために完全に取り除く必要があります。

2.管内注入

1. BSL2組織培養フードで無菌条件下でストック溶液から適切な量を混合することにより、アブレーション溶液を調製します。
   注:イオヘキソール(350 mgヨウ素/ mL)は、光感受性のため、暗い場所に保管する必要があります。この実験では、さまざまなEtOH濃度が使用されました。EtOHの他の割合をテストするには、ストック溶液を必要な濃度のアブレーション溶液に希釈します。EtOH、PBS、または滅菌水の割合の異なるアブレーション溶液で同じ濃度のヨウ素を維持するために、体積差を埋めることができます。
2. この例では、10%EtOH、280mgヨウ素/ mLイオヘキソール、1%食用色素の新鮮なアブレーション溶液を5mLチューブに調製します。最終容量5 mLの場合、4 mLのイオヘキソールストック(350 mgヨウ素/ mL)、500 μLの100%EtOH(200プルーフ)、450 μLのPBS、50 μLのストックブルー食品着色料を加えます。
   注:各管木は最大400 μLで満たすことができますが、通常、3.5 kg未満の動物の場合は250〜350 μLです。食用色素の代わりに0.2%までのエバンスブルーを使用できます。Evans Blueは、注入直後に全マウントまたはその他の組織分析を意図している場合に好ましいオプションになる場合があります。
3. 細かい尖った鉗子で乳管の開口部を覆っている古い角質を取り除きます。
   注:ウサギは、乳頭から角質化したプラグが突き出ている可能性があり、取り外さないとカニューレ挿入が成功しない可能性があります。局所リドカインを乳頭の周囲に適用して、注射部位の周囲の刺激を最小限に抑えることもできます(表1)。
4. クロルヘキシジンガーゼパッドで注入部位を拭きます。
   注:クロルヘキシジンは、カニューレ挿入前に注射部位を消毒するための洗浄剤として使用されます(表1)。
5. 28G針(長さ:12.7 mm)のベベルを乳頭の側面に挿入し、200 μLの0.9%生理食塩水を200 μL/分の速度でゆっくりと注入します。これにより、ダクト開口部をよりよく視覚化できます。
   注:200 μLの生理食塩水すべてを乳首に注入する必要があるわけではありません。1つまたは複数の乳管の開口部から生理食塩水が出てきたら、注射を中止してください。
6. 1 mLルアーロックシリンジを使用して、調製したアブレーション溶液1 mLを吸引します。注射器を、12インチのオスとメスの延長線のメスの「翼のある」端に取り付けます。27 Gの鈍い先端針(長さ:12.7 mm)を延長線のオス端に慎重に取り付けます。ラインを溶液でプライミングします。アルコールガーゼパッドで針をきれいに拭きます。また、気泡が発生する可能性があるため、アブレーション液を注射器に傾けないように注意してください。
   注:これらは、乳管ツリーを完全に充填することを目的とした推奨容量です:各ツリーで最大300 μL、頸部および/または鼠径部乳腺(第1^{対および第4対)}あたり最大1.2 mL、各ツリーで最大400 μL、胸部および/または腹部乳腺(第2および第^3対)あたり最大1.6 mL。他の用途では、ダクトツリーの過充填を避けるために、実験要件および/または透視ガイダンスに基づいて、より少ないまたはより大きな容量を使用するのが適切な場合があります。延長ラインにより、流量をより詳細に制御し、注入とライブ透視イメージングを同時に行うことができます。比較のために、9〜12週齢のマウスモデル⁴における管内注入の推奨量は、頸部および鼠径部で最大30 μL、胸部および腹部乳腺で最大50 μL、およびラットモデル⁵:頸部および鼠径部で最大100 μL、胸部および腹部乳腺で最大300 μLである。
7. 10倍の拡大ランプを使用して、ダクトの開口部を見つけるのに役立ちます。指を使って乳頭をそっと持ち、針を管の開口部にカニューレで挿入します。先端が乳首の内側に完全に入るまで、27 Gの鈍い先端針をそっと挿入し続けます。乳首に針を入れるには、針を乳首に押し下げるのではなく、乳首を針に向かって持っていきます。ダクト開口部の経路をたどるように注意してください。
   注:一部のウサギでは、乳頭の開口部に針を挿入しようとすると抵抗を感じることがあります。慎重にわずかな圧力を加えて、上部の上皮細胞層を突破します。私たちの経験では、カニューレ挿入用の管の開口部を明確に識別するには、拡大装置が必要です。これは、拡大鏡、レンズ、ルーペ、または同様のデバイスである可能性があります。
8. 針が完全に挿入されたら、約200 μL/分の一定速度で300 μLの溶液をゆっくりと注入します。注入後30秒待って、カニューレのある木から針を取り除きます。これにより、注入された量がダクトツリー内に確実に残り、漏れの可能性が減少します。
   注:通常、1人の研究者がカニューレを挿入して針を保持し、2人目の研究者が注射器を持ち、プランジャーを希望の速度で押します。注入速度の急激な変化により管の木が破裂したり損傷したりする可能性があるため、シリンジポンプを使用すると、より制御された流量を持つことができます。
9. こぼれた溶液は、湿らせたガーゼまたはEtOHワイプで拭き取り、画像に無関係な造影剤溶液が入らないようにします。

3. 透視イメージング

1. 各管の木が注入された後に透視画像を撮影します。透視のパラメータは、透視X線装置で30fps、67kV、および17.3mAです。ただし、実験とイメージングのニーズに基づいてこれらを調整してください。
2. 透視画像を使用して、ダクタリングツリーを完全に満たすために追加のボリュームが必要かどうかを判断します。
   注:透視イメージングは、切除液の注入と同時にライブで行うことができます。画像撮影中に金属製またはプラスチック製の鉗子を使用して乳首を保持し、有害な X 線からスタッフを保護できます。これにより、ダクトツリーの充填を監視できます。ライブ透視法は、肺胞末端の容積の増加に基づいて、注入を中止するタイミングをガイドできます。注入後の透視検査では、管の木が完全に満たされているかどうか、または漏れがあったかどうかを確認できます。確認透視は通常、同じ乳腺内の各管を注入した後に行われます。

4. 術後のケアと回復

1. 最後の管内注入後にイソフルランの流れを中止します。
2. 0.5 mg / kgのアティパメゾールを筋肉内注射します。
   注:回復時間は動物によって異なりますが、ウサギは注射後5〜20分で回復の兆候を示し始めるはずです。
3. 麻酔から完全に回復するまで、加温毛布の上で動物に継続的な熱サポートを提供します。麻酔から外す前に、最大5分間酸素の流れを維持します。
   注:回復の兆候には、咀嚼、咳、鼻のけいれん、眼球運動などの口の動きが含まれます。ウサギは正位反射を持ち、回復キャリアに戻る前に胸骨の位置を維持できる必要があります。回収剤は、ウサギの体重に基づいて、0.1〜1 mg / kgのアティパメゾールの範囲で投与されます。
4. 5 mg / kgのケトプロフェンを皮下注射します。
5. ウサギが胸骨の位置に維持できるようになったら、静脈内カテーテルを取り外します。過剰な出血を止めるために、カテーテルを抜いた場所にガーゼパッドをかざします。
   注:カテーテルの取り外しは、ウサギが輸送キャリアに乗っているときに行うことができます。
6. ウサギを適切な飼育施設に運び戻します。
7. 処置後少なくとも 3 日間、5 mg/kg のケトプロフェンを皮下注射を続けます。
8. 不快感、苦痛、痛み、自傷行為の兆候がないかウサギを1日1回、処置後少なくとも3日間監視します。ウサギがこれらの臨床徴候のいずれかを示した場合、ケトプロフェンによる治療を延長することができます。体重を記録して監視し、拒食症の兆候を評価します。
   注:ケトプロフェンは、ウサギの体重に基づいて2〜5 mg / kgの範囲で投与されます。炎症を軽減し、瘢痕化を最小限に抑えるために、管内注入後最大 5 日間 24 時間ごとに投与できます。皮膚潰瘍やその他の創傷治癒関連の問題による有害事象を最小限に抑えるために、注射部位にリドカインを局所的に塗布します。ケトプロフェン治療後に不快感、苦痛、痛み、または怪我の持続的な兆候を示す動物は安楽死させる必要があります。

5. 組織分析

1. 安楽死溶液(ペントバルビタールナトリウムおよびフェニトインナトリウム)を100 mg / kgで静脈内投与します。60 秒後、つま先/耳をつまむ、呼吸や心拍の兆候、角膜反射、および/または瞳孔刺激によって生命の兆候をチェックします。
2. 剖検を実行して乳腺組織を取得し、10%中性緩衝ホルマリン¹⁸中で24〜36時間後にルーチンパラフィン包埋手順のプロセスを行います。次に、標準的なヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色および/または細胞型特異的マーカーを使用した免疫組織化学染色を実行して、目的の分析読み出しを支援します¹⁸。適切な処分プロトコル(焼却など)に従って死骸を処分してください。
3. 病理学者と相談して乳腺組織を分析します。コンピューター ソフトウェア プログラムを使用して、アブレーション率と付随的な組織損傷の定量化を支援します。
   注:生後4か月のニュージーランド白ウサギに対して、生後1時間以内に、QuPath Open Software for Bioimage Analysis(https://qupath.github.io/)を使用して、注入後1時間以内に組織分析を実施しました(図4)。この分析は、H&E染色組織のみに基づいています。QuPathまたは同様のコンピューターソフトウェアには、病理学者による入力と校正が必要です。一部の細胞は、形態学的特徴だけで誤分類される可能性があります(図4)。サイトケラチンやα平滑筋アクチンなどの細胞型特異的マーカーの使用は、コンピュータ支援分類を改善するために^{使用できます6。}最終的に、細胞分類分析は病理学者によってキュレーションされ、検証されなければなりません。

結果

雌ウサギの8つの乳腺のそれぞれには、独立した乳頭開口部で開く4つの乳管ツリーがあります(図2)。げっ歯類間の乳腺あたりの管の木のサイズと数の違い(乳腺あたり1つの管のみ)により、ウサギは人間の翻訳のための優れた中間モデルです。最大400 μLの10〜70%EtOH溶液を注入して、生後4か月のニュージーランド白ウサギの乳腺の乳管ツリー全体を満たすことができます(図1、図2、図3、図4 ^4、8、9)。最大8つの乳腺にある最大4本の乳管樹に、1回のセッションでアブレーション溶液を注入することができます。典型的な実験計画は、最大4つの乳腺の1つの乳腺内の2〜3個の乳管ツリーに、ヨウ素ベースのX線造影剤を含む特定のアブレーション溶液を注入することで構成されます(図2、 図3)。イオヘキソール含有(ヨウ素90〜300 mg/mL)アブレーション溶液の場合、各注入中および/または注入後に透視検査を実施し、各管木に部分的または全量の注入溶液を注入することの個々の成功を判断します(図2、図3)。乳腺組織の収集により、製剤の変化が乳腺上皮細胞の破壊にどのように影響するかを評価できます(図4)。これらの画像解析は、周囲の組織の損傷を最小限に抑えながら、最大のアブレーションを達成するための最適なソリューションを理解するための情報を提供します。10%EtOH溶液は、より高い割合のEtOHを含むアブレーション溶液と同等のアブレーション率を提供することを決定しました(図4)。

図1:管内処置のワークフロー。 ID 手順の主要な手順が強調表示されます。詳しくは動画をご覧ください。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:管内カニューレ挿入と注入の主要なステップ。 (A)カニューレ挿入のための管開口部を拡張するために、乳頭に垂直に生理食塩水を注入します(正中面図)。(B)管樹(D1)のカニューレ挿入と充填は、アブレーション溶液中の青色色素で追跡できます(正中平面図)。(C)リアルタイム透視イメージングは、アブレーション溶液中のイオヘキソールによる管の木の充填(D1)の正確で高解像度のモニタリングを提供します(背面図)。ダクトツリーの開口部には、左から右に番号が付けられ、上象限(D1、左上象限)から始まり、下象限(D4、右下象限)で終わります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:乳頭のサイズと、複数のダクトへのアブレーション溶液の正常な送達。 ニュージーランドの白ウサギにおける乳頭サイズの典型的な提示。乳首のサイズはウサギの体重と年齢によって異なります。乳腺は、左上(L1、左頸部)から右下(R8、右鼠径部)まで番号が付けられています。すべての画像は背面に表示されます。(A)2.8 kgの処女ウサギ(上)は乳首が小さく、カニューレ挿入が困難で、3.5 kgの処女ウサギ(中央)はカニューレ挿入に適した乳首があり、4.1 kgの経産ウサギ(下)は乳首が大きく、カニューレ挿入がはるかに簡単です。(B)注入された溶液中の青い食品の色は、管内送達および管内樹木充填の in vivo 証拠として使用できます。注入の失敗は赤い輪郭 (脂肪パッド送達、上部) で示され、注入の成功は青い輪郭 (管内送達、中央と下部) で示されます。70% EtOH 溶液は、10% 溶液 (水色、下部パネル) と比較して、注入後数分 (濃い青、中央のパネル) に皮膚への損傷 (紅斑) が大きくなります。(C)透視法は、管内送達の in vivo 証拠を提供します。注入の失敗(脂肪パッドの送達、トップパネル)。D1 管 1 番目と D2 管ツリー 2 番目の連続注入の成功 (左下パネル)。ライブ透視法は、D3 管木 (右下パネル) の充填 (白い矢印) のための画像ガイダンスを提供します。イオヘキソール含有切除液で満たされた延長線と乳首を保持するための鉗子も見えます。スケールバーは、異なる倍率の画像で1cmに相当します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:エタノールベースのアブレーション溶液による管内処置後のニュージーランド白ウサギの乳腺の組織分析。 (A-B)10%EtOHアブレーション処理を受けた別の動物の右鼠径乳腺と比較して、アブレーション処理を行わない生後4か月の動物の右鼠径乳腺の代表的なH&E染色。組織スライスは正中面に沿って切断されるため、D1 と D3 (左管ツリー) は同じ組織切片に表されます。全組織ビュー(A)および高倍率ビュー(B)は、H&E染色に対するEtOHアブレーションの形態学的および色的効果(上のパネル)を示し、コンピューター支援トレーニングされた分類器(下のパネル)に基づいて推定された上皮細胞および間質細胞クラスを示します。黒のスケールバーは A の1mmに相当し、白のスケールバーは Bの100μmに相当します。(C)グラフバーは、異なる濃度のEtOHで処理された、または未処理のままにした乳管ツリー(グループあたりn>4)の細胞クラス分布を表示します。アスタリスクは、10%EtOH処理群の一致する細胞クラス(* <0.05、**<0.01、****<0.0001)と比較して、グループごとの各細胞クラスの対応のないウェルチのt検定のp値を示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

以前の研究では、70% EtOH の ID 送達が乳腺上皮細胞を切除し、げっ歯類の周囲の組織への損傷を最小限に抑えることを示しました ^6,7。この手順では、アブレーション溶液のID注入がウサギモデルにスケールアップできることを実証しました。特に、多管ツリーシステムを使用したこの大規模なモデルでは、乳腺内のすべての管の順次注入を正常に注入できることを実証します。これは、この切除処置を、高リスクの個人の一次予防のための予防的乳房切除術の実行可能な代替手段に変換する次の段階を表しています。

FDA 承認のヨウ素ベースの X 線造影剤 Omnipaque (iohexol) を使用すると、ダクト ツリーを介した溶液送達プロセスをライブで視覚化することで、注入の成功を評価できます。透視法を使用して注入された乳腺を視覚化することは、この画像誘導手順を診療所に持ち込むために配備された機器および器具である可能性が高いものと密接に対応しています^10,11。この画像診断法により、注入をいつ中止するかを知ることができるため、ライブ透視法がこの切除処置の臨床実施の重要な要素になります。げっ歯類からウサギの管樹へのこの手順の拡張性を確立しましたが、このより大きな動物モデルで周囲の組織損傷を最小限に抑えながら乳腺上皮細胞を最もよく切除するEtOHの割合を決定するには、さらなる研究が必要です。このプロトコルは、処置直後の管内注入と組織分析の実現可能性に焦点を当てました。トラブルシューティング戦略と役立つヒントを表 1 に詳しく示します。このプロトコルの主な焦点は、エタノールベースのアブレーション溶液を送達することですが、このプロトコルは、他のイメージング試薬、CRISPR/Cas9などの遺伝子修飾システム、レンチウイルスベクター、siRNA、成長因子、および/または発がん物質^2,3を局所的に送達するために、ウサギの乳腺発生および発癌の他の側面を研究するために使用することができます。

結論として、このプロトコルは、さまざまなアブレーション溶液の局所的および全身的な効果の体系的かつ縦断的な研究を実行するために必要な研究ツールを提供します。この情報は、この手順の安全性を判断し、ファースト・イン・ヒューマン臨床試験におけるさらなる開発と臨床評価に関連する懸念を特定します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ライトとクランプ付き10倍虫眼鏡、大型グースネック	アマゾン	B0D982JCZ2	乳頭の可視化用
Exel International インスリン注射器	フィッシャーサイエンティフィック	14-841-31	生理食塩水の管周囲注射用
バルク鈍針ゲージ27長さ0.5	SAI輸液技術	B27-50 100 バルク	管内カニューレ挿入用
エバンスブルー	シグマ	E2129-50G	乳腺の可視化用
透視X線イメージングシステム	GEヘルスケア	DT-C31-01	蛍光鏡画像取得用
ホットドッグ動物用加温ブランケット	ホットドッグ	WC71V	管内処置/術前準備用
男女延長線、長さ12インチ	SAI輸液技術	EXT-12	管内処置用
オムニパック 500 mL (350 mg ヨウ素/mL)	GEヘルスケア	0407-1414-72	X線可視化用造影剤(透視)
滅菌ブルーの食品着色料	マコーミック	930641	乳腺の可視化用
滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	サーモフィッシャー	14190250	溶液調製用
注射 器	BDの	309659	管内注入用
Vゲル	Docsinnovent	D30001 - 30006	挿管用(カタログ番号はV-gelのサイズによって異なります)
ケトプロフェン	コベトラス	#005488	鎮痛用
ケタミン	コベトラス	71069	鎮痛用
局所リドカイン	コバータス	70859	鎮痛用
キシラジン	コベトラス	80907	麻酔用
エウタソル	コベトラス	#009444	安楽死の場合
目の潤滑剤	コベトラス	75848	麻酔用
アチパメゾール	コベトラス	82124	麻酔用
バナナチップ	バイオサーブ	#F7161	順応のために
フューリティジェム	バイオサーブ	#F5136-1	順応のために
ヨーグルトドロップ	バイオサーブ	#F7200-1	順応のために