方法論記事

再利用可能な肝臓画像診断ツール:肝生命内顕微鏡検査用の再利用可能な3Dプリントツール

DOI：

10.3791/68337

⸱

2026年3月17日

 ,  ,  , 
1Cavendish Laboratory, Department of Physics, University of Cambridge, 2Thoracic and GI Malignancies Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, 3Facultad de Ciencias Físicas, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 4Programa de Pós-Graduação em Ciências de Materiais, Centro de Ciências Exatas e da Natureza, Universidade Federal de Pernambuco

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、生マウスの生命体内顕微鏡検査(IVM)用に最先端の再利用可能な肝画像診断ツール(RHIT)を導入し、迅速かつ急性期の実験において組織の安定性を高めます。RHITの3Dプリント設計はコスト効率の高い生産、拡張性、多用途性を提供し、さまざまなサイズのマウスにおける代謝過程の長期観察を可能にします。

要約

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肝機能および機能障害は、共焦点を用いた生命体内顕微鏡(IVM)を用いて肝臓の動的プロセスを直接可視することで評価できます。特に、質的・定量的情報の抽出において、優れた空間的・時間的精度を実現できます。顕微鏡の段階では、生理的組織条件を維持しつつ安定性と再現性を達成することは依然として困難です。体重増加と肝脂質の上昇は、2型糖尿病(T2D)および非アルコール性脂肪肝疾患(MAFLD)の動物モデルにおいてこの過程に悪影響を及ぼします。これらの制約を克服するために、組織アクセスと安定性を向上させる革新的な画像装置設計であるRHITを開発しました。RHITは、効率的なワンステップ方式で3Dプリンティングを用いて製造された再利用可能でスケーラブルな肝臓イメージング装置です。サイズは異なるサイズのマウスに合わせて変更可能です。簡単に言うと、RHITは肝臓内顕微鏡検査中に実験動物の位置を決め安定させるための3Dプリント装置であり、手術準備後の取り扱い、ストレス、変動を最小限に抑えるために使用されます。再利用可能で標準化された設計は容易に製造・カスタマイズ可能で、さまざまなサイズや実験的な設計に対応可能です。初期結果は肝内生命体内画像の安定性と信頼性に著しい改善を示し、脂質滴などの細胞内構造の詳細な可視化が可能となりました。この精度の向上により、代謝および生理学的研究が明確さ、再現性、縦断設計の可能性が向上しています。このプロトコルは、肝IVMにおける長年の技術的課題に対応する標準化されアクセスしやすいアプローチを提供します。

概要

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イントラバイタル顕微鏡は、従来の免疫蛍光組織学(固定組織や生細胞イメージング、分離細胞の流動サイトメトリー解析)とは対照的に、生体内で生物学的プロセスを動的に可視化する強力なツールです。肝検査では、胆汁分泌と流量4,5、グルコース移動6,7、非実質細胞8,9,10、肝疾患11,12の検査にIVMが用いられています。さらに、脂質蓄積の研究に関しては、IVMは生体組織における脂質滴の形成、成長、分解の動態をリアルタイムで提供し、高空間分解能での脂質滴の可視化と定量化、脂質滴の蓄積と他の細胞的・生理学的プロセスとの直接的な相関を可能にします13.これらの利点にもかかわらず、IVMは技術的には依然として難易度が高いです。専門的な機器と専門知識が必要であり、組織損傷を引き起こし、細胞の挙動を変化させ、侵襲的な処置を要求します。行動観察、生理学的モニタリング、遺伝解析に基づく従来の生体観察は貴重な情報を提供しますが、生命体内顕微鏡がもたらす空間的・時間的解像度には欠けています。

IVMの最初の大きな課題は、検査対象動物の心拍や呼吸によるアーティファクトの不安定性を制御することで、画像品質が損なわれ、観察される生物学的過程の画像が曇ったり歪んだりすることがあります15。画像処理でこれを修正しようとする試みは、重要な空間的・時間的情報の喪失や高度な手術機器やメンテナンスの必要性を招くことが多い16,17。第二に、肝疾患研究用のマウスモデル(MAFLDやT2Dなど)は肥満が多く、サイズや組織脂質含有量の増加により安定化が難しいこともあります(16,18)。肥満のNAFLDおよびT2Dマウスモデルでは、体重増加は標準顕微鏡ステージの負荷容量を超え、動物の安定化を複雑にし、生命体内イメージングに機械的な課題をもたらします19。この追加の重量は、動作アーティファクトや組織圧縮のリスクを高め、これらは撮影精度を低下させます。

同時に、肝脂含有量の上昇は組織の不透明度と光散乱を増加させ、画像の解像度とコントラストを低下させます。これらの効果はしばしば灌流の変化や炎症などの代謝併存症によってさらに悪化し、造影剤の分布や信号の明瞭さがさらに低下します21。最後に、組織生理学や生物学的活動を維持するために画像撮影中に一定の体温を維持することは困難であり、再現性を損なうこともあります。さらに、IVM中に顕微鏡ステージ上で肝臓を安定的に位置させることは、機械的ストレスや組織損傷を防ぐために重要です。肝組織の露出は繊細な処置であり、重度の出血や肝実質損傷を防ぐために技術的精度が求められます7。動きのアーティファクトを減らすために、マウスの肋骨は段ボールで顕微鏡から持ち上げられ、重力で肝臓を体の他の部分から引き離しました。この方法は定量的なデータを生み出すことに成功することが示されましたが、段ボール素材は形を崩し洗浄が困難で持続可能ではありません。さらに、肥満のマウスモデルに合わせて段ボールのインサートのサイズを変更するのは難しいです。

近年、走査光場顕微鏡や計算強化光学システムなど、いくつかの先進的な肝内生命体内顕微鏡技術が登場し、時空間分解能23、光毒性24の低減、画像深度25,26の拡大、運動アーティファクト抑制27の改善が示されています。これらの発展は、最近の研究28、29、30で示されたように、この分野における重要な技術進歩を示しています。本論文では、マウス肝臓のIVMのための革新的なツールである再利用可能な肝臓イメージングツール(RHIT)を紹介します。RHITは、代謝疾患を含む多様な動物モデルにおいて、機械的安定性と組織アクセス性を高めるスケーラブルかつ再利用可能なツールを提供することで、この進化する環境に貢献しています。その設計は、解剖学的適合性、ステージングの再現性、使いやすさを統合することで、動き、変動性、セットアップの複雑さという持続的な課題に対応しています。RHITは従来型および先進的な画像手法との互換性により、これらの新興技術の有用性を拡大し、信頼性が高く生理学的に安定した肝内画像化を促進します。

IVM中に組織を安定させるために、手術用ウィンドウ9,31,32,33,33,34,35,36やカスタム組み立てのアクリルステージ6,37などが提案されていますが、これらの方法は拡張性、再現性、手術技術に関して多くの制限や複雑さももたらしています。比較すると、RHITは目的と設計において機能的に異なります。直接圧縮やゲルベースの埋め込みには依存しません。代わりに、RHITは重力による肝臓の隔離を支持し、組織を制限したり歪めたりすることなく、生理的な姿勢を維持する、拡張可能で再利用可能、解剖学的に形状化されたツールとして機能します。特に、RHITは幅広いマウスサイズにおいてデータの再現性、画像精度、手続きの一貫性を向上させます。ジェルや接着剤、複雑な手術用インターフェースの必要をなくし、組織の整列や温度管理を簡素化します。さらに、RHITは動物と顕微鏡のインターフェースをつなぐ特殊なツールであり、生理学的支援と画像取得の精度の両方を支援するよう設計されています。

RHITは、より大きな動物サイズに対応しつつ、プラットフォームの不安定性を最小限に抑える重量を均等に分散させるスケーラブルな形状構造を通じて、代謝的に損なわれたモデルの機械的・光学的課題に直接対応しています。後退型肝開口部は、圧縮力なしで重力を利用して組織を安定化させ、一貫したアクセスを可能にし、画像撮影中の動きを抑えます。再利用可能で化学的に不活性な設計により、生物組織との互換性を確保しつつ衛生的な再利用を支援します。一貫した位置取り、運動アーティファクトの最小化、組織の完全性の維持により、RHITは生命体内顕微鏡のワークフローにおいて基礎的な進歩を提供します。その適応性とオープンソースの利用可能性は、実験室や動物モデル間での広範な有用性を促進し、標本とイメージングシステムの両方をサポートする新たなイメージングツールの基準を打ち立てています。

さらに、市販の加熱顕微鏡ステージは高度な顕微鏡セットアップや取り扱いを必要とする場合があります。標本ごとにスケール可能ではなく、一般的に高価なため、多くの研究者にとって入手しにくくなっています。したがって、再利用可能なスケーラブル挿入物は、異なる動物モデル向けにIVMを標準化するために重要です。3Dプリント技術は、付加製造とも呼ばれ、科学実験室でますます普及し、生化学、物理学、生物学の実験プロトコルを変革しています。IVMでは、3D技術が軽量イメージング光学ウィンドウ41,42の製造、組織アクセスの改善43、組織修復および再建の促進に用いられています。したがって、私たちの知る限りまだ説明されていない組織安定化用のカスタマイズツールが、肝IVMの課題を克服するために3Dプリンティングを活用する絶好の機会を提供しています。

RHITはワンステップ3Dプリンティング方式を用いて作成され、長期間にわたり組織の安定化を大幅に改善します。RHITは非常にアクセスしやすく、最小限の外科的専門知識を必要とする急性IVM実験に適しています。さらに、RHITは動物サイズに容易にスケール可能で、生産コストも低く抑えられます。最後に、RHITが安定したタイムラプス蛍光イメージングを可能にし、従来の段ボールインサートと比較して組織の安定性を向上させることを示しました。RHITは肝脂質恒常性のIVMを直接接触せず、生理的状態への測定可能な影響なしに簡素化します。したがって、RHITはIVM 34,36,45に対して加速され、再利用可能で適応可能な貢献として競争優位性を提供します。

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図1:RHIT設計。 (A) 肥満マウス用にスケールした3.0 mm RHITの設計と寸法。正面図(左)は組織開口部の寸法、位置、大きさ、そして画像撮影中のマウスの向きを示しています。側面図(右)には寸法が含まれており、ヒートパッドと温度プローブの位置を示しています。異なるマウスサイズのスケーリングパラメータは 表1に示されています。(B) オープンソースSTLファイルから生成されたRHITの3D正面図で、直腸プローブワイヤーがカスタムポートから挿入される場所を示しています(直腸プローブ挿入の寸法は右上に示されています)。(C) RHITの技術的組立:加熱装置と様々なRHITサイズのカスタム構造用インサートの統合を示し、ワイヤーは直腸プローブのインサートに装着され温度プローブへのアクセスが可能となります。略称:RHIT = 再利用可能な肝臓画像診断ツール。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

RHITはもともと、溶融堆積モデリング3Dプリンティング45で広く使われる熱可塑性ポリマーであるABS(アクリロニトリル・ブタジエン・スチレン)を用いた単一部品アセンブリとして設計されました。ABSはこの用途にいくつかの利点を持ちます。軽量で耐熱性(融点~200°C)、そして優れた耐衝撃性(46、47、48)です。RHITの設計はABSの可変密度を活用し、心拍や呼吸などの生理的動きを吸収します。インフィル密度の増加は動きの減衰を強化し、画像の安定性と画質の向上につながります。

RHITは、ABSのような化学的に不活性な材料の密度を調整して運動を吸収するよう設計されています。ここでの密度とは、3Dプリント中に使用される内部充填の割合を指し、プラットフォームの剛性や振動の減衰能力に影響します。49、50、51。ABSの密度を高めることで、心拍や呼吸による運動の伝達が減少し、安定した画像プラットフォームと画質の向上が期待されています。内部充填密度が異なるRHIT構成(20〜100%)を試験し、高密度構成がマウスの肝臓内生命体画像検査で目に見える動きのアーティファクト減少を質的に観察しました。高密度構成は試験されたすべてのRHITサイズで十分に頑丈かつ有効であり、通常のイメージング条件下でも一貫して信頼性の高い性能を提供したため、正式な定量化は行われませんでした。ほとんどのユーザーにとって、このデフォルトの密度はこれ以上の調整なしで適しています。しかし、特定の機械的特性を必要とする実験では、充填密度や設計パラメータを修正でき、そのようなカスタマイズをサポートするための完全な3Dプリント指示も提供されています。

印刷には代替材料が使われることもあります。しかし、ABSはRHIT製造においていくつかの重要な利点を持つため、好まれる材料です。化学的に不活性で、組織や体液との相互作用リスクを最小限に抑え、水に不溶性であるため、効率的な洗浄、保管、再利用を可能にします。これらの特性により、ABSは実験的な使用において信頼性が高く耐久性のある選択肢となっています。融合堆積モデリングプリンターへのアクセスが限られている場合は、他の3Dプリント技術や材料を利用できます。ステレオリソグラフィー、選択的レーザー焼結、マルチジェット融合は、ナイロン、フォトポリマー樹脂、複合粉末などの材料に適した選択肢です。ナイロンは耐久性と柔軟性を提供しますが、ステレリリソグラフィー樹脂は細かい構造的詳細が必要な用途に高い解像度を提供します。RHIT設計は異なる材料の公差や制約に容易に適応でき、さまざまな印刷プラットフォームと互換性があります。ユーザーは機械的安定性、生体適合性、画像処理の互換性、利用可能な印刷資源に基づいて材料を選択するべきです。

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プロトコル

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すべての動物実験は、動物実験倫理委員会(プロトコル番号)が認可したガイドラインとプロトコルに従い、国立衛生研究所の動物施設で実施されました。LCMB-037)。すべての職員は、以下のプロトコルを進める前に適切な訓練を受けることが求められます。動物の取り扱いは機関のガイドラインに従って行われました。

RHITプロトコルは、生命体内顕微鏡(IVM)実験で使用するための再利用可能な肝画像ツール(RHIT)の準備方法を概説しています。実験的手技は滅菌された顕微鏡室(フード)で行われ、一連の工程から成り立っています。まずRHITのプリント、麻酔、マウスの蛍光標識、次に顕微鏡のセットアップ、次に外科的手技、最後にRHIT補助IVMの適用です。図1と図2は、共焦点顕微鏡を用いた生標本のイメージングに必要な構成要素を示しており、RHITの配置用金属インサート5、6、7(生標本イメージング用の顕微鏡アダプター)や、高度なまたは制御されたステアトーシスで使用するRHITが含まれています。システムの試験のために、6〜10週齢の雄C57BL/6J Mus musculusを入手し、実験の8〜10週間前に標準または西洋の食事を与えました。

1. RHITの改良設計

  1. RHITを再現するには、3D製品設計ソフトウェア( 材料表を参照)を使用してください。設計ソフトを開き、新しい標準部品を作成します。適切な説明とともにファイルを保存してください。
  2. 「 Create 2D Sketch 」機能を使ってフロントプレーン上でRHITのスケッチを作成します。
    1. 長方形アイコンをクリックし、その左下隅をスケッチ平面の原点に置きます。
    2. 最初の長方形の中にもう一つ長方形を描き、RHITのイメージングウィンドウを表します。
    3. Dimension機能を使って両方の長方形に寸法を追加し、すべての長さと幅が原点と互いの相対基準になっていることを確認してください。
    4. マウスのサイズに応じてRHITの寸法を調整してください。
    5. RHITに厚みを加えるために、外側の長方形だけを選択して押し 出をクリックします。ポップアップが表示されたら、 エクストラード ツールでスケッチを選択して中央に開口部を残してください。
    6. 押出されたRHITの下面を選択し、「 2Dスケッチ開始 」機能を使って新しい2Dスケッチを開始します。
  3. ヒートパッドのポケットを定義するために長方形を描いてください。取得した寸法を Dimension 機能で適用してください。
    1. 2Dスケッチを終了し、 Cut Extrude ツールを使ってヒートパッド用の深い空洞を作ってマテリアル除去を行います。
  4. キャビティと同じ面に温度プローブの新しいスケッチを書き始めます。「 2Dスケッチを始める 」をクリックし、 円 のアイコンを選択してください。円を平面面に置き、それに応じて寸法を決めます。 スケッチ モードを終了してください。
    1. 押し 出 をクリックして円のスケッチを選択してください。E型構造 モードでは「カット 押出」をクリックし、材料を除去するための「全てを通す」オプションが表示されるポップアップが現れるのを待ちます。 OKをクリックします。押 出 モード終了。
    2. ウィンドウの端にフィレットを追加するには、フィレットアイコンをクリックし、8つのシャープエッジすべてを選択してください。フィレットサイズを追加してフィ レット モードを終了します。
      注意:追加の動き吸収が必要な場合は、3Dプリント準備中に内部充填密度を増やすことができます。
  5. 3Dプリント用にモデルを準備するには、 環境 タブに移動して「3D プリント 」タブを選択します。
    1. Set Orientation機能を使って、モデルがプリントベッドに平らに横たわり、垂直方向に向いていないことを確認してください。
    2. 「 印刷オプション 」をクリックするとユニット設定を設定でき、必要に応じてスケールを調整できます。
    3. 完成したモデルを保存してください。 STL エクスポート機能を用いたSTLフォーマット。
    4. 環境タブを終了して「保存」をクリックしてRHITをソリッドパーツとして保存します。
  6. デザインプログラムを終了しろ。
    注意:プリンターが と互換性があることを確認してください。STLファイルフォーマット、または3Dプリンターソフトウェアが要求する適切なフォーマットに変換してください。

2. STLファイルからのRHITのアップロードおよび印刷

  1. 図1Aまたは補足ファイル1から.stlファイルを3Dコンピュータ支援設計(CAD)ソフトウェアにインポートし、.stlファイルを選択できます。「準備」ボタンをクリックして、モデルを薄い層にスライスして3Dプリント用に行います。
  2. 適切な3D商用プリンターを選択して「印刷」をクリックします。その後、プリントの進行状況を監視し、プリントが完了したら必要に応じて3Dプリントのオブジェクトを取り出して清掃します。
マウスサイズマウスの体重(g)RHIT厚さ(mm)イメージングウィンドウサイズ L X W(MM)
小(S)17-201.517 x 17
ミディアム(男性)22-252.521 x 21
ラージ(L)35-40326 x 26

表1:マウスサイズをRHITにスケールする。 マウスの重さはRHITの厚さに合わせてスケールされ、30gを超える(矢じり)が最大のRHIT(3.0mm)に相当します。最も軽いマウスは最も薄いRHITに対応し、肥満マウスは最も太いRHITで表されます。これらの寸法はCADソフトウェアで調整可能です。RHITの長さやイメージング開口は、使用する標本の臓器の位置によって異なる場合があります。3つのRHITすべてにおいて一定の長さとイメージング絞りは本研究に適しています。略称:RHIT = 再利用可能な肝画像診断ツール;CAD = コンピュータ支援設計。

3. 顕微鏡の準備とRHITの利用

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図2:RHIT技術を用いた肝臓の体外図。(A) 麻酔マウスを用いた逆さ共焦点顕微鏡装置の概説。(B)金属製顕微鏡アダプター(インサート)を用いて、ライブイメージングのためにマウスを顕微鏡ステージに配置しました。(C) 3DプリントされたRHITはガーゼストリップと共に使用され、肝実質を容易に操作しました。(D) RHIT位置取り前の外出前肝臓の画像。鼻のコーンは手術前および手術中に麻酔に使用されました。(E) 急性手術中にRHIT位置取り前の外側肝臓の画像。髭剃りは必要ありませんでした。(F) RHITの最終裏面向きの逆さまマウスの画像(画像)。(G)RHITが顕微鏡ステージにしっかり取り付けられている。(H) RHITと金属アダプターに位置したマウス。(I) J-Lでそれぞれスケール付きのRHITインサートを付けた赤身(青い矢印)マウスと肥満(緑の矢印)マウスは、それぞれ肥満肝と瘦削肝臓の大まかな解剖学的画像を示しています。肥満マウスと瘦削マウスの肝臓M,Nの高解像度画像は、脂質滴にBODIPY(緑色、ピンクの矢印で示される)とHoechst 33342(白色、シアンの矢印で示される)で標識を付け、核を標識しています。略称:RHIT = 再利用可能な肝画像診断ツール;IVM=生命体内顕微鏡検査。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

  1. 図2に示すように、肝IVM用の従来型逆向き共焦点顕微鏡を準備します。
    1. サンプルを収めるためにステージアダプターを挿入してください。このプロトコルに従うには、35mmの円形開口部と40mmのカバーガラスを持つ特注の金属インサートを使用します。
    2. 各画像の前後に、必要に応じて70%エタノールを使ってカバーガラスの両面を徹底的に清掃してください。
  2. マウスサイズに基づいて適切なRHITを固定します(表1参照)。RHITの開口部を対物レンズに合わせ、金属インサートのイメージングカバースリップ(図2G)に平行に貼り付け、カバーガラスにテープを貼ります。
  3. 撮影用の対物レンズは、面積面積、空間分解能、撮影時間に基づいて選びます。例えば25倍/0.95の水対物レンズなどです。
    注意:倍率が高いと解像度は向上しますが、動きによるアーティファクトのリスクも高まります。
    1. 対物レンズをカバーガラスの近くに水平にします。
  4. RHITの窓に約1×8cmのガーゼの帯をテープで固定し、組織の位置を整え他の腹部臓器から分離しやすくします(図2C)。
  5. RHITはスロットにヒートパッドを挿入し、RHITの隣にヒートプローブを固定してイメージング中にマウスの体温を保ちます(図2G,H)。

4. 蛍光標識とマウス麻酔

  1. 麻酔誘導室を消毒して動物の臭いの最後の痕跡を取り除くことで、ネズミのストレスを軽減しましょう。
  2. 酸素コンデンサー、環境保護システム(EPS)、イソフルラン蒸気化器を起動します。
  3. マウスを誘導チャンバーに入れ、2〜3%のイソフルランを用いて約3〜5分間、または動物が安定した呼吸と正しい姿勢や足の反射を失うまで麻酔します。
    1. 麻酔後、マウスを温熱パッドに移し、鼻錐体から1-2%のイソフルランを投与して麻酔を維持します(図2D)、必要に応じて安定した手術面の麻酔を保ちます。
    2. 麻酔の深さを評価するために、足の指をつまむテストを行い、任意の動きを観察してください。
  4. 脂質豊富な構造を標識するには、31Gのインスリン注射器を使って尾静脈からPBSで希釈したBODIPY 665/676(総体積200μL)200 nmolを注入します。
    1. 最適な信号を得るために、画像検査の2日前に1日1回連続でBODIPYを投与してください。2回目の注射後は少なくとも3〜4時間経過させ、背景の全身クリアランスと組織信号の安定化を確保してください。
  5. 核造影を得るために、1xヘパリン溶液(120μLのヘパリンと180μLの生理食塩水を混合して400 U/mLを得て400 U/mLを得て製製)に希釈したHoechst 33342(2 μg/g)を31Gのインスリンシリンを後眼窩洞から注入します。
    注:ホエストは他の染料と混ぜた際の沈殿を避けるため別途投与されます。
  6. 血管を可視化するために、ステップ4.5で述べた同じ1xヘパリン溶液に希釈した蛍光デキストラン(70 kDa)18 μg/gを、対側の眼窩後部洞から31Gインスリン注射器を用いて注入します(表2参照)。
    注意:ヘパリンは血栓形成を抑え、画像診断時の安定した血流を促進するために含まれています。
  7. ホエストとデキストランの注射後、手術と画像検査を始める前に10〜15分待ってください。
蛍光リポーター目的重量あたりの投与量(または濃度)
ホエヒスト 33342染色核2 μg/g:注入液を50 μlにヘパリン溶液で補足
ボディビー 665/676染色脂質滴0.8 μg/g:サプリメント注入量を生理食塩水溶液中の200 μlまで
2Mテトラメチル・ローダミン-デキストラン(デキストラン)染色血管18 μg/g:注入液を50μlにヘパリン溶液で補足します

表2:蛍光リポーターの選択肢。この表は、in vivo imaging のためにマウス組織を標識する方法を詳細に説明しています。まずヘパリン溶液を準備し、その後DAPIヘパリンおよびデキストランヘパリン溶液7を用います。Hoechst 33342は片目に後眼窩注射され、BODIPYは2〜3日前に尾の静脈に直接注射されます。肥満マウスでは濃度が高くなります。デクトレンはもう一方の目に後眼窩注射されます。各眼で別々に後眼窩注射を行うことが重要です。略称:DAPI = 4',6-ジアミジノ-2-フェニリンドール。

5. マウス手術

  1. 腹部の被毛はヘアクリッパーや脱毛クリームで剃ってください。髪の残りを取り除き、露出した肌を70%エタノールで洗浄します。
    注:IACUCの施設要件に応じて、適切な手術部位準備を確保するためにベタジンとエタノールの交互スクラブが使用されることがあります。
  2. 手術前に麻酔の深さを再評価してください。
  3. 肋骨の下に、歯骨から外科用ハサミで肋骨の下に水平に三日月形の2〜3cmの切開を開き、上腹部の左外側で終わらせます。
  4. 最初の切開後は、左葉を露出させるために筋肉層に小さな二次切開を慎重に行い、出血を防ぐために必要に応じて焼灼(任意)を行います(図2E)。
    1. 焼灼器を使用する際に肝臓への熱ダメージを防ぐには、肝臓と筋肉層の間に生理食塩水浸しガーゼを挟み、筋肉層から発せられる熱を吸収します。
    2. 過度の出血、外科的または機械的外傷、外部圧迫は避けてください。
  5. 肝臓が露出したら、マウスを顕微鏡ステージに移します。

6. 顕微鏡ステージでのマウス配置

  1. 麻酔を受けたマウスの腹部を顕微鏡のRHITプラットフォームの上に下向きに配置します。
    1. ネズミが麻酔下に置かれたままになるように鼻のコーンを調整してください。
    2. 生理食塩水で湿らせた綿先端のアプリケーターを使い、肝臓の左外側葉をカバースリップに優しく押し付けながら、胸腔に優しい外部圧力をかけます。
      注意:重力を利用して、肝臓を慎重に外側に動かし、カバーガラスに乗せてください。
    3. ガーゼストリップを使って肝臓をマウスの体から優しく切り離します(図2E-H)。
  2. 画像検査中もマウスが麻酔状態にあるか再度鼻のコーンを確認してください。
  3. 露出した虫歯の縁に水性ジェルを塗布し、ヒートパッドへの直接接触を避けることで組織脱水を防ぎます。
    注:温度と湿度の維持は、湿度チャンバー5、6、7の密閉型顕微鏡でも支援できます。
  4. 角膜乾燥を防ぐために眼科軟膏を塗布してください。
  5. タイムラプスIVMを設定して7.52の撮影を開始します。
    1. レーザーシャッターを開け、蛍光標識を評価し、血流が顕著な安定した関心領域を特定します。画像フォーマット、取得速度、撮影間隔、総取得時間、ライン/フレーム平均(512ピクセル×512ピクセル、1〜5フレームs⁻¹、撮影間隔5〜30秒、総取得時間5〜20分、ライン/フレーム平均2〜8、実験要件によります)を選択してください。蛍光閃光の露光を最適化し、使用する蛍光色素に対応します。
    2. 取得パネルでZスタックを選択し、Z位置コントロールで上下焦点面を調整し、Set First/Set Lastで距離を確認することでZスタックの上限と下限境界を定義します。その後、「Start Experiment(またはStart Acquisition)」をクリックしてタイムラプス録画を開始します。画像検査終了後、施設動物ケアおよび委員会承認プロトコルに従って動物を安楽死させます。

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図3:SSIMを用いたRHITの肝IVM安定性の改善測定。 左下肝葉の肝IVMは3つの安定化条件下で見られます:(A)挿入物なし(なし)、(B)段ボール挿入物なし、(C)RHIT。組織にはBODIPY(マゼンタ、脂質)、Hoechst 33342(緑色、核)、デクトレン(シアン、血管)が標識されています。パネル A と B では目に見える歪みや動きのアーティファクトが見られ、 C パネルではRHITでより鮮明な映像が示されています。(D) 画像の安定性を定量化するために構造類似指数(SSIM)を計算しました。棒は平均のSEM±を示し、各色の点は個々の生物学的複製を表します:RHIT(n = 14)、Cardboard(n = 10)、No Insert(n = 8)。これらのグループは、約50〜70匹の実験コホートから抽出されたサブセットです。特定の画像診断基準(例:フレームアライメントの一貫性や画像品質)を満たすセッションのみがSSIMで解析されました。RHITは一貫して高いSSIM値(平均0.511 ± SEM)を生み出し、画像条件下での安定性と解像度の向上を示しました。スケールバー=15μm。代表的な画像が示されています。SSIMは組織損傷や障害が観察されることなく連続したIVMセッションを反映しています。略称:RHIT = 再利用可能な肝画像診断ツール;IVM = 生命体内顕微鏡検査;SSIM = 構造的類似指数;CARD = 段ボールの挿入物。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

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結果

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RHITはCADアプリケーションを用いて設計されました(図1)。RHITの寸法は小型、中型、重いマウスに対応しています(表1)。RHITの設計は、肝臓画像撮影に対応するように絞りが設けられた長さ107.50mmのABSフラット素材で構成されています。IVMは最適(RHIT)条件および非最適条件(挿入物や段ボールなし)条件下で実施されました(図3A-C参照)。これはRHIT使用時に達成される可能性のある結果の幅と安定性の程度を示しています。RHITは約50〜70匹の異なるサイズのマウスで試験され、小型、中型、大型マウスに対応してスケール調整され、幅広い生理的条件をカバーしました。RHITの寸法は、異なるサイズのマウスに対応するためにスケールが調整されました(表1)。これにより、RHITの性能を複数の実験シナリオで厳密に検証することが可能となりました。

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ディスカッション

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肝臓内活性顕微鏡検査は広く研究されていますが、従来の方法は安定化した末端画像5,6,7,9,31,32のために非常に侵襲的かつ標準化されていない外科的手技を必要とすることが多いです。運動は肝IVMにおける再現可能な画像診断を妨げる最も難しい障壁の一つと言えるでしょう。呼吸器のアーティファクトを避ける最も効果的な方法は挿管と制御された換気であり、呼吸停止は定義されています。以前の研究では、マウスの体と顕微鏡ステージ4、5

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開示事項

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著者には利益相反を主張するものはありません。

謝辞

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この研究は、米国国立衛生研究所(NIH)の学内研究プログラム、国立がん研究所、NIH図書館の支援を受けました。H. サンチェス・コルネホは、助成金番号PE501087367-2024-PROCIENCIAを通じてペルー機関CONCYTECに財政的支援をいただき感謝します。ポラット・シュリオム研究室のメンバーおよびケンブリッジ大学量子物理学グループの協力者の皆様、批判的読書の皆様、NIH図書館スタッフ、そして技術支援をいただいたジェネティ・ガガに感謝いたします。 図2A の3Dレンダリング画像はBiorenderを用いて作成されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
½インチマスキングテープ3M汎用マスキングテープ:B40069428
40mmカバースリップバイオプテック40-1313-03191
70%(v/v)エタノールサーモフィッシャー・サイエンティフィックBP2818-4エタノール70%、水30%(水)が体積で70%です
麻酔機:AMD-3 PlusソムニAMD-17106
アクアソニック100超音波伝導ゲルパーカー研究所 01 08
ボディピー 665/67サーモフィッシャー・サイエンティフィック(インビトロジェン)B3932表2を参照してください
CADソフトウェア(Autodesk Inventorまたは同等のもの)およびnbsp;Autodesk(代表的なCADソフトウェア)該当なしソフトウェア
焼灼システムジェミニGEM 5917
クリドックス消毒剤ファーカルリサーチ・ラボラトリーズ株式会社VWR、MSPP-96118F
共焦点顕微鏡(ライカSP8または同等の機器)ライカSP8
コットンチップアプリケーターピューリタン・メディカル・プロダクツ25-806 1WC
カスタムメイドのアルミニウムステージインサート(厚さ3mm、凹み35mm)該当なし該当なし
フォラン(イソフルラン、USP)吸入用液体、250 mLバクスター10019-360-60
ヘアクリッパー(オプション)オニキス・ファイン・インストゥルメンツASWRHC
直腸プローブ付きの温熱パッドALAサイエンティフィック・インスツルメンツヒーティングパッド-1/2
ヘパリンナトリウム、1000 USP U/mLヒクマ0641-0391-12
ホエヒスト 33342サーモフィッシャー・サイエンティフィック(インビトロジェン)62249表2を参照してください
マウスヒートパッドALAサイエンティフィック・インスツルメンツヒーティングパッド-1/2
Mus musculusジャクソン研究所C57BL/6実験用マウス
生理食塩水(0.9%塩化ナトリウム)サーモフィッシャー・サイエンティフィック7210-16
RHIT(再利用可能肝撮合ツール)適用サイズ提供該当なし表1を参照
手術用鉗子、先端が曲がったファインサイエンスツール11251-23
外科用ガーゼマケッソン6939
外科用ハサミファインサイエンスツール14001-14
テトラメチルホダミン・デクトレンサーモフィッシャー・サイエンティフィック(インビトロジェン)D7139表2を参照してください
ウルトラファインU-100インスリン注射器、31 Gベティ・ミルズBD326730

参考文献

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