微生物におけるレシオメトリック蛍光イメージングのための蛍光色素ベースの遺伝子コードバイオセンサ

サマリー

このプロトコルは、制御された条件下での定量的比率蛍光イメージングのための微生物における蛍光色素ベースの遺伝的にコードされたバイオセンサーの適用について説明しています。これらのバイオセンシング戦略を高度なイメージング技術と統合することで、この方法は単一細胞レベルでの高解像度のリアルタイム分析を可能にし、低分子ダイナミクスについてのより深い洞察を提供します。

要約

微生物内の低分子動態を調査することは、微生物機能の包括的な研究に不可欠です。生物内および生物間の小分子ダイナミクスは、微生物の生理学、共生、および疾患において重要な役割を果たします。ただし、これらのダイナミクスを監視することは、既存のほとんどの手法を使用して依然として非常に困難です。蛍光色素ベースの遺伝子コードバイオセンサーは、 in vivoで 低分子のダイナミクスを追跡するための強力なツールであり、新しい発見を促進する高い可能性を秘めています。これらのバイオセンサーは蛍光イメージングで最も一般的に使用され、多くの場合、環境条件を正確に制御できる灌流装置と組み合わせて使用されます。高度なイメージング技術と統合すると、このアプローチは高解像度で空間的および時間的に分解されたデータを提供し、単一細胞の微生物応答に関する洞察を可能にします。その有望性にもかかわらず、このようなバイオセンサーの実装は依然として技術的に困難です。主要な手順を理解することは、より広範な採用にとって非常に重要です。ここでは、制御された条件下での定量的レシオメトリック蛍光イメージングのために、新しく設計されたバイオセンサーの微生物への効果的な展開をサポートするように設計されたプロトコルを紹介します。

概要

単一蛍光色素強度ベースおよびデュアル蛍光色素バイオセンサーは、さまざまな用途で研究者によって広く使用されています¹。いくつかの研究では、マルチプレックスバイオセンサー分析を採用して、^{同じ細胞内の}複数のシグナルを同時に追跡しています2。これらのバイオセンサーの多くはリガンド結合ドメインに依存しており、結合イベントが蛍^光特性を変化させるコンフォメーション変化を誘発します^3,4。遺伝的にコードされたバイオセンサーは、^{さまざまなシステム5}にわたるin vivoイメージングに不可欠なツールとなっており、空間^{と時間における}イオンおよび代謝物レベルの高解像度モニタリングを可能にします1。しかし、初期のバイオセンサーは、ダイナミックレンジと信号対雑音比(SNR)⁶に制限がありました。コンフォメーションに敏感な蛍光タンパク質(csFP)に基づく単一蛍光色素強度測定バイオセンサーの最近の進歩により、性能が大幅に向上しました。それにもかかわらず、タンパク質発現レベルの変動は、^生細胞7,8のシグナル伝達分子および代謝産物を視覚化するために一般的^{に使用される、遺}伝的にコードされた蛍光色素ベースのバイオセンサー6を使用したin vivo測定に影響を与える可能性があります。単一の蛍光色素強度測定バイオセンサーでは、生体内で変動する可能性のあるバイオセンサー発現レベルの正規化ができません。ただし、リファレンス蛍光タンパク質を組み込むと、単一蛍光色素バイオセンサーをデュアル蛍光色素レシオメトリックバージョンに変換でき、より信頼性の高い定量が可能になります⁹。非放射プロセスによるエネルギー損失により、蛍光発光スペクトルは吸収スペクトルに対してシフトし、ストークスシフト¹⁰として知られる現象です。ラージストークスシフト蛍光タンパク質(LSSFP)は、デュアル蛍光色素レシオメトリックバイオ^{センサー9,11}の最適な参照蛍光色素として採用されています。最近の進歩は、LSSmApple¹²と呼ばれる赤色のLSSFPを組み込んだGA-MatryoshCaMP6sとして知られる単色励起性グリーンアップル(GA)マトリョーシカバイオセンサーの開発です。マイクロ流体システムなどのマイクロデバイスと組み合わせると、蛍光色素ベースの遺伝子コードバイオセンサーは、共焦点顕微鏡などの技術を使用した定量的レシオメトリックイメージングのための低侵襲アプローチを提供します。この統合により、環境ストレス下での単一細胞の低分子ダイナミクスの高速イメージングとリアルタイムモニタリングが可能になります。たとえば、cAMPおよびグルコースバイオセンサーは酵母への適用に成功しています。これらのバイオセンサーを変異株と組み合わせて使用すると、糖の取り込みを支配する主要な調節ネットワークの解明に役立ちました^13,14。大きな進歩にもかかわらず、これらの技術は、in vivoでの小分子ダイナミクスを含む重要な生物学的問題を調査するための可能性をまだ十分に発揮していません¹⁵。その結果、研究所全体での広範な採用は依然として限られており、より広範な実装のための標準化された方法論はまだ不足しています。

非レシオメトリック単一蛍光色素バイオセンサーまたはバルクレベルの測定に依存する従来の方法論と比較して、GAマトリョーシカバイオセンサーに基づく当社のプロトコルは、定量的レシオメトリック分析による高解像度の単一細胞イメージングを可能にします。この方法は、大きなストークスシフト蛍光色素を内部基準として統合することにより、以前の設計の重要な制限であるバイオセンサーの発現のばらつきを補正します。さらに、マイクロ流体デバイスとの組み合わせにより、環境条件の正確な制御が可能になり、従来の灌流チャンバーまたは静的培養システム¹²よりも改善されます。このアプローチは、植物と病原体の相互作用や菌根などの共生関連など、微生物とその宿主の間の動的相互作用を研究するのにも明確な利点をもたらし、コミュニケーションと栄養交換の分子メカニズムを明らかにするには細胞レベルの空間的および時間的分解能が不可欠です。

これに関連して、微生物におけるレシオメトリックバイオセンサーイメージングのための詳細なステップバイステップのプロトコルを提示します。酵母での実装に特別に最適化されていますが、このプロトコルは、細菌を含む他の微生物での使用に適応し、植物関連微生物などの非モデル生物に拡張することができます。たとえば、バイオセンサーをマイクロ流体システムと組み合わせて使用して、酵母内のカルシウムシグナル伝達の定量的蛍光イメージングを行うことができ、環境ストレス下でのカルシウム応答のリアルタイムモニタリングが可能になります¹⁴。

このプロトコルは、研究者が新しく設計されたバイオセンサーを効果的に展開できるようにガイドし、それによって微生物システムにおけるバイオセンサーベースの蛍光イメージングを通じて生物学的プロセスの探索を進めることを目的としています。これには、酵母培養条件、最適な励起/放出設定、一般的に使用される酵母株(K601およびW303-1A MAT-aなど)との適合性に関する実用的な推奨事項が含まれています。注目すべき制限には、長時間のイメージングセッション中の光退色や、生体サンプル中のバイオセンサー発現に関連する課題が含まれます。多くの要因が in vivo バイオセンサー イメージング実験の結果に影響を与える可能性があるため、この段階的なプロトコルは、研究者が潜在的な課題を予測して克服し、それによって再現性のある実装を促進するのを支援することも目的としています。

プロトコル

1. レシオメトリックバイオセンサーの合理的な設計(図1)

注:目的の結合タンパク質は、(i)特異性、(ii)親和性、(iii)構造情報、および(iv)リガンド結合時のコンフォメーション再構成を含む関連基準に基づいて感覚ドメインとして選択されます。特異性により、バイオセンサーは交差反応性を起こさずに標的分子に選択的に応答します。親和性は、生物学的文脈における標的分子の予想濃度範囲と一致すると考えられています。AlphaFold によって生成されたような実験データや計算モデルから得られる構造情報は、感覚ドメインの 3 次元組織とリガンドによって誘発される立体配座変化についての洞察を提供します。これらの洞察は、蛍光色素に適した挿入点を特定するために使用されます。次に、意図したアプリケーションに応じて、バイオセンサーの応答性とダイナミックレンジを評価するための検証戦略が開発されます。

1. Green-Apple Matryoshka¹²カセットを感覚ドメインに挿入し、コンフォメーション変化に敏感な循環順列グリーン蛍光タンパク質(cpGFP)がリガンド結合による感覚ドメインの再構成に応答するように、マトリョーシカデザインをインシリコで構築します。
   1. Chimeraなどの分子可視化ソフトウェアを使用して、結合ドメインの構造を解析します。3次元構造が利用できない場合は、AlphaFoldを使用して信頼性の高いモデルを生成します。
   2. タンパク質構造内の柔軟なループを、タンパク質の全体的な機能や安定性の破壊を避けるために選択されたデュアル蛍光色素カセットの弱点および潜在的な挿入部位として特定します。
   3. AlphaFoldを再度使用して、挿入されたデュアルFPカセットを含むキメラタンパク質の構造を予測し、挿入によって好ましくない構造変化がもたらされないことを確認します。
   4. バイオセンサー構築物をプラスミドDNAにクローンし、酵母細胞での発現を可能にします。具体的には、新しく設計されたバイオセンサーをコードする遺伝子を、適切なクローニング技術12,13,14を用いて、酵母発現のための適切な要素を含む酵母シャトルベクターpAG416に挿入する。
   5. クローニング後、組換えプラスミドを細菌細胞に形質転換してプラスミドDNAを増幅します。精製されたプラスミドDNAを酵母形質転換に使用します。
   6. 公開されているように、精製されたプラスミドをポリエチレングリコール(PEG)を介した形質転換を介して酵母細胞に導入します¹⁶。ウラシル欠損培地上の形質転換酵母細胞をプレートし、URA3選択マーカーを運ぶプラスミドを含む陽性クローンを選択します。

2. サンプル調製

1. GA-マトリョーシカバイオセンサーを発現する酵母形質転換体を選択的培地プレート(すなわち、SC-Ura)にストリークし、30°Cで2〜3日間インキュベートしてコロニーの増殖を可能にします。
   注:酵母株は ura3栄養要求性を保有しており、これはプラスミド上のURA3遺伝子によって補完され、ウラシル欠損培地での選択を可能にします。バイオセンサーをコードするプラスミドには、栄養要求性を補完するカセットが含まれています(例: pAG416 GPD GA-MatryoshCaMP6s)。
2. 株K601 / W303-1A MAT-a(遺伝子型:ade2-1、ura3-1、his3-11、trp1-1、leu2-3、leu2-112、can1-100)から酵母形質転換体を生成します。pAG416¹²などのSaccharomyces cerevisiaeに一般的に使用される発現ベクターを使用して形質転換を実行します。
3. 形質転換後、酵母細胞をSC-Ura培地上で30°Cで培養し、次のようにリットルあたり調製し、独立して形質転換されたコロニーが現れるまで:0.77 g CSM-Ura、6.7 g酵母窒素塩基(YNB)、硫酸アンモニウム、20 gグルコース、20 g寒天、およびアデニンを150 μMの最終濃度に添加します。
4. コンピテント酵母細胞を調製し、確立されたプロトコル¹⁶に従ってPEG3350を介した形質転換を実行します。
5. マイクロ流体細胞トラッピング実験では、25%グリセロールストックをSC-Uraプレート上にストリークし、30°Cで2日間インキュベートして、独立した単一コロニーの増殖を可能にします。個々のコロニーを5 mLの液体SC-Ura培地に再懸濁し、OD600が0.5〜1.0に達するまで振とうしながら30°Cでインキュベートし、灌流システムへのローディングに適しています。

3. 灌流システムの準備(図2)

1. 一倍体酵母細胞用のマイクロ流体プレートに、GA-マトリョーシカバイオセンサーを発現する酵母細胞50 μLと、増殖用の最終SC-Ura培地および処理用の緩衝液(NaClまたはソルビトールなど)をロードして調製します。
   1. ウェル1〜8から貯蔵液を取り出します。ウェルからリン酸緩衝生理食塩水(PBS)溶液を吸引し、400 μLの滅菌水を加えます。
   2. ウェル1〜6と8を洗浄します。洗浄1:ウェル1〜8から滅菌水溶液を吸引し、400 μLの滅菌水を加えます。洗浄2:400 μLの滅菌水を吸引して加えて洗浄を繰り返します。洗浄3:400 μLの滅菌水でもう一度繰り返します。
   3. ウェル1〜6の最終充填:水溶液を吸引し、酵母増殖用のSC-Uraなどの最終灌流/増殖溶液、または処理用の目的の分析種を含む緩衝溶液を300μL添加します。
   4. ウェル8へのセルローディング:50 μLの酵母細胞懸濁液(OD600 = 0.5-1.0)を加えます。
2. マイクロ流体プラットフォームの温度制御マニホールドでプレートを密閉し、生細胞イメージングシステムに接続します。マニホールドは28°Cの温度で安定した熱環境を維持し、チューブとポンプは適切なシールと継続的な灌流を保証します。
   1. プレートをマニホールドに合わせます。掃除機をオンにします。マイクロ流体プラットフォームのスイッチを入れます。
   2. [シール]を押して、緑色のライトが点灯するまで待ちます。マイクロ流体プラットフォームソフトウェアを開き、新しい実験を作成し、ドロップダウンリストから適切な酵母プレートを選択します。
   3. Run Liquid Priming Sequenceボタンをクリックします。「細胞ローディングシーケンスの実行」をクリックして、ウェル8から培養チャンバーに酵母細胞をロードし、そこで酵母細胞を捕捉し、選択培地SC-Uraの連続灌流下で28°Cで10 kPaで一晩増殖させます。
   4. [手動モード]タブで、[ カスタムシーケンスの実行] をクリックするか、プロトコルエディターを使用して、30°Cの温度、10 kPaの流量、ステップ期間(例:10分)、灌流のために開くチャネルなどの実験パラメータを設定します。
3. 28°C、10〜17 kPaの圧力で選択培地SC-Uraによる連続灌流下で培養チャンバー内で細胞を一晩増殖させます。

4. レシオメトリック蛍光イメージング(図3、 図4、ビデオ1)

1. 迅速な顕微鏡可視化により、細胞の増殖と蛍光を評価します。
   1. マイクロ流体プレートを倒立顕微鏡のステージに置きます。表示領域の中央に焦点を合わせて、セルを見つけます。
   2. 明視野顕微鏡および/または蛍光顕微鏡を使用して、細胞の形態、生存率、およびバイオセンサーの発現を評価します。
2. マイクロ流体システムおよび互換性のあるマイクロ流体プレート4^{、12、13、14}を使用して、正確に制御された条件下でのカルシウム定常状態のダイナミクスを調査します。
3. 倍率100倍、開口数(NA)1.40の倒立レーザー走査型共焦点顕微鏡を使用して、生細胞イメージングを実行します。アルゴンレーザーを使用して488 nmでGFPとLSSmAppleを励起することにより、デュアル蛍光色素バイオセンサーを監視します。GFPの場合は520 nm、LSSmAppleの場合は610 nmで発光シグナルを収集し(図5)、レシオメトリック蛍光イメージング実験を実施して、バイオセンサーの動的応答を定量化します。放出強度の経時的な比率(GFP/LSSmApple)を測定して、分析種による変化をモニタリングします。

5. オープンソースソフトウェアを使用した画像解析(図6)

1. 公式リポジトリから CellProfiler またはその他の同様のソフトウェアを入手し、ローカル ワークステーションにインストールします。
2. タイムラプス蛍光顕微鏡画像を順番に整理し(img_001.tif、img_002.tifなど)、自動バッチ処理との互換性を確保します。
3. ソフトウェアを起動し、[ 新しいプロジェクト]を選択して新しい解析パイプラインを初期化します。タイムラプス画像シーケンスをパイプラインワークスペースにインポートします。
4. IdentifyPrimaryObjectsモジュールを組み込んで、蛍光シグナルまたは形態学的基準に基づいて各フレーム内の個々の細胞を検出します。
5. TrackObjects モジュールを追加して、フレーム間のセル間の時間的対応を確立し、時間の経過に伴う単一セルの追跡を可能にします。
6. MeasureObjectIntensityモジュールを含めて、追跡された各細胞の蛍光強度パラメータ(平均、中央値、積分強度など)を定量化します。
7. ExportToSpreadsheetモジュールを使用して、定量データをコンパイルして表形式(CSVなど)にエクスポートし、下流の分析に使用します。
8. スプレッドシートソフトウェアなどの統計ツールやデータ可視化ツールを使用して、エクスポートされたデータを分析します。

結果

微生物システムにおけるバイオセンサーのレシオメトリックイメージングを成功させるには、いくつかの技術的課題に対処する必要があります。

発現システム: 最初の課題は、発現システムの選択にあります。プラスミドベース、染色体統合、構成的または誘導性プロモーターによって駆動されるかどうか、および細胞内標的タグの有無。これらの要因は、バイオセンサーの安定性、毒性、細胞内の局在に大きな影響を与える可能性があります(図1)。過剰発現や逆にシグナル不足によるアーティファクトを避けるためには、最適な発現レベルを確保することが不可欠です。さらに、バイオセンサーは、宿主細胞の生理学的機能を維持する方法で発現する必要があります。

培養密度: 2 番目のボトルネックは培養密度です。 微生物の増殖段階と細胞濃度は、画像品質に直接影響します。チャンバーが過密になると、セルが重なり、信号干渉が発生し、解像度が低下する可能性があります。逆に、密度が非常に低いと、信号対雑...

ディスカッション

遺伝的にコードされた蛍光色素ベースのバイオセンサーにより、^生細胞の細胞内分析物濃度をリアルタイムでモニタリングできます1。これらのバイオセンサーは通常、コンフォメーションの変化を光信号に変換することによって機能し、レシオメトリックまたは強度メトリックで検出できます。強度測定バイオセンサーは、単一のFPからの蛍光強度の変化に依存しているため、バイオセンサーの存在量の変動に敏感になり、潜在的な測定バイアスにつながります。この問題は、スペクトル的に異なる 2 つの FP からの蛍光を同時に測定するレシオメトリック バイオセンサーを使用することで軽減できます。これらの放出の比率は、バイオセンサーの存在量に関係なく、より信頼性の高い読み出しを提供します ^9,12。ただし、レシオメトリックアプローチは限られたスペクトル空間によって制約され、複数のバイオセンサーまたは追加の蛍光マーカーの共発現が制限されます。

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材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
寒天	シグマ・アルドリッチ株式会社	A5306-250G
一倍体酵母細胞用 CellASIC ONIX プレート	メルク KGaA	Y04C-02-5PK
セル ASIC ONIX2	メルク KGaA	CAX2-S0000
CSM-Ura	サーモフィッシャーサイエンティフィ	11387899
D-グルコース	シグマ アルドリッチ社	G8270-100G
D-ソルビトール	シグマ アルドリッチ社	S1876-10MG
NaCl	シグマ・アルドリッチ社	S9888-25G
pAG416 GPD GA-マトリョーシュCaMP6s	NA	7	におけるGA-マトリョーシュCaMP6sの発現用
TCS SP8 STED	ライカ	NA
株 K601/ W303-1A MAT-a	NA	8	ade2-1 ura3-1 his3-11 trp1- 1 leu2-3 leu2-112 can1-100
YNB	BocaScientific	GCM16.0500
α-交配因子酢酸塩	シグマ・アルドリッチ株式会社	T6901-.5MG