方法論記事

液滴移動法による巨大単層小胞の確実な作製

DOI：

10.3791/68340

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2025年9月19日

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1The Biorobotics Institute, Sant'Anna School of Advanced Studies - Pisa, 2Department of Excellence in Robotics & AI, Sant'Anna School of Advanced Studies

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この初心者向けガイドでは、液滴移動法による巨大単層小胞(GUV)の調製に関する一般的なプロトコルを紹介し、重要なステップについて説明し、合成生物学やマイクロロボティクスなどのさまざまな用途に必要な調整に役立つ洞察を提供します。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

過去20年間にわたり、逆エマルジョン、ダブルエマルジョン、相転移、またはエマルジョン転移としても知られる液滴転移法は、巨大単層小胞(GUV)の調製、特に異なる貨物を積み込むのに有利であることが証明されており、合成生物学において重要な役割を果たしています。カプセル化の効率と実行の容易さから、人工細胞の開発に広く使用されています。文献では、いくつかのパラメーターに大きなばらつきが観察されており、結果が非常にばらつきがあります。これは、この多用途の方法のさまざまなニーズや用途に必要な調整が部分的にあるためですが、この手法に初めてアプローチする研究者にとっては方向感覚を失う可能性があります。

初心者にこの方法と重要なパラメーターの役割の基本的な理解を提供するために、液滴移動による GUV 形成の根底にある基本的な物理化学的原理に関するヒントとともにプロトコルが提示されます。したがって、GUVを作成するためのこのステップバイステップのガイドには、文献と直接の経験に基づいた考慮事項と実践的な提案が含まれています。

変動の考えられる原因を考慮すると、いくつかの側面が重要であると特定されます。リン脂質を溶解するためのオイル(脂質溶液またはLS)の選択。遠心分離後のGUVの回収。大気中の酸素と湿度の干渉を最小限に抑えるために、費用対効果の高い対策が提案されています。油とリン脂質の適切な組み合わせを特定するのに役立つように、一般的なプロトコルは、LSの関連する物理化学的特性に関する議論で補完されます。最後に、非現実的な手順を回避するために、油相を一度に完全に除去し、きれいなGUV分散液を回収する簡単で安全な方法が提案されています。これらの措置により、新しい GUV 組成への調整の実施が加速され、合成生物学やマイクロロボット工学などの近隣分野での採用が拡大する可能性があります。

概要

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リポソームを産生するための前述の技術を実装して1、Pautotらは、直径2が0.1〜1μmの範囲の直径を持つ脂質小胞を産生するプロトコルを確立した。液滴転写法は、さらに大きな小胞(直径1μmを超える)3の生成に効果的であることがすぐに証明され、実行の容易さと高いカプセル化効率からますます人気が高まっています。実際、膨潤法(ゲル膨潤や電形成など)と比較して、このプロトコルは、同等の数の小胞および関連する廃棄物を形成するために必要な貨物溶液の量を減らします4。GUVは、同等のカプセル化効率を持つ代替方法を介して流体界面から組み立てることができます。ただし、マイクロ流体チップ5,6または連続液滴界面交差カプセル化(cDICE)7に基づくものと比較すると、液滴移送は、基本的な機器を備えたどの実験室でも手頃な価格で最も簡単なセットアップを提供します。さらに、マイクロ流体法により、膜内に望ましくない油の介在物を含む GUV が生じる可能性があります。これらの理由から、液滴移送は、人工細胞3,8,9,10、そして最近ではマイクロロボティクス11,12の分野で、貴重な貨物をGUVに積み込むための選択方法となっている。

この方法は、リン脂質によって媒介される水/油界面の安定化による膜のリーフレットの形成に基づいています。まず、リン脂質を油(脂質溶液、LS)に溶解し、次に油性LSに所望のGUV貨物(内液、IS)を含む水溶液で油中水エマルジョンを調製します。次に、エマルジョンをチューブに移し、そこで別の水溶液(外溶液、OSと名付けられた)がLSと事前に平衡化されて水と油の界面を形成します。GUVは、水滴が遠心分離によってこのOS/LS界面を強制的に通過するときに形成され、GUVの内側のリーフレットはIS液滴の表面に形成され、外側のリーフレットはOSとLSの間に形成されます(図1)。

多くのプロトコルバリアントは、偶発的な実験ニーズに応じてパラメーターが調整されて説明されています。プロセスを最適化するための最初の広範な試みは、Mogaら13によって説明され、Zhangらは最近のレビューで関連する例のほとんどを収集しました14。プロトコルに影響を与える多くのパラメーターが記載されているにもかかわらず、新しいGUV製剤の最適化プロセスをどのように実施できるか、また、製造後のGUVの回収と操作のベストプラクティスの兆候はありません。入手可能な科学文献と私たちの直接の経験に基づいて、基本原理について話し合いながらGUVを製造するための一般的なプロトコルをここで提供します。そうすることで、新しいGUV製剤の最適化に役立つ適応症と、プロトコルに常に適用できる2つの予防措置、つまり制御された環境でのLSの調製と、クリーンなGUVサンプルの回収のために上部油相を簡単に除去する方法を提供します。2つの例を選びました:1つはISとして240 mMのスクロース、LSとしてシリコーンオイルAR20中の0.2 mM DOPC(条件E [空]、 表1を参照)、もう1つはISとして240 mMのスクロース中の0.2%1.1 μmポリスチレン微粒子、LSとして鉱物油中の3.18 mM DOPCで構成されています(条件P [粒子を含む]、 表1を参照)。どちらのサンプルも、OSとして240 mMのグルコースを使用して作成されました。この浸透圧を選択して、生理学的条件下で弛緩した脂質膜(膜張力が低い)を持つGUVを取得しました。

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図1:液滴移動法の概略図。 (A)脂質溶液を形成するための油中リン脂質(黄色相)、内液としてのスクロース含有溶液(シアン)、および外溶液として等浸糖グルコース溶液(白色)の3つの溶液を別々のバイアルで調製します。次に、LSをISと混合して安定したエマルジョンを形成し、次に(C)OSとLSの間の界面を平衡化させてから、(D)エマルジョンをその上に注ぎます。(E)水滴は遠心力によってLS / OS界面を横切るように強制され、(F)GUVの形成を可能にします。この図は縮尺ではなく、メソッドの概略図のみを提供することを目的としています。略語:LS =脂質溶液;IS = 内部ソリューション;OS = 外部ソリューション;GUV = 巨大な単層小胞。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

プロトコル

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注:特に明記されていない限り、プロセスは室温で実行されます。

1. 溶液の調製

  1. 水溶液(ISおよびOS)の調製
    1. 2つの異なる計量ボートで、2.16 gのブドウ糖と 表1に指定されたショ糖の量を量ります。粉末を2つの150 mLビーカーに加え、40 mLの超純水を加え、撹拌しながら混合します。
    2. 溶液を2つの50 mLシリンダーに移し、最大50 mLの超純水を加えて、 表1に示す濃度の240 mMグルコース溶液とスクロース溶液を得る。シリンダーをパラフィルムで覆い、シリンダーを数回反転させて溶液を混合します。
    3. 微生物による汚染を防ぐために、50 mLシリンジと0.22 μmフィルターで溶液をろ過します。
    4. 条件Pの場合、次の混合物を調製します:2 μLの100 mg / mL 1.1 μmポリスチレン粒子分散液、ステップ1.1.1で調製した24 μLのスクロース溶液、および最大100 μLの超純水(最終懸濁液:240 mMスクロース溶液中の0.2%微粒子)。溶液を+4°Cで最大1週間保存するか、1.5mLチューブに1mLのアリコートを調製し、長期保存のために-20°Cで保存します。
  2. 制御された環境でLSを調製するためのグローブチャンバーのセットアップ
    1. 内径7mm、外径13mm、 表2 に示す長さのシリコンパイプを5本切断します(パイプ1〜5)。
    2. 内径3mm、外径7mm、 表2 に示す長さのシリコンパイプを4本切断します(パイプ6〜9)。
    3. パイプ 1 の一方の端を二方弁に接続し、もう一方の端を三方ジャンクションに接続します (図 2A)。
    4. パイプ 2 を二方弁の他の端に接続し、次にパイプ 3 とパイプ 4 を三方接合部に接続し、パイプ 3 をパイプ 1 の反対側の端に接続します (図 2A)。
    5. パイプ4の自由端をグローブチャンバーの入口(入口パイプ、 図2B)に接続します。
    6. グローブチャンバーに付属の三方弁を出口に接続し、バルブをパイプ5(出口パイプ、 図2C)に接続します。
    7. パイプ 6 の一方の端を 18 G の針に接続し、もう一方の端を双方向接合部に接続します。パイプ7と21G針でこれを繰り返します(図2D)。
    8. セプタム付きのバイアルキャップに2本の針を挿入します:この針付きキャップは、窒素の流入と窒素とクロロホルムの流出を制御できます。針との接触を避けるために、キャップを空のキャップレス50mLチューブに保管します(図2D)。
    9. パイプ8と9をそれぞれ絞って、グローブチャンバーの内側から入口と出口の開口部に挿入します(図2E)。
  3. LSの調製
    1. グローブチャンバーをケミカルフードの内側または横に移動します。グローブチャンバーを開き、シリカ粒子で満たされた晶析装置をチャンバーの底に挿入します(図2F)。晶析装置を白い支持面で覆い、ペーパータオルで覆います。
    2. 必要なすべての材料を手袋チャンバーに挿入します(図2G):湿度計、クロロホルム溶液中の1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)、オイル(表1)、きれいな20 mLの暗いガラスバイアル(開封してそれぞれのキャップ付き)、ハミルトンシリンジ(表1)、P10000マイクロピペットとチップ。クロロホルム溶液の入ったガラスバイアルを、コルクリングホルダー、150 mLビーカー、またはその他の適切なホルダーに、オペレーターの側にできるだけ近づけて置きます。
      注意: この予防措置は、真空と窒素の流れのサイクルでの手袋の膨張と収縮によって引き起こされるボトルの傾きを防ぎます。
    3. グローブチャンバーを閉じ、2つの半分が滑らないようにし、グローブチャンバーに付属のプラスチックネジで密閉します。
    4. 出口バルブを閉じ、パイプ5を水で半分満たされた500 mLビーカーに浸します(図2H)。
    5. 入口パイプ(パイプ2)のバルブ調整端を真空ラインに接続し、もう一方の端を窒素(パイプ3、 図2A)に接続します。これで、 図2Jに示すように、グローブチャンバーが完全に設定されました。
    6. 減圧によって手袋が硬すぎて曲げられないまで膨らむまで、バルブと真空ラインを開きます。真空ラインとバルブを閉じます。
    7. 圧力によって手袋が手袋室から出てくるまで手袋が収縮するまで窒素を開きます。窒素ラインを閉じます。
    8. 手順1.3.6から1.3.7を少なくとも10回繰り返し、内部湿度が40%を下回ることを確認します。
    9. 真空と窒素で内圧を制御し、オペレーターが手袋を着用しやすくします。
    10. ハミルトンシリンジを使用して、 表1 に示されているクロロホルム溶液中のDOPCの容量を暗いガラスバイアルに移します。ステップ1.2.9で準備した針付きキャップでバイアルを閉じます。
    11. パイプ 6 をパイプ 8 に、パイプ 7 をパイプ 9 に双方向ジャンクションで接続します (図 2I)。
    12. 手袋を外し、出口バルブを開きます。
      注: 2 番目のオペレーターは、手順 1.3.13 から 1.3.15 まで、プロセスを高速化するのに役立ちます。
    13. 窒素の流れを非常にゆっくりと開き、パイプ5が以前に配置されていたビーカー内の気泡を観察してガスの流れを確認します(ステップ1.3.4)。窒素の流量が、個々の気泡が観察可能なままである比較的高い速度に達するまで、徐々に調整します。窒素を3分間流してから、窒素ラインを閉じます。
      注:窒素圧が高すぎると、クロロホルム中のDOPC溶液がバイアル全体に分散し、その後の脂質溶液(LS)に利用できるリン脂質の量が減少する可能性があります。さらに、高圧により、針がバイアルから排出されるリスクが高まります。したがって、制御不能な飛散を引き起こすことなくクロロホルムを穏やかに撹拌する最適なレベルまで窒素流量を慎重に調整することが不可欠です。
    14. その間に、晶析装置にウォーターバスを用意し、ホットプレートで80°Cで加熱します。
    15. ビーカー内の最後の気泡が出るまで待ってから、出口バルブを閉じます。手袋を再度着用し、パイプ 8 と 9 を双方向ジャンクションから外します。
    16. すべてのクロロホルムが暗いバイアルから蒸発したことを確認し、それを開けてキャップを50mLチューブに戻します。オイルボトルを開き、必要な量のオイル(表1)を暗いバイアルに移し、キャップで閉じます。手袋を外し、手袋室を開きます。
    17. LSをパラフィルムで密封します。バイアルを少なくとも30秒間激しく渦にします。ステップ1.3.14で調製したウォーターバスで80°Cで30分間インキュベートします。バイアルを少なくとも30秒間激しく渦にします。室温で一晩インキュベートします。
    18. GUVの調製を進めるか、+4°Cで最大1週間保存します。
      注:非対称GUV調製では、界面とエマルジョンに2つの異なるLSを使用して、2つの異なる膜リーフレットを得ることができます15。

2. GUV生産

  1. 油分を簡単に取り除くための容器の設置
    1. はさみで、5mLチューブのキャップを切り取ります。キャップの中央に~8 mmの穴を開け、穴がP1000チップがフィットしてロックできる十分な幅があることを確認します(図3A)。穴が狭すぎる場合は、前の2つの手順を繰り返します。幅が広すぎる場合は、キャップを捨てて、手順 2.1.1 から新しいキャップで再起動します。
    2. 2 x 5 cmのサンドペーパーを切り、穴を研磨します。穴の開いたキャップを5 mLチューブの上に戻し、3,000 × g で5分間遠心分離して、穴から残留するプラスチック破片をすべて取り除きます。キャップを外し、チューブを廃棄します。
    3. 新しい5 mLチューブからキャップを切り取り、穴の開いたキャップと交換します。キャップの上にOリングを置き、穴にP1000チップを挿入します。先端とキャップの間にOリングをロックし、先端をチューブの下に押し下げることができないことを確認します(図3B)。5 mLチューブに5.5 mLのOSを先端から充填します。
  2. OS/LSインターフェース形成
    1. 晶析装置にウォーターバスを用意し、ホットプレートで50°Cで加熱します。
    2. セクション1.3で準備したLSバイアルを少なくとも30秒間激しくボルテックスします。LSを50°Cのウォーターバスで30分間加熱します。
    3. セクション1.1で調製した水溶液を室温で少なくとも10分間平衡化します。
    4. ステップ2.1に従って変更した1.5 mLチューブまたは5 mLチューブに300 μLのOSをピペットで移動させます。OSの上に100 μLのLSをゆっくりとピペットで入れ、チューブ内に2つの異なる連続相が形成されていることを確認します。界面を10分間平衡化させます。
      注:リン脂質の均質な単層を形成できるようにするには、LSをOSの上に均一に分布させる必要があります(図4A)。LS層が連続していない場合は、マイクロピペットでLSの体積を再分配するか、LSの体積を増やすことができます(これは、パラフィンなどの高粘度オイルで非常に役立ちます)。
  3. 油中水型エマルジョン形成
    1. 2 mLチューブで、2.5%油中水型エマルジョンに対して、250 μLのLSと6.25 μLのISをこの順序でピペットで取ります。
      注:私たちの経験では、この油中水比は安定したエマルジョンを提供する可能性が最も高いため、プロトコルの成功率が向上します(図5)。GUV収率を高めるには、IS/LS比ではなくエマルジョン量を増やすことをお勧めします。
    2. 混合物が均一で安定しているように見えるまで、次の1つまたは複数の方法を使用して2つの相を混合します:ボルテックス、標準的なマイクロチューブラック上での機械的攪拌、または指でチューブを軽くたたきます(均質なエマルジョンの例については 、図5 を確認してください)。
    3. セクション2.2で調製したOS/LSインターフェースの上に200 μLのエマルジョンを移します。
    4. 1.5 mLチューブを使用する場合は、チューブを閉じるだけです。セクション2.1で修正された5 mLチューブを使用する場合は、チップの上にゴム製のキャップを置き、チューブを50 mLの円錐形チューブに慎重に移します。
  4. 遠心分離による液滴移送
    1. 表1の指示に従って、室温でチューブを遠心分離します。遠心分離の最後に、チューブの底に不透明なペレットがあり、上部に透明な油相があることを確認します。

3. GUVの回収

  1. 油分除去
    注:実験のニーズに応じて、オイルは3つの異なる代替ステップで除去できます。
    1. GUVが標準の1.5 mLチューブで調製されている場合は、ペレットが乱れていないことを確認しながら、P1000ピペットと最後の一滴のP200を使用してオイルをゆっくりと取り除きます。
      注:チップが狭いほどオイルの除去に役立つため、少量(10〜200 μL)のチップをP1000チップに挿入すると、このステップの精度が向上します。
    2. 異なる1.5 mLチューブで複数のGUV調製物を扱う場合は、ビュヒナーフラスコを使用してオイルを取り除きます。太いシリコンパイプ(内径7mm、外径13mm)を1本真空ラインに接続し、フラスコの開口部に別のパイプを挿入し、ゴム製ガスケットで密閉します。このパイプのもう一方の端に、P1000チップを挿入し、パラフィルムで包み、チップの約3mmをカットして、P200チップに挿入します。真空を開き、P200チップでオイルを吸引し、真空を閉じて、P200ピペットで最後の一滴を取り除きます。
    3. 手順2.1で詳述した容器にGUVが準備されている場合は、ゴムキャップが外れないように、チューブからチップを取り外します(図3D)。その後、先端を廃棄し、ゴムキャップ、Oリング、穴あきキャップは再利用できるように保管してください。
    4. P1000マイクロピペットを使用して、チューブからOSを取り出し(図3E)、約50 μLの容量を残し、ペレットが乱れていないことを確認します。
    5. チップを交換し、残りの容量にペレットを再懸濁し、清潔な2 mLチューブに移します。
  2. GUV洗浄
    注:これらの手順の目的は、手順3.1で除去されなかった油相の痕跡を除去することです。必要に応じて、チューブ内に油滴が観察されなくなるまで、手順3.2.1と3.2.2を繰り返す必要があります。
    1. チューブに2mLのOSを充填し、室温で1,500 × g で5分間遠心分離します。
    2. OSを取り出し、約50 μLの容量を残し、ペレットが乱れていないことを確認します。
    3. 最後の 2 つの手順を繰り返します。
  3. 体積平衡化
    注:このセクションは、異なるGUV調製物間の収量を比較できるようにするために含まれています。
    1. P200マイクロピペットを使用して、ステップ3.2.2の最後の繰り返しで残った容量の50 μLにペレットを再懸濁します。
    2. この容量を測定するには、ピペットを 20 に設定し、チューブ壁に触れずにチップを GUV 分散液に浸した状態で容量を増やし、液体がチップ内に流れるようにします。
    3. OSを追加して、最終容量の100 μLに達します。

4. 観察と寸法分析

  1. 顕微鏡画像取得
    1. チューブを指で軽くたたいて、GUV分散液を穏やかに混合します。
    2. バーカーチャンバーに10 μLのGUVサンプルをロードし、GUVがチャンバーの底に沈殿するまで少なくとも5分間待ちます。
    3. 位相差顕微鏡でサンプルを観察します。バーカー線を基準として使用して、サンプルを横切って移動し、観察領域が重ならないようにしながら、少なくとも20枚の画像を取得します。
  2. 寸法解析
    1. 画像をImageJに読み込みます。
    2. ピクセル/μm変換係数を計算するには、バーカーチャンバーの50 x 50 μmの正方形を示す画像を1つ選択し(正しい識別についてはメーカーのデータシートを参照)、 直線選択 ツールを選択し、正方形の連続する2つの角の間に線を引き、 Analyze |測定。3回繰り返して平均値を計算します。
    3. [分析] |スケールを設定します。手順 4.2.2 の値を [ピクセル単位の距離] ボックスに挿入し、[既知の距離] に値 50 を、[長さの単位] に μm を挿入します。
    4. [ 分析] |測定値を設定し 、[ 面積] ボックスを選択します。 楕円選択 ツールを選択し、マウスの左ボタンをクリックし、Shift キーを押しながら、結果の円を GUV の周囲に重ねます。[ 解析] |測定。すべての画像の各 GUV に対してこれを繰り返します。
    5. [結果] ウィンドウで、[ ファイル] |名前を付けて保存... GUVの領域のcsvファイルをエクスポートし、GitHub16で利用可能なスクリプトを使用してサイズ分布を分析します。
      注:手順4.2.3をスキップして、ピクセル/μm変換係数を指定するスクリプトを実行することができます。この値を計算するには、手順4.2.2で得られた値を50で割ります。

結果

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最適なGUV調製は、透明な油相と明確なペレットの形成によって特徴付けられます(図4A)。水滴がGUVに変換できない場合、通常、水滴は崩壊し、OS/LS界面にリン脂質の破片を残します(図4C)。この効果は、水/油界面でのリン脂質の不十分な平衡に起因する、油相からのリン脂質および他の分子の凝集によって引き起こされる可能性が最も高いです。それにもかかわらず、目に見えるペレットが存在しなかったり、界面に破片が存在したりしても、GUV が形成され、プロセスを継続できる可能性があります。洗浄ステップは、すべてのリン脂質の破片を除去するのに完全に効果的ではありませんが、油滴の除去に大きく役立ち、サンプル全体の品質を向上させます( 図6A と 図6Bを比較してください)。

高湿度条件で調製された古いLSまたはLSを使用すると、多くの場合、GUV分散液が減少し、収率が低下し、油相からのリン脂質やその他の分子によって形成される可能性が最も高い無秩序凝集体の含有量が高くなります(図6C)。高湿度条件で調製されたLSでは、GUV生産(GUVを含むサンプルがほとんどない)で0.8を超える変動係数が観察されましたが、修正されたグローブチャンバーで調製されたLSでは、変動係数は0.5未満でした。

遠心分離条件が異なると、GUV の収量と品質に影響を与える可能性があります。定性分析から、3,300 × g での 20 分間が、スクロースを充填した GUV の良好な状態として特定されました (サンプル E)。速度を下げると(500 × gで45分)、収量が減少し、速度を上げると(16,600 × gで5分)、無秩序なリン脂質凝集体の形成が増加しました。遠心力が弱いと、多くの液滴がOS/LS界面を通過するのが妨げられるため、収率が低下する可能性がありますが、強い力では、界面の交差中に外側のリーフレット上のリン脂質の組織化に十分な時間が与えられない可能性があります(図7)。微粒子のカプセル化は、微粒子の質量密度がISの質量密度とほぼ一致する限り、遠心分離パラメータを調整することで最適化することもできます。この目的のために、遠心分離加速度を下げる(そして遠心分離時間を長くする)ことで、固体粒子によって加えられる力によるリン脂質膜の破損を回避することにより、粒子のより均質なカプセル化が可能になります(最適な遠心分離パラメータの調査がまだ進行中である間、良好なカプセル化の例を 図6D に示します17)。

リン脂質の拡散は油相の影響を受ける可能性があるため、簡単な定性試験を実行してエマルジョンの安定性を評価できます(図5)。ISに溶解した着色染料(ブリリアントブルーFCF)を使用して視覚化を改善することで、水と油の比率の異なるエマルジョンを調製し、時間の経過とともに観察することができます。安定性の低下は、水滴の凝集とそれに伴う油相からの分離によって視覚化できます。大きな液滴(肉眼で見える)はGUVに変換されにくいため、相分離が最も少ないエマルジョン条件の使用をお勧めします。

プロトコルの変動の影響は、プロトコルセクション4で説明されているようにサイズ分布分析を通じて検証できます:GUVの直径は位相差顕微鏡画像からImageJを使用して測定でき、サイズ分布はGitHub16で利用可能なスクリプトで分析できます。このプロトコルに従って、たとえば、シリコーンオイルAR20よりも鉱物油を選択すると、より大きな直径のGUVの増加を観察することが可能でした(図8)。

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図2:グローブチャンバーのセットアップ。 この図は、脂質溶液調製のためのグローブチャンバーの主な変更を示しています。(A)窒素と真空による入口接続。(B)グローブチャンバーとの入口接続。(C)出口バルブ;(D)溶媒蒸発用の針付きキャップ。(E)溶媒蒸発用の細いパイプ。(F)湿気を吸収するシリカ粒子。(G)グローブチャンバーに入れるアイテム:デジタル温湿度計(1)、有機溶媒中の脂質溶液(2)、コルクリングホルダー(3)、ガラスシリンジ(4)、セプタムと針付きのオープンキャップ(5)、油溶液(6)、キャップ付きのオープンダークバイアル(7)、10 mLチップ(8)、P10000ピペット(9);(H)水に浸した出口パイプの端。(I) 入口と出口に接続された針付きキャップで閉じたバイアル。(J)改良された手袋チャンバーの概略図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図3:油を簡単に取り除くための容器。 プロトコルセクション2.1に従ってオイルを簡単に除去できるように、容器内のGUVを調製する主なステップ。(A)P1000チップが収まるように、5mLチューブキャップに穴を開けます。次に(B)キャップを空の5mLチューブに置き、先端をOリングを通して穴に挿入します。(C)溶液をプロトコルセクション2.2および2.3に従ってチューブに入れ、先端にキャップを付け、チューブを50mLチューブ内に配置します。シリコーンオイル中の0.2 mM DOPCから調製されたGUVに、230.7 mMのスクロースと3.1 mMのブリリアントブルーFCFをロードして、可視化を強化しました。(D)遠心分離後、上部油相はGUVバッファーの一部とともにチップ内に閉じ込められます(液滴の一部がGUVに変換できず、OSで色素を放出するため、シアン色に見えます)。ゴム製キャップのおかげで、チップは液体内容物と一緒に5mLチューブから簡単に取り外すことができ、油相全体を迅速かつ簡単に取り除くことができます。(E)GUVペレットは、位相差顕微鏡で確認されたように、明らかな油汚染がなく、透明な分散液でチューブの底から簡単に収集できます。スケールバー = 20 μm。略語:LS =脂質溶液;IS = 内部ソリューション;OS = 外部ソリューション;GUV =巨大な単層小胞;DOPC = 1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図4:GUVの形成。 (A)OS/LS界面、(B)透明な油相を持つクリーンなGUVペレット、および(C)OS/LS界面にデブリを含むGUVペレットの例(このGUV集団のISに1.65 mMの新しいコクシン色素が可視化を強化するために添加されたため、デブリとペレットは赤みを帯びて見えます)。略語:LS =脂質溶液;IS = 内部ソリューション;OS = 外部ソリューション;GUV = 巨大な単層小胞。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図5:異なる油比と油中水比でのエマルジョンの安定性。 この図は、オイルの種類と使用する水/油 (w/o) 比率に応じて、エマルジョンの経時的な安定性を示しています。ISは、エマルジョンの可視化を強化するために、230.7 mMのスクロースと3.1 mMのブリリアントブルーFCFで構成されていました。鉱物油で調製されたエマルジョンは、シリコーンオイルAR20で作られたエマルジョンよりも安定性が低くなります。この効果は、w/o比が増加するとさらに増幅されます。シリコーンオイルAR20のエマルジョンは大幅に安定していますが、w/o比が増加するにつれて安定性も低下し、乳化直後に相分離が見られます(シリコーンオイルAR20は10%)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図6:位相差顕微鏡によるGUVの観察。 鉱油中の3.18 mM DOPCから構成されたLSから調製したショ糖負荷GUVの20倍倍拡大(A)油除去後に回収されたサンプル。(B)洗浄ステップ後に回収されたサンプル。(C)酸素と湿度が規制されていない環境で調製されたLSから得られるGUV収率が低い。(D)微粒子を充填したGUV。スケールバー = 10 μm;油滴は丸で囲まれており、リン脂質と油分子の無秩序な凝集体の例は矢印で示されています。略語:LS =脂質溶液;GUV = 巨大な単層小胞。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-6
図7:GUV形成に対するさまざまな遠心分離条件の影響。 シリコーンオイルAR20中の0.2 mM DOPCからなるLSで調製したショ糖負荷GUVの位相差画像図は、(A)16,600 × g で5分間、(B)3,300 × g で20分間、(C)500 × g で45分間のGUVの定性的比較を示しています。遠心分離速度が速いとリン脂質凝集体の存在が高くなりますが、遠心分離速度が低いと収率が低下します。スケールバー = 50 μm。略語:LS =脂質溶液;GUV =巨大な単層小胞;DOPC = 1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-7
図8:サイズ分布分析。 (A)鉱物油中の0.2 mM DOPCと(B)シリコーンオイルAR20中の0.2 mM DOPCから得られた2つのスクロース負荷GUVサンプルの比較(*位相差顕微鏡下でGUVを明確に区別できるようにサンプルを10倍に希釈しました)。プロトコルセクション4に従って実施された分析は、シリコーンオイルAR20サンプルと比較して、鉱物油サンプルの直径が大きい方向にシフトしたことを示しています。ただし、シリコーンサンプルの収率はほぼ20倍高くなります。略語:GUV =巨大な単層小胞;DOPC = 1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

歩条件E条件P形容
1.1.14.11グラム17.11グラムスクロースの塊
1.1.12.16グラム2.16グラムブドウ糖の質量
1.1.2240ミリメートル1000ミリメートルショ糖の濃度
1.1.2240ミリメートル240ミリメートルグルコースの濃度
1.3.2シリコーンオイル鉱油LSの油相
1.3.20.1 mLガラスシリンジ0.5 mLガラスシリンジクロロホルム溶液中にDOPCを移すためのガラスシリンジ
1.3.1063 μL500 μLクロロホルム溶液中のDOPCの体積
1.3.1610ミリリットル5ミリリットルオイル量
2.4.13300g 20分500g 45分遠心分離条件

表1:プロトコルのバリエーション。 この表は、2つの異なるGUV集団(スクロース負荷GUV(条件E)と微粒子負荷GUV(条件P))を調製するためのプロトコルのさまざまなステップ(最初の列に示されている)のバリエーションを報告しています。

身分証明書関連する手順内径(mm)外径(mm)長さ(mm)
11.2.1;1.2.371350
21.2.1;1.2.4;1.3.571350
31.2.1;1.2.4;1.3.5713100
41.2.1;1.2.4;1.2.57132000
51.2.1;1.2.6;1.3.137132000
61.2.2;1.2.7;1.3.113750
71.2.2;1.2.7;1.3.113750
81.2.2;1.2.9;1.3.11;1.3.1537200
91.2.2;1.2.9;1.3.11;1.3.1537200

表2:グローブチャンバー内のガスおよび真空接続用のパイプ。 この表は、グローブチャンバーを窒素および真空ラインに接続するために使用されるシリコンパイプの寸法を示しています。アセンブリプロセスを容易にするために、参照 ID が提供されています。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

GUVの製造方法は、水和による基板からの膨潤に基づく方法と、流体界面からの組み立てに基づく方法の2つの主要なグループに分けることができます。最初のグループの方法は、脂質膜または膜貫通タンパク質の生物物理学的特性評価のために大規模なGUV集団を提供するのに非常に効率的です。対照的に、液滴移送のような方法は、貨物の消費量が削減され、カプセル化効率が高いため、主に貨物のカプセル化に選択されます18。

このため、多数の異なる貨物がGUVにカプセル化されており、液滴移動は人工細胞3,8,9,10の参照プロセスであり、新しいバイオミメティックマイクロロボット11,12を構築するための可能なソリューションとなっています。GUV膜の物理化学的特性を調節するために、イオン性リン脂質10、脂肪酸19、PEG20などのポリマー、またはコレステロール21などのさまざまな分子を含めることができます(ただし、コレステロールなどの疎水性分子は油に対して高い親和性を持っているため、膨潤方法22に関する膜組成の制御が低くなります).このプロトコルは、これらの変更を可能にするのに十分な汎用性を備えていますが、一部のステップは他のステップよりも大きな影響を及ぼします。

この方法の重要性について議論するために、ここでは、2つの異なるGUV集団を調製するためのプロトコルについて説明しました:1つはスクロース溶液を含むGUVの調製、もう1つは微粒子をカプセル化するGUVの調製です。プロトコルの違いは、条件E(空)および条件P(粒子を含む)として 表1 に詳述されています。この方法は、リン脂質23 によって駆動され、関係する3つの相(IS、OS、およびLS)すべての物理化学的性質の影響を受ける双安定プロセスで、水滴を油相から水相に移動させることにより、GUVの形成を可能にします。

3つのうち、LSはリン脂質が光、酸化、加水分解に対して感受性が高いため、最も感度が高い24,25,26。このため、リン脂質の長期保存に使用される有機溶媒(通常はクロロホルムまたはメタノール)を-20°Cで蒸発させる最初のステップは、窒素またはアルゴンの流れ下で琥珀色のバイアルで実行する必要があります。実験室環境で低湿度レベルが確保されない場合、リン脂質が損傷する可能性があります13、14、27。したがって、LSは、グローブボックスまたはこのプロトコルに記載されている費用対効果の高い改質グローブチャンバーなどの限られた環境で調製する必要があります。脂質膜に油を添加すると、LSをグローブチャンバーから取り出し、溶液をボルテックスして加熱することによってリン脂質の完全な溶解を行うことができます。

一部のプロトコルには、このステップ13での超音波処理が含まれていますが、局所的な温度上昇は、一部のLS製剤でまだ説明されていない損傷につながる可能性があります。このため、溶液をウォーターバスで加熱すると、より制御された均質なプロセスが得られる可能性がある。LSを損傷する可能性をさらに減らすために、このプロトコルは2つの異なる温度の使用を提案しています:新しく調製されたLSの溶解は、以前に溶解したLSよりも高いエネルギーを必要とするため(ガラスバイアルの表面に広がるフィルム中のリン脂質分子の密度が高いため)、最初の脂質フィルム溶解には80°C、使用直前にリン脂質を単純に再溶解するには50°Cが採用されます。鉱物油中の 3.18 mM DOPC では一般に、時間の経過に伴う性能ばらつきの増加が観察されるため(図 4C)、1 週間以内に LS を使用することが一般的に推奨されます。それにもかかわらず、油とリン脂質の組み合わせによっては寿命が延びる可能性があり、グローブチャンバーの使用により、LSの安定性も時間の経過とともに向上するようです。

リン脂質の特定の組み合わせで GUV 膜をカスタマイズするには、プロトコルのカスタマイズされた実装が必要になる場合があります。考えられるすべてのバリエーションの間をナビゲートするには、LSの物理化学的特性からガイダンスを得ることができます。LS中の臨界ミセル濃度(CMC)およびリン脂質の拡散率は、溶液28中の分子との化学的相互作用の影響を受ける。したがって、IS/LSエマルジョン中の水滴の形成は、リン脂質が油相で拡散し、水/油界面に到達して安定した単層(膜の内側のリーフレット)を形成する速度によって影響されます。このプロトコルで利用された2つのオイルで拡散率の違いが観察され、シリコーンオイルAR20はIS/LSエマルジョンの安定性が高くなりました(図6)。両方のオイルで最も安定したエマルジョンは、水が2.5%の比率で分散されたときに観察されたため(鉱物油13での以前の観察と一致)、これを一般的に有効な比率として修正しました。

それにもかかわらず、より高い比率は有用な特徴を提供する可能性があるため(たとえば、鉱物油中のPOPCはより大きなGUVへのシフトを示しました13)、図6で報告されているような予備的な定性試験を実行して、エマルジョンの安定性、ひいてはカプセル化の期待される効率についての洞察を得ることをお勧めします。ここでは、有効性はオペレーターまたは採用された機器に厳密に依存するため、エマルジョンの形成のための正確なタイミングや手順の反復に頼らないことをお勧めします。代わりに、エマルジョンの品質が、少なくとも理論的には、液滴をGUVに変換する可能性を最大化するのに十分な時期をオペレーターが理解できるように、チェックポイントを提供します。油中のリン脂質の拡散率は、液滴移動中に再配列し、GUV膜の外側のリーフレットを形成する能力にも影響します2,7,18,29。このステップは、LS/OSインターフェースの適切な平衡化によって有利に働く。このプロトコルで採用されているインキュベーション時間は一般的な推奨事項18に沿っていますが、以前のレポート7および予備実験からの界面張力測定により、異なるLSで調製されたGUVは、より長いインキュベーション時間の恩恵を受ける可能性があります。

外側のリーフレットの形成は、LS/OS界面を横切る水滴の速度によっても影響を受け、このステップは3相30の密度と粘度に関連する。密度の違いは、常に IS > OS > LS の順序に従う必要があります。これは、最初に IS 液滴を LS/OS 界面に向かって沈降させ、次に GUV に変換するための界面を交差させ、チューブの底に向かって沈降させるために不可欠です。このプロセスは、脱イオン水がISとOS23の両方として使用されている場合でも自発的に発生する可能性がありますが、GUV形成を支持するためにISとOSの間の密度の違いが導入されました31。この目的のための最も一般的なペアは、ISのスクロースとOSのグルコースです:浸透圧ストレスによる形成GUVへの損傷を防ぐために必要な等浸圧濃度では、スクロースはグルコースよりも密度の高い溶液を提供します。密度の差はこれらの溶液の浸透圧とともに増加するため、GUVの収量はそれに応じて変化し、600 mOsmを超えてそれ以上の改善は観察されません13。

最適な遠心分離条件は、3相の密度と粘度、およびリン脂質の拡散率に密接に関連しています。3 つのフェーズの完全な特性評価がない場合は、複数の条件をスクリーニングする必要があります。定性的試験(図4E および 図5)および予備的な系統的分析17から、このプロトコルに記載されている2つのサンプルの良好な遠心分離条件を定義することができました。しかし、より多くの条件がスクリーニングされれば、サンプルの品質は改善の余地があります。LSのリン脂質拡散率と3相の密度と粘度のバランスが適切に維持されていない場合、リン脂質はLS / OS界面で平衡化し、水滴がOSに向かって移動するときに正しく再配置するのに十分な時間が不足します。これにより、界面またはそのすぐ下に白っぽい沈殿物が形成されることが多く、これはおそらく、遠心分離中にGUVに組み立てられなかった液滴によって引きずられたリン脂質やその他の油相分子で構成されています。

均質な溶液のカプセル化は、OSとの浸透圧バランスを維持しながらIS密度を増加させることによって駆動できます(スクロース-グルコースペアの場合など)、微粒子分散液のカプセル化には、微粒子の密度と一致する水相の密度が必要です32。貨物のカプセル化効率は、貨物溶液/分散液の化学組成にも影響されます。以前の報告では、多くのアルカリ金属ハロゲン化物33 またはpH変動13によって引き起こされるGUV収率への悪影響が示されており、これはおそらく、リン脂質の両性イオン性親水性ヘッドの正味電荷の相互作用またはシフトによるものです。したがって、生物学的反応(酵素的または無細胞のタンパク質合成など)をカプセル化するには、pHと塩の濃度(KClやNaClなど)を反応自体にとって最適ではないレベルに調整する必要があるため、妥協が必要になることがよくあります。それにもかかわらず、無細胞タンパク質合成などの複雑な反応混合物でさえ、機能的なGUVベースの人工細胞を提供するように修飾することができる34。

実用的な観点から見ると、液滴転送方法は非常に簡単なプロセスを提供しますが、OS からの GUV の回復にはいくつかの制限が生じる可能性があります。遠心分離ステップ後に上相からオイルを除去するために、複数のサンプルが調製された場合に、より細かい除去(プロトコルステップ3.1.1)またはブフナーフラスコを使用してより迅速に除去することができます(プロトコルステップ3.1.2)。それにもかかわらず、油は完全に除去されないため、きれいなGUV分散液を得るために洗浄ステップを実行する必要があります(プロトコルステップ3.2)。洗浄ステップにより、GUVの目立った損失なしに残留油滴を効果的に除去することができましたが(図4A、B)、高粘度の油ではこの通過がそれほど簡単ではない可能性があり、複数のGUV製剤を調製する場合は非常に時間がかかる可能性があります。オイル除去をバイパスし、針35の助けを借りて突き刺された穴を通してチューブの底からGUVを回収する代替方法が説明された。ただし、このプロセスでは、チューブが適切な位置に穴を開けていない場合、GUV ペレットを完全に回収できない可能性があり、さらに、オペレーターに有害な可能性があります。

GUVの回収を助けるために、ここでは油相を迅速に除去するための新しくシンプルなアプローチを紹介します。これは、上部の密度の低い油相をキャップ付きのピペットチップに捕捉し、遠心分離後に液体が滴り落ちないようにチップを除去できるようにすることに基づいています。このシンプルな戦略により、油相全体を一度に迅速かつ簡単に除去できるため、この時間のかかるステップが一貫して簡素化されます。

プロトコルの効率を評価するために、計数とサイズ分布分析を高速化するために、GUVの自動検出のためのいくつかの方法が実装されています。蛍光プローブでGUVを標識することは、フローサイトメトリー36,37および円検出アルゴリズム13,37,38,39と組み合わせた顕微鏡イメージングの両方に適用される簡単で効果的な戦略を提供する。最近では、このプロセスを改善するために、物体検出のためのAIベースのツールが検討されています40,41。ただし、蛍光色素は GUV 特性に影響を与える可能性があり、分析にアーティファクトが発生します。検出可能な蛍光シグナルを除外する場合、顕微鏡法は依然として最も信頼性の高いオプションであり、位相差顕微鏡法は最適な視覚化18と円検出アルゴリズムの適用のための好ましい方法である38。

あるいは、特定の製剤の特異な特性を利用して、独自の検出戦略を作成することも可能です。例えば、Hadornらは、IS中の電解質の存在を利用して、インピーダンスベースのセルカウンター33でGUVを検出した。これらの自動化された方法や製剤固有の方法のいずれも実行できない場合、手動の円アノテーションは普遍的に適用可能なフォールバックのままです。このような場合、ImageJは、このプロトコルで説明されているように、プロセスを高速化し、生の直径測定値を簡単に抽出するための実用的なツールを提供します。

液滴転写法が広く採用されているにもかかわらず、新しいGUV製剤に必要な最適化プロセスにはほとんど注意が払われていません。この研究では、文献から入手可能な情報を収集して、この最適化を誘導および簡素化するための体系的なプロトコルを実装しました。この実践ガイドでは、プロトコル13,14の見落とされがちな側面である、新規GUV製剤の製造と、油で汚染された最小限のサンプルの回収に関わる基本的な原則を検討しています。GUV 製剤に必要な最適化を予測することは不可能ですが、このガイドでは、人工細胞やマイクロロボットなどのアプリケーションにつながる可能性のある、新しい GUV の実装を加速するための有用なヒントと洞察を提供します。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者には宣言すべき競合する利益はありません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

これらの成果は、欧州連合のHorizon 2020研究イノベーションプログラム(助成金契約番号948590)の下で欧州研究評議会(ERC)から資金提供を受けたプロジェクトCELLOIDS(細胞に触発された粒子ベースのインテリジェントマイクロロボット)の一部です。この作業は、NextGenerationEU BRIEFプロジェクトを通じて欧州委員会によって部分的に支援されました。グローブチャンバーの設置における技術サポートと、油を簡単に除去するための容器の実装に関する有益な議論をしてくれたミケーレ・イブラヒミに感謝します。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.22 & マイクロ;m混合セルロースエステル膜 シリンジフィルターメルクSLGSVR255F
1.5 mLチューブバイオクラス06.0279.00
100 & ムー;L型ガラス製シリンジメルク20737
150 mLビーカーアバントール 213-11233以上
20 mLダークガラスバイアル ND24アバントール 548-9001A
2 mLチューブバイオクラス07.3534.99
50mLシリンダーアバントール 612-3843
500 & ムー;L型ガラス製シリンジハミルトン549-1166
50 mL ファルコンチューブメルクCLS352070
50 mLシリンジ フィッシャーサイエンティフィック8SS50L1
5 mLチューブグライナーバイオワン622201
600 mLビーカーアバントール 213-1126
BüchnerフラスコメルクZ740682
丸底フラスコ用コルクリングアバントール 217-1000
晶析装置ダッチャー080474A
D-(+)-グルコースシグマ・アルドリッチG8270
D-(+)-ショ糖シグマ・アルドリッチS9378
デジタル温湿度計ボーレンダーV1863-07
DOPCのアバンティ・リサーチ850375C
ドリルドレメル4000
エリオグラウシン二ナトリウム塩(ブリリアントブルーFCF)シグマ・アルドリッチ861146
G18シリンジニードルテルモAN1838R1
G21シリンジニードルテルモAN2138R1
グローブチャンバーベルアートF50030-0000利用可能な場合はグローブボックスを使用できますが、湿度レベルが低い研究室では必要ない場合があります
ホットプレートマグネチックスターラーLLG実験器具6.263 448
軽鉱物油シグマ・アルドリッチ330779
新しいコクシンシグマ・アルドリッチ199737
ニトリルゴム製OリングOリング、8mmボア、外径12mmRS196-4863
セプタム付きオープンスクリューキャップ ND24アバントール 〒548-0031A
P1000マイクロピペットフィッシャーサイエンティフィック12346132
P10000マイクロピペットアバントール 89079-978
P200マイクロピペットフィッシャーサイエンティフィック12326132
ペーパータオルアバントール KIMB6657
パラフィルムアバントール 291-1214
ピペットチップ (1000)エッペンドルフ0030000919
ピペットチップ (10000)エッペンドルフ0030000765
ピペットチップ (200)エッペンドルフ0030000870
ポリスチレン粒子、1.1 &mシグマ・アルドリッチLB11-1MLの
ラバーキャップバイオクラス S.r.l.12.2300.05
ゴム製円錐形ガスケットアバントール 217-0211
スクリューキャップ ND24アバントール 〒548-0161A
シリコーンオイル AR20シグマ・アルドリッチ10836
シリコンパイプ(内径1.6mm、外径3mm)RS667-8441
シリコンパイプ(内径6mm、外径12mm)RS273-25416メートル以上
三方ジャンクションRS795-405
双方向ジャンクションRS419-7287
双方向バルブクレイバー91280
純水サーモフィッシャーサイエンティフィック 22934利用可能な場合は、この製品をMilli-Qシステムで精製された水に置き換えることができます
万能はさみボーケム4154

参考文献

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