方法論記事

ライトシート蛍光顕微鏡を用いた再灌流急性心筋梗塞における心臓損傷と免疫応答の同時3D解析

DOI：

10.3791/68347

⸱

2025年9月26日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology and Vascular Medicine, West German Heart and Vascular Center, University Hospital Essen, 2Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG, 3Institute for Experimental Immunology and Imaging, University Hospital, University Duisburg-Essen

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

再灌流性急性心筋梗塞 (repAMI) における心臓損傷の 3 次元 (3D) 再構成により、関連する疾患に影響を与えるパターンの忠実な定量化と共局在化が可能になります。ここでは、心臓損傷、リスク領域、および免疫細胞応答を同時に測定するために、自動化可能なライトシートガイド下イメージングアプローチが提供されます。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

複雑な細胞相互作用は、再灌流急性心筋梗塞 (repAMI) 中の機能的および構造的組織リモデリングを決定します。これらのプロセスは、損傷した心筋がさまざまな領域 (損傷領域、リスク領域 (AAR)、および遠隔領域) に分割されるため、明確な空間分布を示します。これらの領域の3次元(3D)視覚化は、常在する心臓細胞と浸潤免疫細胞の間のさまざまな相互作用の分析に不可欠であり、可能な治療標的の特定を可能にします。ここでは、repAMI後の心臓損傷領域、AAR、および浸潤免疫細胞(好中球など)の同時かつ自動化可能な3D視覚化および定量化のためのプロトコルについて説明します。これには、逆行性抗体灌流による AAR の ex vivo 視覚化後の心臓損傷領域 (CD31陰性) および好中球浸潤 (Ly6G+) の生体内抗体媒介染色、およびライトシート蛍光顕微鏡 (LSFM) イメージングのためのさらなる無毒組織クリアリングが含まれます。この技術により、標的細胞の空間分析、例えば、免疫細胞への浸潤や、repAMI後の無傷のマウス心臓の損傷領域などが可能になります。従来の組織学および免疫組織化学は、コンピューター支援後処理による無毒の組織除去および画像取得後に実行できます。これにより、同じマウス心臓内で情報を得るのを多重化することができ、データの堅牢性が強化され、repAMIのような非常に複雑な損傷において特に重要です。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

再灌流性急性心筋梗塞 (repAMI) における組織損傷は、心臓のリモデリングと心不全の発症の主な推進因子です1。複数の局所メディエーターと常在する心臓細胞だけでなく、浸潤する免疫細胞も、複雑な相互作用でその拡大に影響を与えます2,3。これらのプロセスの空間構成を理解することは、repAMI 後の組織損傷を制限し、心機能を改善するための新しい治療標的を特定するための深い知識を得るために不可欠です。

心筋自体はさまざまな細胞型で構成されているため、すべての細胞型が虚血および再灌流障害中に独自の特定の抵抗能力を示すため、心臓損傷の詳細な分析は困難です4,5。repAMI の文脈における重要な特徴の 1 つは、内皮細胞機能の低下を伴う血管系の大幅な喪失です6。マウスおよびヒトにおける血管構造の描写および内皮機能障害の分析に使用される最も確立されたマーカーは、内皮細胞表面に発現する接着分子であるCD31(PECAM-1としても知られています)です7。さまざまな虚血/再灌流モデルでは、CD31の喪失は、内皮組織損傷の区別のための優れた代理マーカーであることが示されました8,9,10。さらに、repAMI 中は心臓全体で 3 つの主要な損傷コンパートメントが区別されます。虚血/再灌流 (I/R) 損傷の影響を受けない心臓組織は、遠隔領域を表します。血管閉塞の下流の心筋は、危険領域(AAR)11,12として定義されます。再灌流の開始後、先行する虚血(損傷領域)によって損傷したAARの内部で心臓組織の明確な領域を区別することができます13。マウスの心臓I / R損傷の従来の評価では、損傷した心臓細胞の代謝活性の低下を示す連続的な厚い切片に塩化トリフェニルテトラゾリウム(TTC)を使用します13,14。同時に、ex vivo Evanの青色染色を追加して、AAR15を測定することができます。ただし、これらの確立された方法には、免疫細胞浸潤の同時評価の可能性の低下、細胞型特異的損傷の区別、正確な 3D 組織再構成など、いくつかの制限があります。

ライトシート蛍光顕微鏡(LSFM)は、細胞レベルまでの蛍光シグナル分解能で、無傷の透明化したマウス臓器全体を視覚化することができます。最近、無傷のマウス心臓の3D視覚化のために、桂皮酸エチル(ECi)を使用した改良された無毒の組織除去法が導入されました8。TTC/エヴァンの青色染色の限界に対処するために、生体内抗体ベースのCD31蛍光染色を使用し、repAMI8中にCD31染色のない領域(CD31陰性)として心臓内皮損傷を明らかにしました。生体内染色と同様に、別の蛍光スペクトルを備えた蛍光色素結合抗 CD31 抗体による ex vivo 逆行性大動脈注射の追加投与は、AAR の同時期の 3D 描写を説明します。さらに、この方法は好中球染色を追加することで拡張でき、遠隔領域、AAR、および心臓内皮損傷体積で分離された細胞分布分析を可能にし、repAMI 中の好中球機能の理解を深めることができます。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

すべての実験動物手順は、管轄の地方自治体機関 (AZ 81-02.04.2023.A059 - Landesamt für Natur-, Umwelt- und Verbraucherschutz (LANUV)) によって承認され、動物実験および研究に関連するすべての倫理規制に準拠しています。実験は雄のC57BL/6Jマウス(9〜30週齢)で行った。動物は、地元の動物飼い場で特定の病原体のない(SPF)条件下で12時間/12時間の昼夜サイクルで飼育され、使用されました。

注: すべての外科的介入は、ケタミン (100 mg/kg) とキシラジン (10 mg/kg) を使用した腹腔内麻酔導入下で行われ、イソフルラン (1.5 Vol%) を使用した維持が行われました。動物の苦しみを軽減するために、すべての動物は、日中に麻酔前および麻酔後に 0.1 mg/kg のブプレノルフィンを皮下注射し、ブプレノルフィンを含む飲料水と組み合わせて一晩投与されました。repAMIを誘導するための外科的プロトコルは、以前に他の場所で説明されています16,17。生体内抗体注射を開始する前に、以下で説明する後のステップでex vivo逆行性抗体注射に使用される2つの6 cmペトリ皿を準備します。心臓から過剰な周囲組織を粗く除去するには、氷にPBSを入れた浅いシャーレを1つ必要とします(後の取り扱いプロセスを容易にするために、皿の中にサイズに合わせてカットされたガーゼを使用することをお勧めします)。大動脈カニューレ挿入には、20 G の鈍い鋼製カニューレ針を氷上の PBS に浸し、カニューレ ノッチの上に 5-0 縫合糸の緩い結び目を付けて、別の皿が必要です。カニューレ内の気泡は冠状血管を塞ぎ、完全な灌流を妨げる可能性があるため、避けるか除去してください。

1. 生体内抗体注射

  1. ケタミン(100 mg / kg)とキシラジン(10 mg / kg)を使用してマウスを麻酔します。
  2. 直接標識されたマウス抗CD31(クローン:MEC13.3、蛍光色素:AlexaFluor 790)およびマウス抗Ly6G抗体(クローン:1A8、蛍光色素:AlexaFluor 647)抗体を、総容量5 μL/体重あたり5 μL(20 gマウスの場合は100 μL)のPBSにそれぞれ10 μgを静脈内注射で注射します。
    注:この抗体注射は、心臓内のすべての内皮を標識し、repAMI損傷のサイズを定量化することを目的としています。
  3. 注射された抗体を10分間循環させてから、手順を続行します。

2.ハートの収穫

注:セクション2と3はタイムクリティカルであり、6分以内に完了する必要があります。

  1. 抗体注射の10分後に子宮頸部脱臼によって動物を犠牲にします。反射神経を評価することで死を確認します。
    注:血液サンプルが必要な場合は、次のステップに進む前に採取してください。
  2. マウスを実体顕微鏡下に置きます。
  3. 胸腔を開き、胸郭から首までの血管の出口近くで露出した上大静脈を切開します。
    注:大動脈は ex vivo 逆行性抗体注射に必要なため、無傷のままにしてください。
  4. ローラーポンプ(70 μL/s)を備えた27 G針を使用して、ヘパリンを含むPBS(20 IE / mL)で左右の心房耳介を介して、合計3分間、心臓 をその場で 灌流します。心臓の表在血管の薄れや肺や肝臓の白化により、十分な心臓血液の除去が顕著になります。
    注:右心室または左心室を介した心臓灌流は、ライトシート蛍光顕微鏡検査中にイメージングアーティファクトを引き起こす可能性があるため、避けてください。
  5. 心臓と少なくとも5 mmの残りの大動脈を周囲の肺組織とともに切除します。
    注:ライトシート蛍光顕微鏡検査中の組織損傷やイメージングアーティファクトを避けるために、切除中に心筋を直接保持しないでください。

3. ex vivo 逆行性抗体注射

  1. 心臓を氷冷のPBSと先ほど準備したガーゼを入れた6cmのペトリ皿に移します。
  2. 約5mmの大動脈を持つ心臓だけが残るまで、周囲の残りの肺、脂肪、および血管組織を切断します。
  3. 大動脈カニューレ挿入のために準備された皿に心臓を移します。
  4. 残りの大動脈を20 Gの鈍いスチールカニューレの上に引っ張り、プレノット50縫合糸でカニューレノッチに結紮します。
    注:カニューレの先端は、灌流液が漏れないように、大動脈弁に近づける必要があります。
  5. 左前下行動脈 (LAD) を、以前に repAMI の誘導に使用された正確な位置に 6-0 縫合糸で永久に再結紮します。
  6. AlexaFluor 546で標識された20 μgのマウス抗CD31(クローン:MEC13.3)抗体を含む400 μLのPBSを、挿入されたカニューレを介して逆行性に注入します。
    注:注射シリンジと挿入されたカニューレの間の接合部をシーリングフィルムで閉じて、冠状動脈を介した完全な抗体灌流を確保します。この抗体注射は、AAR の外側の内皮のみを染色するため、AAR 定量に使用できます。
  7. 挿入したカニューレを大動脈から引き抜きます。
  8. 心臓を10 mLの4%パラホルムアルデヒド(PFA)を含む15 mLポリプロピレン反応チューブに移し、暗所で4°Cで一晩攪拌せずにインキュベートします。

4. サンプル処理とクリアリング

  1. 固定された心臓を、5 mLポリプロピレン反応チューブ内で常温(RT)で暗闇でそれぞれ10分間、5 mL PBSを3回交換して洗浄し、常に頭上回転近くで撹拌します。
  2. 5 mLの上昇エタノールシリーズで、50%、70%、および100%の脱イオン水中で、それぞれ暗闇のRTで少なくとも2時間、5 mLポリプロピレン反応チューブ内で常に頭上回転近くで撹拌します。
    注:50%および70%エタノールでのインキュベーションは翌日まで延長できますが、100%エタノールでのインキュベーションは最大3日間延長できます。
  3. 10 mLの100%エタノールと5%DMSOおよび5%H2O2 を含む15 mLポリプロピレン反応チューブで、暗所で4°Cで4時間攪拌せずに脱水心臓を漂白します。
    注: 漂白プロセス中にチューブ内に圧力がかかる可能性があります。その後、チューブを開けるときは注意してください。
  4. 漂白した心臓を5 mLの100%エタノールで3回、暗所でRTでそれぞれ12時間洗浄し、常に5 mLポリプロピレン反応チューブ内でほぼ頭上回転で撹拌します。
    注:各インキュベーションステップは最大3日間延長できます。
  5. 心臓を4 mLのエチルシンネート(ECi)を含む5 mLのポリプロピレン反応チューブに移して組織を透明化し、暗所でRTで3日間攪拌せずにインキュベートします。
    注:クリアされた心臓は、RTで暗闇で正しく保管された場合、蛍光強度を低下させることなく、少なくとも3か月間ECiにとどまることができます。ECiはこの温度で凍結し、その過程でサンプルに損傷を与えるため、ECiまたはECiに保管されたサンプルを6°C未満で保管しないでください。

5. ジェランガムブロックの調製

  1. 1 gのジェランガム粉末を100 mLの加熱した水道水(50〜60°C)に混ぜます。
  2. マグネチックスターラーを使用して完全に解消するまで混合します。
    注: 粉末が適切に溶解しない場合は、電子レンジで沸騰するまで溶液を加熱します。
  3. ジェランガム溶液を100μmのセルストレーナーでろ過します。
  4. ろ過した溶液を浅い10 cmのペトリ皿にプレートします。
  5. ゲルが固まるまで冷まします。
  6. ゲルを15 mm、15 mm 5 mmのブロックにカットします。
  7. 脱イオン水中で50%および70%の上昇エタノールシリーズ50 mLのブロックを脱水し、それぞれRTで少なくとも2時間、1本の50 mLポリプロピレン反応チューブ内で常にほぼ頭上回転で撹拌します。
    注:ゲルブロックを追加した後、反応チューブにエタノールを充填します。反応チューブをゲルブロックで半分まで満たしてください。
  8. 脱水ブロックを50 mLの100%エタノール中で3回、RTでそれぞれ12時間インキュベートし、常に1本の50 mLポリプロピレン反応チューブ内でほぼ頭上回転で撹拌します。
    注:ゲルブロックを追加した後、反応チューブにエタノールを充填します。反応チューブをゲルブロックで半分まで満たしてください。ゲルブロックは、ECiでクリアされるまで、100%エタノールを含む最後の反応チューブに長期間残すことができます。
  9. ブロックを25 mLのECiを含む50 mLのポリプロピレン反応チューブに移し、RTで3日間攪拌せずにインキュベートします。
    注:アーティファクトの除去を避けるために、ECiを含む1つの反応チューブに数ブロックのみを入れてください。クリアされたブロックは、少なくとも6か月間ECiに残し、RTで保存できます。

6. イメージング

  1. 透明化したジェランガムブロックを、顕微鏡サンプルホルダーで透明化した心臓を安定させるのに必要なサイズに切断します。
    注:ジェランガムブロックは複数回再利用できます。
  2. 適切な励起および発光フィルター設定で、目的の蛍光シグナル(自家蛍光、AAR染色[AlexaFluor 546で標識された抗CD31抗体]、AlexaFluor647共役抗Ly6G抗体、CD31陰性 染色[AlexaFluor 790で標識された抗CD31抗体])を検出します。取得には、作動距離17.6mmの0.1NA対物レンズを使用します。
    注:白色光レーザー(200 mW、480-2400 nm)で信号を検出します。結合組織由来の自家蛍光の検出には、470/30 nmのバンドパス励起フィルターと525/50 nmのバンドパス発光フィルターを使用します。AlexaFluor 546共役抗体によるCD31染色は、520/40 nmバンドパス励起フィルターと585/40 nmバンドパス発光フィルターで検出されます。AlexaFluor 647共役抗体によるLy6G染色は、630/30 nmバンドパス励起フィルターと680/30 nmバンドパス発光フィルターで検出されます。AlexaFluor 790共役抗体によるCD31染色は、740/40 nmバンドパス励起フィルターと824/55 nmバンドパス発光フィルターで検出されます。照明時間とレーザー減衰率は、信号品質に応じて調整する必要があります。
  3. ライトシート顕微鏡イメージングでは、次の設定を選択します。
    1. シートNAを0.079に選択すると、シートの厚さは5μmと薄くなります。
    2. 2つの個別のZ平面間の距離として10μmを選択します。
      注:これにより、アンダーサンプリングが発生し、その後、トレースと体積測定の精度が低下します。これを回避するには、2つの個々のZ平面間の距離は、ライトシートの厚さの半分に等しい必要があるため、この場合は2.5μmです。この研究では、イメージング時間とデータスタックサイズの短縮によって得られる利点が、分析精度の最小限の損失を上回るため、データをアンダーサンプリングすることを選択しました。
    3. シート幅を100%にして、サンプルを均一に照らします。

7. 画像の後処理

注:取得したデジタル画像データは、 材料表に記載されている科学的な3D画像処理および解析ソフトウェアを使用してさらに処理されました。

  1. Imaris ファイル コンバーター 10.1 ソフトウェアを起動し、画像ファイルを含むフォルダーを Imaris ファイル コンバーター ウィンドウに ドラッグ アンド ドロップ するか、[ 参照 ] をクリックして画像ファイルを含むフォルダーに移動して、生のデータセットをソフトウェアにロードします。
  2. [ フォルダーの選択] で出力フォルダーを選択します。
  3. [すべて開始] をクリックし、ファイルが .ims Imaris ファイルに変換されるのを待ちます。
  4. ソフトウェアを起動し、左上隅にある [Surpass] を選択します。
  5. [ 開く ] を選択してイメージ スタックを開き、対応する .ims データ ファイルを選択します。
  6. 心臓全体の自動生成サーフェスを作成するには、[ 3D ビュー ]と [サーフェス]を選択します。
  7. アルゴリズム設定セクションで表面の分類を無効にしながら、関心領域のみを選択し、最終的に画像全体を処理し、オブジェクト-オブジェクト統計を選択します。
    注: オブジェクト間統計を有効にすると、さまざまなサーフェスとスポット関数のオーバーレイ計算が可能になります。
  8. [作成] シートの右下隅にある青い矢印ボタンをクリックして、次の手順に進みます。
  9. 画像ビュー内に表示されるマニピュレーターを使用して、関心のある3次元領域を決定します。
  10. ソースチャンネル(自家蛍光チャンネル)を選択して、次のステップに進みます。
  11. スムーズ を有効にし 、デフォルト設定の11.8 μmを選択します。
  12. 次のステップに進み、画像ビュー内に現れる光学的に満足のいく3次元サーフェスを作成するために必要なしきい値を決定します。
  13. 最後のステップで、サーフェス フィルターを調整し、フィルター タイプとして [ ボクセル数 ] を選択し、しきい値として 10 を決定します。
  14. [作成]セクションの右下隅にある緑色の矢印ボタンをクリックして、サーフェスを作成します。[カラー]シートを使用して、必要に応じて作成したサーフェスのマテリアルと色を変更します。
  15. [3D View]と[Surfaces]をもう一度選択して、AAR(AlexaFluor 546チャンネルのCD31ネグボリューム)と心臓内皮損傷ボリューム(AlexaFluor 790チャネルのCD31ネグボリューム)用に、さらに2つの手動で作成したサーフェスを生成します。
  16. アルゴリズム設定セクションで表面の分類を無効にしながら、関心領域のみをセグメント化し、最終的に画像全体を処理、オブジェクト-オブジェクト統計を選択し、自動作成をスキップし、手動で編集をクリックします。
  17. ボードシート内で、方向にXY、表示になしを選択し、解像度コントローラーを手動で最大に調整します。
  18. モデルシートに移動し、距離アイコンをクリックして、頂点間隔を100 μmに設定します。
  19. [10画像スライスごとに、AlexaFluor 546チャンネルまたはAlexaFluor 790チャンネルのCD31負の領域を描画して囲む]を有効にします。
  20. 関連するすべての領域の囲みが終わったら、[自動調整]と[自動調整の実行]を選択します。
  21. [サーフェスを作成]をクリックし、[カラー]シートで生成されたサーフェスのマテリアルとカラーを調整します。
  22. 好中球をLy6G+スポットとして表示するには、3Dビュー とスポットを選択してスポット関数を生成します。
  23. アルゴリズム設定セクションでスポットの分類を無効にしながら、関心領域のみをセグメント化、最終的に画像全体を処理、オブジェクト-オブジェクト統計を選択します。
  24. [ 作成 ] シートの右下隅にある青い矢印ボタンを使用して、次の手順に進みます。
  25. 上記のように、画像ビュー内に表示されるマニピュレーターを使用して、関心のある3次元領域を決定します。
  26. ソースチャンネル(AlexaFluor 647チャンネル)を使用して次のステップに進みます。
  27. 推定XY直径を10 μmに設定し、 Z軸に沿ったモデルPSF伸びを有効にし、推定Z直径を20 μmに設定します。
  28. 背景の減算を無効にします。
  29. 次のステップに進み、フィルターとして [強度最小 ] を選択し、適切なしきい値を設定します。
    メモ:しきい値レベルを推定するには、プログラムウィンドウの上部にある [スライス ]をクリックし、AlexaFluor 647チャンネルを選択します。正のLy6G染色を表す生画像スライスのさまざまなスポットにカーソルを移動し、プログラムウィンドウの左下隅にある強度値を読み取ります。
  30. [ 作成 ]シートの右下隅にある緑色の矢印ボタンをクリックして、スポットを生成します。
  31. [作成]シートの[ポイント スタイル/品質]セクションで、[半径スケール]を 3.0 に設定します。
  32. 必要に応じてスポットカラーを調整するための カラー シートにアクセスしました。

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ライトシート蛍光顕微鏡 (LSFM) を使用した提示されたアプローチにより、repAMI 後の AAR、内皮損傷、および好中球浸潤の同時分析が可能になります。 図1A は、repAMIの誘導24時間後のC57BL / 6Jマウスの生体内および ex vivo 抗体染色を示しています。心臓内皮損傷の染色用抗体(AlexaFluor 790で標識された抗CD31)および好中球浸潤(AlexaFluor 647で標識された抗Ly6G)を犠牲の10分前に静脈内注射しました。十分な採血後、AlexaFluor 546と結合した抗CD31抗体の逆行性大動脈灌流によってAARを染色し、心臓を4°Cで4%PFAで一晩固定しました。 図1B は、LSFMイメージングのためのさらなる組織処理を示しています。固定後、組織の自家蛍光を減少させるために、過酸化水素とジメチルスルホキシドで漂白した後、エタノール列を上昇させて心臓を脱水しました。最後に、ECiを使用して完全に脱水された組織の屈折率マッチングを実行し、全臓器LSFM...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

マウスのrepAMI中の心臓組織損傷を検出するためのいくつかのイメージングエンティティがあります。これらの手法にはさまざまな利点がありますが、制限もあります。TTCを使用して心臓細胞の代謝活性低下を染色することは、心臓I / R損傷の定量化に最も一般的に使用される方法であり、AAR13、14、15を区別するためにEvanの青色染色と組み合わせることができます。これは高速で費用対効果の高い方法ですが、連続組織切片を生成する必要があるため、正確な 3D 再構成には制限があります。同じことが、心臓組織損傷の従来の組織学的方法、例えば、ヘマトキシリン/エオシンまたはゴモリトリクロ染色にも当てはまり、より高い空間イメージング分解能での分析を可能にします18,19。一方、repAM...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

エリアス・ハジ・イェヒアは、提出された作品の外にあるアストラゼネカからの個人料金やその他の費用を報告しています。Simon F. Merz と Lea Bornemann は現在、Miltenyi Biotec BV & Co. KG に勤務しています。マティアス・トツェックとティヌシュ・ラサフは、個人手数料を報告し、エドワーズとノバルティス、ブリストル・マイヤーズ スクイブ、バイエル、第一三共、アストラゼネカからのその他の手数料は、提出された作品の外にあります。Tienush Rassaf と Ulrike B. Hendgen-Cotta は、心臓保護ペプチドの開発に焦点を当てた会社である Bimyo を共同設立しました。Matthias Gunzer は、Miltenyi BioTec BV &; Co. KG から一般研究資金を受け取りました。他のすべての著者は、利益相反がないことを宣言しています。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは、次の資金源を認めています: ドイツ研究財団 (UMEA Clinician Scientist、FU 356/12-2、Elias Haj-Yehia;HE6317/2-1、Ulrike Hendgen-Cotta、RA969/12-1、Tienush Rassaf)およびドイツ心臓学会(DGK、Deutsche Gesellschaft für Kardiologie - Herz- und Kreislaufforschung e.V.、DGK02/2022、Elias Haj-Yehia)。この作業の一部は、ドイツのデュイスブルク・エッセン大学医学部のサービスコア施設であるエッセンイメージングセンター(IMCES)で実施されました。IMCESのスタッフの継続的な技術サポートと機器の使用に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
27G針ベクトン・ディキンソン305889BDエクリプス
3D画像処理&分析ソフトウェアビットプレーンバース。10.1.0イマリス
5-0縫合糸セラグ・ヴィースナーIC108000絹
6-0縫合糸エチコンEH7814プロレン
AlexaFluor 546抗体標識キットインビトロゲンA20183
AlexaFluor 790抗体標識キットインビトロゲンA20189
抗マウスLy6G抗体(AlexaFluor 647)バイオレジェンド127610クローン:1A8
セルストレーナー(100µm)コーニング431752
ジメチルスルホキシド(DMSO)カール・ロス7029.1
エタノールカール・ロス0911.4
エチルシンネメート(ECi)シグマ・アルドリッチ112372
ファイル変換ソフトウェアビットプレーンバース。10.1.0イマリス
ガーゼフールマン10021
ジェランガムパウダーシグマ・アルドリッチP8169フィタジェル
ヘパリン(25.000 IE / 5 mL)レオファーマ15261203
過酸化水素(H2O2、30%)カール・ロス8070.2
注射用シリンジBブラウン9161502SオムニカンF
ケタミン(100 mg / mL)ベラファーマ402581.00.00
ライトシート顕微鏡システムミルテニー・バイオテック-ウルトラマイクロスコープブレイズ
ルアーロックシリンジベクトン・ディキンソン303172BDプラスティパック
マグネチックスターラーVWRの444-0572
Neo sCMOSカメラ(4.2 MP)アンドールテクノロジーZL41セル4.2
目的ミルテニー・バイオテック130-133-625MIプラン 1.1x NA 0.1、WD 17.6 mm
パラホルムアルデヒド(PFA、4%)シグマ・アルドリッチ1.0049610%ホルマリン、中性緩衝
ペトリ皿グライナーバイオワン632181
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)ギブコ14190-094MgCl2/CaCl2
ポリプロピレンチューブ(15mL)グライナーバイオワン188261
ポリプロピレンチューブ(5mL)カール・ロスエキ9.1黒い
ポリプロピレンチューブ(50mL)グライナーバイオワン227261
マウス心臓カニューレ挿入のための準備皿ヒューゴ・サックス・エレクトロニック73-4327カニューレ付属
精製抗マウスCD31抗体ベクトン・ディキンソン53369クローン:MEC13.3
ローラーポンプイスマテックISM597-230
シーリングフィルムベミスPM-996パラフィルム
実体顕微鏡ライカS6D
チューブローテーターハイドルフポリマックス1040
白色光レーザーNKTフォトニクススーパーKエクストリーム200 mW、480–2400ナノメートル
WTマウス系統ジャンビエ研究所-C57BL/6JRj
キシラジン (2%)セヴァ・ティアゲスンハイト6324464.00.00

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Whelan, R. S., Kaplinskiy, V., Kitsis, R. N. Cell death in the pathogenesis of heart disease: mechanisms and significance. Annu Rev Physiol. 72, 19-44 (2010).
  2. Frangogiannis, N. G. Inflammation in cardiac injury, repair and regeneration. Curr Opin Cardiol. 30 (3), 240-245 (2015).
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