方法論記事

腫瘍免疫学および治療研究のためのアゾキシメタンおよびデキストラン硫酸ナトリウムを使用して大腸炎関連結腸癌を誘発するための最適化されたマウスモデル

DOI：

10.3791/68351

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2025年7月25日

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1Department of Pharmacology and Therapeutics, University of Florida College of Medicine, 2Department of Anatomy and Cell Biology, University of Florida College of Medicine, 3Department of Immunology, H. Lee Moffitt Cancer Center and Research Institute, 4University of Florida Health Cancer Center

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

アゾキシメタン (AOM)/デキストラン硫酸ナトリウム (DSS) 誘発性大腸炎関連結腸がんは、マウスの大腸の自生腫瘍をモデル化するための確立された費用対効果の高いアプローチです。更新されたプロトコルを提示し、性別特異的なDSS用量の最適化に関する重要な考慮事項と、厳密さ、堅牢性、再現性に対するマイクロバイオームの寄与について説明します。

要約

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アゾキシメタン(AOM、DNA損傷剤)およびデキストラン硫酸ナトリウム(DSS、大腸炎促進剤)は、高い浸透度でマウスの大腸に腫瘍を誘発する可能性があります。AOM/DSS によって誘発されるマウス大腸炎関連結腸がん (CAC) モデルは、ヒト CAC の臨床的特徴を再現する精度を考慮すると、炎症関連結腸がんの調査におけるゴールド スタンダードとなっています。このモデルの利点には、内因性組織からの起源と発達、腫瘍と免疫の相互作用の完全なレパートリーを維持する免疫能力、多数のマウス系統への適応性、3か月の潜伏時間の利便性、および比較的低いコストが含まれます。これらの利点にもかかわらず、いくつかの課題によりプロトコルの有効性が制限されます。研究間での DSS 投与量と腫瘍浸透度のばらつきは、一貫性のない観察につながります。さらに、腸内細菌叢の変動は実験の変動性の増加に寄与し、統計的検出力に悪影響を及ぼします。AOM/DSS に反応する性差は、結果の解釈をさらに複雑にします。さらに、DSSのロット間のばらつきは、調査結果の再現性を妨げます。これらの課題に対処することは、前臨床研究におけるこのモデルの信頼性と適用性を高めるために非常に重要です。これを解決するために、C57BL/6Jマウスをモデルとして使用し、確立されたプロトコルを効果的な最適化のための戦略で改良し、研究間の再現性と調和を高めました。これらには、雄マウスと雌マウスの両方におけるDSS用量滴定の推奨事項、ケージ間の腸内細菌叢の不均一性を軽減するための各DSSサイクルの前の微生物叢均質化の実施が含まれます。これらのステップにより、ばらつきが大幅に減少し、再現性が向上し、その結果、CAC の堅牢な誘導が実現しました。CAC発生における炎症および細胞性免疫メカニズムの極めて重要な役割を認識し、このプロトコルは、RNAまたはタンパク質の単離、および結腸腫瘍および周囲の結腸組織からの炎症性サイトカインのプロファイリングに適した組織処理手順についても説明しています。最終的に、この方法を使用すると、より厳密で堅牢で再現性のある CAC 生産が保証されます。

概要

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結腸直腸がん (CRC) は、世界で 3 番目に多いがんであり、がん関連死亡の主な原因です 1,2。散発性大腸がんと比較して、大腸炎関連結腸直腸癌 (CAC) は、炎症性腸疾患 (IBD) 3,4 患者の長期にわたる繰り返しの腸損傷の結果として発生し、悪性度が高く、若い年齢で多巣性症状が現れる傾向が特徴です。これらの要因により、CAC は一般に、より積極的な治療を必要とし、臨床転帰はあまり好ましくありません5。CAC は、少なくとも部分的には、変異の獲得の独特なタイミングと、炎症性免疫メカニズムとマイクロバイオームの大きな役割により、別個の実体と見なされていますが、CAC と散発性 CRC は、全体的なゲノム状況と病因的特徴に関して多くの類似点を共有しています。CRC 全般、特に CAC の理解を深め、治療戦略を改善するには、堅牢な前臨床モデルが不可欠です。

CRC の研究に使用されるさまざまなモデルの中で、AOM/DSS 誘発 CAC モデルが最も広く採用されており、現在のゴールド スタンダードと見なされています 6,7。AOM によって送達される強力な変異原性傷害から開始されるこのモデルは、CAC8 の十分に確立された危険因子であるクローン病や潰瘍性大腸炎など、ヒトの IBD を厳密に模倣する DSS 誘発性大腸炎の繰り返し発作に依存しています。AOM/DSS モデルには、他の in vivo アプローチに比べていくつかの重要な利点があります。側面腫瘍や同所性腫瘍を確立するために外因性のがん開始物質の注射に依存する方法とは異なり、AOM/DSS 誘発性 CAC は自生的であり、腫瘍の発生は内因性で起こり、がんの進行は天然組織微小環境で展開し、その生物学と自然史をより厳密に反映しています。ヒト細胞株の異種移植片や、免疫不全マウスでしか増殖できない患者由来物質の異種移植片とは異なり、免疫能力があり、がんと免疫の相互作用の研究が可能です。特定の遺伝的ドライバーを持つ腫瘍を生成する遺伝子操作モデルとは異なり、事前に定義された変異にとらわれないため、がんシグナル伝達経路と免疫教育メカニズムのより広範なモデル化が可能になります。最後に、AOM/DSS モデルはマウスのさまざまな系統に容易に適応できるため、長い繁殖スキームが不要になり、時間とコスト効率の両方が向上します。ただし、動物の性別、DSS の投与量、腸内細菌叢の違いなどの要因によりばらつきが生じ、再現性に影響を与え、トランスレーショナル リサーチへの応用が複雑になる可能性があります。

私たちは、結腸の炎症と CAC 腫瘍形成の程度の不一致を支えるこれらの要因の影響を軽減するために、このプロトコルを改良することを目的としました。急性炎症、大腸炎、または慢性炎症のいずれかを誘発するために使用される DSS の濃度、および CAC 9,10 には大きなばらつきがあります。DSS はポリマーであり、平均分子量はロットやメーカーによって異なる可能性があり、実験結果のばらつきに影響を与えます。したがって、研究間の一貫性を確保するために、DSS の各バッチをテストすることが不可欠です。さらに、DSS誘発性炎症の程度は腸内細菌叢の影響を強く受けており、これは世界中のマウス施設間、さらには同じ施設内の異なる保持場所やコロニー間でも大きく異なる可能性があります11,12。微生物組成のこの変動性は、モデルの結果に影響を与え、一貫性のない結果の一因となる可能性があります13。異なる実験群の動物を可能な限り共同収容することは、変動性を減らすために重要ですが、微生物群集は時間の経過とともに確率的ドリフトを受け、慢性炎症モデルでケージ効果につながるため、この交絡因子に対処するには十分ではない可能性があります14。AOM/DSSプロトコルは、慢性炎症を維持するための長期治療を伴うため、AOM/DSS処理された動物を収容するすべてのケージの寝具を定期的に混合することにより、微生物叢の均質化を実施しました。この方法は微生物叢環境を均質化するのに役立ち、その結果、実験のばらつきが減少します。さらに、観察によると、DSS の影響は動物の性別によって変化する可能性があり15,16、炎症やがんの発生に異なる反応をもたらす可能性があります。雌マウスと雄マウスのDSSを別々に滴定して、雌雄に適切な用量のDSSを選択することで既存のプロトコルを改良し、より均一な結果を保証し、雄と雌の両方のマウスで最適なサンプルサイズを決定するための統計的検出力計算に重要な入力を提供しました。

全体として、AOM/DSS モデルの再現性を高めるために、これらの交絡因子を考慮し、軽減する標準化された一連のプロトコル ガイドラインの概要を説明します。マイクロバイオーム均質化技術を採用し、より一貫性のある再現性のある結果を達成するために正確なDSS投与量調整を記述することで、AOM/DSSモデルの有用性とさまざまな研究間の調和を向上させます。私たちのプロトコルは、微生物叢均質化されたケージからのばらつきの低減を実証していることで際立っており、これらの再現性の実践を実装するための明確な段階的な手順を提供します。その結果、これらのプロトコルの改良によって影響を受けるグループ内の変動性が低くなると、実験グループ間の差異を検出する際に望ましい統計的検出力を達成するために必要なサンプルサイズが減少します。この最適化されたプロトコルは、腫瘍形成メカニズム、治療標的の研究、または免疫細胞動態の調査のために、系統や性別の背景に関係なく、AOM/DSS モデルを独自のマウス モデルや実験デザインに適応させることを目指す研究者向けに調整されています。

プロトコル

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すべての動物処置は、人道的な取り扱いと倫理基準の順守を確保するために、制度的に承認されたプロトコルに従って実行されなければなりません。ここで説明する研究は、フロリダ大学施設動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されました。

1. DSS投与の最適化

  1. 主な実験に使用する年齢、系統、ソースのマウスを、オスとメスの均等な分布で入手します。各マウスに、耳パンチ、テールマーク、または個別の追跡のために承認されたその他の方法でラベルを付けます。各動物の初期体重を測定して記録します。
    注:雄のマウスは離乳前に共同収容する必要があり、戦闘を最小限に抑えるためにケージ間で再分配しないでください。
  2. 自動散水を使用する場合は、実験開始の1週間前に、動物をウォーターボトルに切り替え、同時にケージノズル(ケージ内の金属製シッパーチューブ)を滅菌プラグでブロックします。
    注: 自動飲料水ノズルのブロックなど、給水の変更は、IACUC または動物の人道的な使用を監督する適切な規制機関によって承認されていることを確認してください。動物ケージは、飲料水への中断のないアクセスを確保するために、毎日のチェックが必要になる場合があります。
  3. 磁気撹拌バーと撹拌プレートを使用して、1.5%〜5%(w / v)のさまざまな濃度でオートクレーブ滅菌飲料水にDSSを溶解することにより、DSS溶液を調製します。DSSパウダーが水に完全に溶けるまで、室温で30分間待ちます。毎週新鮮なDSS水を準備し、4°Cで最大1週間保存します。
  4. 2本の50 mLコニカルチューブに各濃度のDSS水(男性用1本、女性用1本)を充填し、漏れを防ぐためにオートクレーブ滅菌滅菌飲用ノズルをしっかりと取り付けます。
  5. 雌マウスと雄マウスに各濃度のDSS水を投与し、各ケージ内の3匹のマウスに同じ濃度を与えます。陰性対照としてDSSを含まない滅菌飲料水を使用してください。DSS水は一日おきに交換してください。
  6. DSS水を7日間投与します。各マウスの体重を毎日記録します。
  7. 8日目に、すべての動物を通常の飲料水に戻します。
  8. 8 日目に、17 と記録スコアに記載されているように、標準化されたスコアリング システムを使用して、便の一貫性に基づいて下痢の重症度を評価します。「1」は柔らかいがまだ形成された便ペレット、「2」は非常に柔らかい便ペレット、「3」は下痢としてスコアを付けます。
  9. 8日目に、2〜3個の新鮮な便ペレットを収集し、潜血の存在を評価します( 材料表を参照)。サンプル中の血液の有無を記録します。
  10. 便の硬さ (0-3) と便中の血液の存在 (0-3) の 2 つのスコアリング基準の組み合わせに基づいて腸出血を評価し、合計スコアは 0 から 6 の範囲です。
  11. 9日目から12日目まで、各マウスの体重を毎日記録し、DSSで処理された動物の大幅な体重減少と重度の下痢を注意深く監視します。承認された動物使用プロトコルおよび確立された倫理ガイドラインに従って、二酸化炭素(CO2)窒息またはその他の適切な方法によって、人道的なエンドポイントに達した、またはそれを超えた動物を速やかに安楽死させます。
  12. 13日目から18日目まで、動物のモニタリングを継続し、実験前のレベルに完全に回復するまで、各マウスの体重を毎日記録します。
  13. 柔らかくまだ形成された便を伴う約 20% の体重減少をもたらすため、最適な DSS 濃度を決定します。最適な DSS 用量は、オスとメス、マウス系統、年齢、DSS ロット、および動物施設によって異なる場合があります。

2. CAC誘導

  1. 0-6 日目: AOM 治療 7-28 日目: DSS 治療の 第 1 サイクル
    1. AOM ストックの調製: AOM 粉末を滅菌生理食塩水に溶解して、ストック濃度 10 mg/mL にします。0.45 μmフィルターで溶液をろ過し、1 mLのアリコートを1.5 mLの微量遠心チューブに分配し、-80°Cで最大1年間保存します。
      注: AOM は揮発性発がん性物質であり、メーカーの安全に関する推奨事項に従って、適切な個人用保護具 (PPE) を備えたバイオセーフティ フードの下で注意して取り扱う必要があります。AOM および AOM で汚染された物質は、施設の有害化学廃棄物処理プロトコルに従って廃棄する必要があります。必要な環境衛生と安全の承認を事前に確保するのは研究者の責任です。
    2. 自動ケージ散水を使用する場合は、実験開始の1週間前に、自動飲料水ノズルをブロックし、ステップ1.2のように順応のために動物をウォーターボトルに切り替えます。
    3. 0日目に、各マウスの体重を測定して記録し、AOMの総必要量を計算します。次に、各動物の体重に基づいてAOM(1 mg/mL最終作業濃度)の総量を計算して、10 mg/kgの用量、例えば20 gのマウスで200 μLを達成します。
    4. 使用前に、必要な数の10 mg / mL AOMの新しいアリコートを氷上で解凍します。AOMの各1 mLアリコートを9 mLの滅菌生理食塩水で希釈して、1 mg / mLの作業濃度を達成します。
    5. 腹腔内注射によりマウスにAOMを投与します。この手順は、最適な保護のために二重手袋や N95 マスクなどの適切な PPE を着用しながら、バイオセーフティ キャビネット内で実行します。
      注意: 残ったAOM溶液は、有害化学廃棄物の処理要件に従って廃棄してください。
    6. 3日目に、AOM処理された動物を清潔なケージに移します。AOM で汚染されたケージやその他の保護材料を取り扱うときは、適切な PPE を着用してください。
      注意: 汚れたケージ寝具や食べ残しは、施設が承認した有害化学廃棄物処理手順に従って処分してください。
      注:AOMとその代謝産物は、投与後72時間までに完全に排泄され18、その時点で汚れたケージ寝具を処分することができます。
    7. 7日目に、ケージ間のばらつきを最小限に抑えるために腸内細菌叢の均質化を行います。これを行うには、各ケージから寝具の 25% をサンプリングし、完全に混合して、各ケージに再分配します。
      注: DSS 治療の週中およびその後 5 日間はケージの交換を控えてください。必要に応じて、施設の飼育ケージ交換サービスと調整します。
    8. 適切なノズルを備えた 50 mL コニカル チューブを使用して飲料水中に DSS を供給することにより、大腸炎の誘発を開始します。マウスを毎日チェックして、動物が DSS 水に無制限にアクセスできることを確認します。DSS水は一日おきに交換してください。各マウスの体重を毎日記録します。
    9. 14日目に、DSS水を通常の飲料水ボトルに交換します。動物の痛みや苦痛を注意深く監視し続けます。
    10. 14〜19日目に、各マウスの体重を毎日測定します。体重の25%以上減少した動物、または動物が承認された動物の世話と使用プロトコルに概説されている人道的エンドポイントのいずれかに達した場合、動物を安楽死させます。さらに、直腸出血の事例を監視し、記録します。
  2. 7-28日目:DSS治療の第1サイクル
    1. 7日目に、ケージ間のばらつきを最小限に抑えるために腸内細菌叢の均質化を行います。これを行うには、各ケージから寝具の 25% をサンプリングし、完全に混合して、各ケージに再分配します。
      注: DSS 治療の週中およびその後 5 日間はケージの交換を控えてください。必要に応じて、施設の飼育ケージ交換サービスと調整します。
    2. 適切なノズルを備えた 50 mL コニカル チューブを使用して飲料水中に DSS を供給することにより、大腸炎の誘発を開始します。マウスを毎日チェックして、動物が DSS 水に無制限にアクセスできることを確認します。DSS水は一日おきに交換してください。各マウスの体重を毎日記録します。
    3. 14日目に、DSS水を通常の飲料水ボトルに交換します。動物の痛みや苦痛を注意深く監視し続けます。
    4. 14〜19日目に、各マウスの体重を毎日測定します。体重の25%以上減少した動物、または動物が承認された動物の世話と使用プロトコルに概説されている人道的エンドポイントのいずれかに達した場合、動物を安楽死させます。さらに、直腸出血の事例を監視し、記録します。
  3. 29-49 日目: DSS 治療の 2 サイクル目
    1. ステップ 2.2.1〜2.2.4と同じ手順に従って、DSS投与とともに微生物叢の均質化を繰り返します。オプション: 2 回目および/または 3 回目の DSS サイクルに続いて、前述のように大腸内視鏡検査を実施します19。
  4. 50-70 日目: DSS 治療の 3サイクル目
    1. ステップ 2.2.1〜2.2.4と同じ手順に従って、DSS投与とともに微生物叢の均質化を繰り返します。マウスはDSSの3サイクル目の3日後に最も体重が減る傾向があるため、この期間中の過度の体重減少や直腸出血の兆候がないかすべての動物を注意深く監視し、必要に応じて支持療法のために湿った食事を提供します。

3. 大腸炎の重症度とCAC肉眼的病理の評価

  1. 70日目に、各マウスから2〜3個の新鮮な糞便ペレットを収集して、潜血および/またはリポカリン-220 などの炎症マーカーの存在をテストして、大腸炎の重症度を評価します。適切な試薬/キットを使用し(材料と機器のリストを参照)、製造元の指示に従って、以下に簡単に説明するアッセイを実施してください。
  2. 炎症マーカーのリポカリン-2レベルを評価するための糞便サンプルを調製するには、新鮮な便ペレットを1.5 mLの微量遠心チューブに入れます。ボルテックスミキサーを使用して、ペレットを1 mLの滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に均一な溶液が得られるまで溶解します。溶液を10,000 x g で4°Cで10分間遠心分離します。 上清は、リポカリン-2 ELISAにすぐに使用することも、後で使用するために-80°Cで保存することもできます。
  3. キット製造元の指示に従ってマウスリポカリン-2 ELISAを実行します。パイロット連続希釈実験を実行して、標準と比較して糞便サンプルの最適な希釈を決定します。
    注:リポカリン-2レベルは、水処理された対照動物と比較して、DSS処理マウスで少なくとも1000倍に増加すると予想されます20。
  4. ステップ 1.8-1.10 で説明されているように、下痢スコアリング システム17 を使用して大腸炎の重症度を評価します。
  5. 70日目に、CO2 窒息またはその他の承認された人道的方法を使用して動物を安楽死させます。
  6. 各動物の腹部に70%エタノールをスプレーして、後続のステップでの汚染を最小限に抑えます。
  7. 細い外科用鉗子を使用して、皮膚と腹膜層を持ち上げます。はさみで水平切開を行い、腹腔を露出させます。
  8. 小腸を外側に引っ張り、盲腸を特定します。鉗子を使用して盲腸と結腸をそっと持ち上げます。腸間膜と関連する血管系をハサミで切断し、結腸に穴を開けたり切断したりしないように、結腸を慎重に解剖します。
  9. 骨盤の骨と直腸肛門領域を取り巻く皮膚を切断して、完全な遠位結腸を露出させます。ほとんどの腫瘍は通常、この領域で発生するため、遠位部分を無傷で結腸全体を解剖することが重要です。
  10. 解剖した結腸を清潔な濾紙の上に置き、そっとまっすぐにします。
  11. 定規で結腸の長さを測定し、写真で記録します。縮尺のために定規を写真に含めます。
  12. 結腸の外側にあるパイエル板をきれいにし、組織に穴を開けないように注意します。
  13. 結腸を冷たい滅菌PBSですすぎます。
  14. パラフィンフィルムを使用して、200 μLマイクロピペットチップ(フィルターなし)を3 mLシリンジに固定します。このセットアップを使用して、シリンジに滅菌PBSを充填し、ピペットチップを結腸内腔に挿入し、結腸の内容物を2〜3回穏やかに洗い流し、便ペレットを完全に除去します。
  15. 清潔で事前に濡らした濾紙のストリップで結腸をそっと伸ばします。結腸を縦方向に切り開き、ろ紙の上に平らに置きます。
  16. 通常、結腸壁から突き出た顕著な水疱として現れ、炎症を起こした赤い外観を示す大きな腫瘍を特定します。
  17. 腫瘍が小さい場合は、同定時に特に注意してください。滅菌細菌播種ループを利用して、結腸の表面に凹凸や隆起がないか優しく調べます。検出された隆起が結腸壁の外側にあるリンパ節または血管の残骸ではないことを確認します。
  18. デジタルノギスを使用して、各腫瘍の幅と長さを測定します。
  19. 腫瘍数と各腫瘍のサイズと位置を、事前に印刷された結腸マップに記録します。

4.組織学的評価

  1. 先端の細い鉗子を2対使用して、遠位結腸の両側端をつかみます。結腸を遠位端から近位端まで転がして、他の場所で説明したようにスイスロール形状にします21。遠位端がロールの中心にあり、近位端が最外層を形成していることを確認します。
  2. 271/2-G 針を使用して、各スイス圧延結腸を固定します。
  3. 固定されたスイス巻き結腸をそれぞれ、適切にラベル付けされた組織カセットに入れます。
  4. スイス圧延結腸を含む組織カセットを滅菌PBSの4%パラホルムアルデヒド(PFA)に浸します。組織を固定液に24時間留めます。
  5. 24時間後、組織を70%エタノールに移します。組織は、4°Cの70%エタノールで最大3か月間保持できます。
  6. スイスロールは、従来のヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色、免疫組織化学、免疫蛍光など、複数の組織病理学検査に使用できます。

5. 腫瘍および周囲の結腸からタンパク質およびRNAを単離するための組織採取

  1. 氷の上で作業し、事前に冷却されたチューブと試薬を使用して、生物学的材料の完全性を維持します。
  2. 腫瘍評価後、腫瘍を解剖し、氷上で適切なバッファー(以下を参照)を使用して、事前に冷却され、事前に標識されたチューブに収集します。実験計画に応じて、同じ動物からのすべての腫瘍をプールするか、個別に処理します。必要に応じて、同様に、周囲の非腫瘍結腸組織の~1 cmの断片を収集します。
  3. タンパク質の単離
    1. 0.5 mLの800 μm粉砕ガラスビーズと400 μLの溶解バッファー(20 mM Tris-HCl(pH 7.5)を含む150 mM NaCl中の1%NP-40)および1%プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤のカクテルを各組織均質化チューブに加え、結腸/腫瘍組織を各チューブに移します。
    2. ビーズベースの組織ホモジナイザーを使用して結腸/腫瘍組織を6 M / Sで30秒間均質化し、完全な均質化のために2回繰り返します。
      注:機械的均質化によるサンプルの過熱を防ぐために、サイクルの合間にチューブを氷の上に置きます。
    3. 均質化後、150 μLのライセート(上清)を吸引し、清潔な1.5 mL微量遠心チューブに移します。
    4. ライセートを4°Cで10,000 g でスピンダウンして、不溶性物質をペレット化します。必要に応じて、上清をきれいなチューブに移します。
    5. ビシンコニン酸(BCA)アッセイまたはその他の適切な方法により、総タンパク質濃度を定量します。
    6. 必要に応じて、同じ溶解バッファーを使用して、サンプルごとに総タンパク質濃度を4 mg / mLに調整します。
    7. タンパク質ライセートは、イムノブロッティングやサイトカイン分析などの下流アッセイにすぐに使用するか、後で使用するために-80°Cで保存してください。
  4. RNA精製:
    1. 解剖後、結腸/腫瘍を1.5 mLの微量遠心チューブに入れ、200 μLの適切なRNA保存試薬に浸します。
      注:一時停止ポイント:新鮮な結腸/腫瘍組織は、液体窒素で急速凍結し、後で処理するために-80°Cで保存することができます
    2. 結腸/腫瘍組織を氷上で解凍します。
    3. 結腸/腫瘍を、RNA単離に適した適切な溶解バッファー500 μLと粉砕ガラスビーズ200 μLを含む組織均質化チューブに移します。
    4. ビーズベースの組織ホモジナイザーを使用して、6 M / Sで30秒間3回、各サイクルの間に2分間の休憩を挟んで均質化します。
      注:機械的均質化中の過熱によるRNA分解を防ぐために、サイクル間でチューブを氷上に移します。
    5. 300 μLのライセートを新しい1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。
    6. 必要に応じて、適切なRNA精製手順を使用してトータルRNAを単離します。RNA濃度、純度、および品質/完全性を、下流での使用に応じて測定します。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

実験条件に対して DSS 線量の最適化を実行しました。DSSの投与量は、すべての動物施設、マウス系統、研究デザイン、およびDSSロットに対して再校正する必要があります。この研究では、C57BL / 6Jマウスを、自由に標準的に照射された18%タンパク質げっ歯類 食で換 気ケージ内の特定の病原体のないビバリウムに収容しました。雄と雌の両方のマウスは、DSS水を投与した後、5日目から体重減少を開始し、DSS離脱の3日後に最低体重に達します(図1A、C)。最大の体重減少の日に、雄マウスは約15%の体重減少を示し、雌マウスは約20%の体重減少を示しました(図1B、D)。これらの結果に基づいて、特定の実験条件に対する最適用量は、女性で3.0%、男性で3.25%であると判断しました。AOM/DSSの治療スケジュールを 図2Aに概説し、実験が終了するまで各DSS処理サイクルの開始時にマイクロバイオームの均質化が発生し、ケージの影響と変動性を軽減します。実験の全期間にわたる動物の体重減少と回復の典型的なダイナミクスを 図2Bに示します。動物は、DSS投与の中止後2週間以内に元の体重に完全に回復します。適切に調整された DSS 大腸炎モデルでは、下痢の代わりに柔らかいがまだ形成された便ペレット (便の一貫性スコア 1-2) が得られ、無症候性出血を示す便中の潜血が時折検出され、便中に目に見える血液がほとんど検出されません (血液存在スコア 1-2)17。大腸炎の重症度をさらに評価するために、糞便サンプルを収集して、炎症マーカーのリポカリン-2 レベルを分析しました。潜血の存在は、DSS処理された動物とは異なり、実験全体を通して定期的に飲料水を受け取ったマウスでは検出されませんでした(図2C)。一貫して、リポカリン-2レベルは、AOM/水のみの対照と比較して、AOM/DSSで処理されたマウスで約1,000倍に上昇しました(図2D)。

エンドポイントでは、結腸を解剖し、腫瘍記録マップを使用して腫瘍をカウントしました(図3A)。DSS大腸炎は、AOM /水のみのコントロールとは異なり、結腸の長さが大幅に短くなります(図3B)。さらに、AOM / DSSで処理された動物は目に見える結腸腫瘍を発症し、そのほとんどが遠位端に形成されます(図3C)。H&E染色結腸切片の組織学的検査により、AOM/DSSマウスにおける有意な上皮細胞びらん、免疫浸潤、および潰瘍形成が明らかになりました(図4A)。結腸組織病理学の重症度は、免疫浸潤および浮腫(0-3)、潰瘍(0-3)、結腸上皮形態(0-4)、および新生物(0-4)22,23,24の4つのパラメーター(図4B)に基づいて、DSS誘発性マウスCACの確立されたスコアリングシステムを使用して定量化できます。図4Aの組織学例に適用されたそのような評価の結果を図4Cに示します。結腸上皮の増殖は、Ki67 染色を使用した免疫組織化学的分析によって評価され、DSS 治療が結腸上皮細胞の増殖を促進することが実証されました。さらに、結腸切片は、血管新生マーカーCD31などのさまざまなマーカーの免疫蛍光染色に利用できます(図4D、E)。

さらに、各動物の結腸炎症の大きさ、体重減少、累積腫瘍量などの実験エンドポイントに対する微生物叢の均質化の影響を評価しました。マウスの1つのグループは、微生物叢の均質化を達成するために0日目に汚れた寝具の混合と再分配にかけられたケージに収容され、この操作が省略されたケージ内の対照動物と一緒に収容されました。両方のグループの動物は、2.5%のDSS水を7日間投与されました。8日目のケージあたりの糞便中の炎症マーカーリポカリン-2の平均レベルはグループ間で有意差はありませんでしたが(ウェルチの t検定)、微生物叢の均質化を受けたケージのデータポイント間の変動性が有意に低いことが観察されました(図5A、分散を比較するためのウェルチのF検定、 p<0.0001)。一貫して、8日目までに、すべての動物は0日目のベースラインと比較して同様の程度の体重減少を示しました。しかし、微生物叢均質化群のマウスは、対照群と比較して体重減少の変動性が少なかった(図5B)。さらに、各DSSサイクルの前に(微生物叢均質化)および(対照)ケージ寝具混合を有しない10週間のCAC導入プロトコル(図2A)では、マウスあたりの累積腫瘍量は、有意に変動性が高かった対照と比較して、微生物叢均質化群でより一貫していました(図5C)。全体として、これらのデータは、微生物叢の均質化が AOM/DSS モデルの堅牢性と再現性を大幅に向上させるという強力な証拠を提供します。

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図 1.雄と雌のマウスにおけるDSS用量滴定(A-D)14週齢の雄(A、B)および雌(C、D)C57BL / 6J野生型マウスを、示されたDSS濃度(雄の場合は1%、1.5%、2%、2.5%、3%、雌の場合は2%、3%)で維持した野生型マウスの0日目と比較した体重変化率。(A、C)動物に DSS を 7 日間投与し、最大 12 日間体重減少を監視しました。BおよびDは、DSS治療開始から8日目(B)の雄マウスと9日目(D)の雌マウスの体重減少を示します。データは SEM ±平均として表示されます。A & B では n=3、C & D では n=4。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図 2.AOM/DSSによるCACタイムラインとモニタリング (A) AOM/DSS 誘発 CAC 実験タイムライン。(B) 実験的 AOM/DSS 処理 (赤) または対照 (AOM のみ、DSS なし、黒) 雌 C57BL/6J 野生型マウスにおける 0 日目に対する体重。すべての動物にAOM(10 mg / kg)を1回投与され、合計70日間、3%DSS(赤)または通常の飲料水(対照、黒)の3サイクルのいずれかに無作為に割り付けられました。データは、SEM±平均値、 n = 2および11として表示されます。(C)対照(AOMのみ)またはDSS処理(AOMおよび1.5%DSS)の雌マウスからの糞便ヘモカルト試験。(D)70日目の6対照(AOMのみ、黒)または35治療(AOMおよび1.5%DSS、赤)雌マウスからの糞便リポカリン-2レベル。データはSEM±平均値として表示されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図 3.結腸の肉眼的評価。(A)腫瘍記録マップの例。(B)70日目の対照(AOMのみ)またはDSS処理(AOMおよび1.5%DSS)雌マウスからの代表的な結腸写真。結腸長の短縮は、DSS処理された動物における炎症の拡大を示しています。バー-5mm;、p = 0.002、マンホイットニー順位和検定。n=12 & 30 です。(C)AOMおよび3%DSSで処理された雌マウスからの70日目の腫瘍を有する結腸の代表的な肉眼的病理画像(腫瘍は丸で囲まれ、黒い三角形でマークされています)。バー - 5 mm。コールアウト - 腫瘍のある遠位結腸領域の拡大図。バー - 1 mm)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図 4.CAC組織学評価。(A)70日目のAOM / DSS処理マウスおよび対照(AOMのみ)マウスからのスイス圧延結腸の代表的なH&E染色切片と、右側に表示されている3匹の動物からの拡大した遠位領域。対照結腸は無傷の結腸陰窩組織を示します。AOM/DSSで治療されたマウスの結腸は、粘膜下肥厚(矢じり)、免疫浸潤(矢印)、陰窩構造の破壊または喪失(星)、上皮層のびらん、上皮過形成または異形成上皮(円)と腺腫および腺癌形成(点線で概説)。バー - 500 μm。(B) CAC 表現型の重症度を評価するために使用される組織病理学スコアリング システム。(C)Aに示すAOMのみまたはAOM/DSS処理マウスの結腸組織学スコアの例。(D)DSSの1サイクルまたは3サイクル後のAOM処理動物のスイス圧延結腸におけるKi67増殖マーカーの代表的な免疫組織化学染色。増殖中の Ki67 陽性細胞 (茶色) は結腸陰窩の底に局在しますが、CAC の開始とより高度な病状により上方に広がり、陰窩内に侵入します。バー - 100 μm。CD31内皮マーカー(赤)に基づいて血管新生を評価し、DAPIで対比染色してAOM/DSS処理マウスの結腸切片の核(青)を視覚化する代表的な免疫蛍光染色。バー - 100 μm。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図5.微生物叢の均質化は、結腸の炎症と CAC 腫瘍量の変動性を減らします。(A)8日目に2.5%DSSで処理されたマウスの平均糞便リポカリン-2レベル。統計分析は、ウェルチの t 検定を使用して実行され、2 つのグループ間の平均糞便リポカリン 2 レベルを比較しました (p=0.137、n=6 &; 12 ケージ)。さらに、分散に関する F 検定が実施され、p 値は 0.0001 となり、2 つのグループ間の分散に有意差があることが示されました。(B)8日目にDSS水を投与されたAOM / DSS処理動物の平均体重減少。2 つのグループ間の平均体重減少には有意差はありませんが (ウェルチの t 検定、p=0.194、n=6 & 12)、グループ内の分散は有意に異なります (F 検定、p=0.027)。(C) 10 週間の AOM/DSS 治療後のマウスあたりの腫瘍量。統計分析は、グループ間の平均腫瘍量の差を評価するためのウェルチの t 検定 (p=0.211、n=8 &; 18) と、分散間の差を評価するための F 検定 (p=0.013) を使用して実行されました。(A-C)青いバイオリンプロットは微生物叢の均質化を受けたグループを表し、緑色のバイオリンプロットは対照グループ(微生物叢の均質化なし)を表し、nsは有意ではありません。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AOM/DSSプロトコルは、1996年にOkayasuらによって初めて導入され25、それ以来、2006年にSuzukiらによって実証されたように、正常組織から腺腫性変化、そして最終的には癌への結腸癌の開始と進行を忠実に模倣するための優れたモデルとして認識されています26、特に結腸の炎症の文脈で。その後の研究では、さまざまなマウス系統にわたるAOMおよびAOM / DSSの効果、および腫瘍表現型と浸透度に対するさまざまな治療期間の影響を評価しました26,27,28。2018 年、クリストファー ウィリアムズと彼のグループは、この方法論の開発に重要な基礎を築いた更新されたプロトコル29 を発表しました。最近の進歩により、腸内免疫浸潤の単離方法とフローサイトメトリーによる免疫表現型解析の方法を統合することにより、粘膜免疫の研究における AOM/DSS モデルの有用性がさらに実証されました30。

AOM/DSS プロトコルの主な強みの 1 つは、事実上あらゆる系統のマウスに容易に適応できることであり、さまざまな遺伝的背景の影響の調査を促します。したがって、Suzukiらは、結腸腺腫浸透度を読み出しとして使用して、4つの異なるマウス系統におけるAOM / DSS誘発性結腸発がんに対する感受性を比較し、次の結果が得られました:BALB / c > C57BL / 6N >DBA / 2N = C3H / HeN26。追加の研究では、FVB/Nマウスは、C57BL/6Jおよび129/SvJ株と比較して、AOM治療を繰り返すと結腸腫瘍を発症しやすいことがわかりました27。特に、浸透度がほぼ100%の高分化型結腸腺癌の発生が、10週間のAOM / DSS CAC導入プロトコルでFVB / Nマウスで報告されました31。これらの発見は、総合的に、異なるマウス系統がAOM/DSS治療に対して等しく感受性がない可能性があることを示唆しており、腫瘍形成の変動に寄与し、マウス系統、住宅施設、およびその他の変数全体にわたるAOM/DSSプロトコルの調和と再現性のための一貫した一連のガイドラインの必要性をさらに強調しています。その中でも、腸内細菌叢の有意な変動性は、炎症と腫瘍浸透度に焦点を当てた研究の再現性を妨げます 9,10。具体的には、Duncaniella muricolitica や Alistipes okayasuensis 種を含む腸内細菌叢の組成は、DSS 大腸炎の重症度に多大な影響を与える可能性があります13。別の研究では、NLRP3欠損マウスが細菌門バクテロイデス(特にプレボテラ科)およびTM7の存在の増加を特徴とする悪化した大腸炎表現型を示したことを実証することにより、CAC誘導における微生物叢組成の重要性を強調しました10。

この方法の人気にもかかわらず、既存のAOM / DSSプロトコルは、実験グループ32内の動物間で観察される高い変動性という重大な問題に対処していません。この課題に取り組むために、DSS滴定(動物の性別を考慮に入れる)と微生物叢の均質化を実装することにより、プロトコルの最適化と調和に関する一連の推奨事項を提唱しました。私たちのアプローチは、動物系統、実験計画、およびエンドポイントにわたる AOM/DSS モデルのばらつきを減らし、再現性を高めることを目的としています。サンプルサイズに関する具体的な推奨事項を提供することはできませんが、実験反復の数は、特定の研究デザインと各実験の予想される効果量によって導かれます。これらの改良によって達成されるグループ内変動性が低いため、これらの違いを検出する際に同じ統計的検出力を達成するために、各条件でより少ない動物が必要です。これらの改善により、動物の倫理的な使用、研究費の責任ある管理、労働力の削減がさらに促進され、効率の向上につながることが期待されます。

AOM/DSS モデルは、ヒト大腸炎関連結腸直腸癌の研究において重要な翻訳価値を持っています。複雑な病因によるヒト大腸がんのモデル化には課題があることを考えると、AOM/DSS モデルは散発性大腸がんの病因についての洞察を提供する可能性がありますが、炎症関連悪性腫瘍の研究に最も適していることを強調することが重要です。さらに、AOM/DSS 誘発がんは転移の発生率が低いため33,34 であるため、転移の広がりを研究するには不適切です。これらの制限にもかかわらず、AOM/DSS モデルは浸透性が高く、信頼性が高く、ヒトに関連する組織病理学を示し、炎症から異形成、腺癌への疾患の進行を正確に模倣しながら、費用対効果を維持します。このプロトコルでは、既存のワークフローに基づいて再現性のある結果を生成し、交絡因子を最小限に抑えるための推奨事項を提供します8,35。

生物学的変数16,36,37として動物の性別を考慮した用量反応パイロット実験による最適なDSS投与量の同定は、堅牢なAOM / DSSプロトコルを確立するための最初の重要なステップです(図1)。3% DSS を 7 日間投与すると、男性 (~20%) と比較して女性 (~15%) の体重がより有意に減少することがわかりました (図 1B、D)。ただし、雄のマウスは、雌と比較してDSSに対してより、または同等に感受性がある可能性があります。これは、マウスの系統の違いや動物施設間の腸内細菌叢組成の変動に起因する可能性があり、特定の実験セットごとに調整された DSS 濃度の再調整が必要になります。最適な DSS 濃度は、耐容毒性を超えずに結腸の炎症を最大化することと腫瘍誘発との間のトレードオフです。私たちの経験では、このバランスは DSS 用量で達成される可能性が最も高く、最初のサイクル後に約 20% の体重減少をもたらします。動物は治療の2サイクル目で体重減少が少ない傾向がありますが、DSSの3サイクル目では、結腸での腫瘍形成が原因である可能性があります。したがって、25% の体重減少は、施設内の動物使用プロトコルの人道的なエンドポイントとして採用できます。さらに、適切に調整された DSS 大腸炎は、下痢や時折陽性の血球検査ではなく、柔らかいがまだ形成された便ペレットをもたらしますが、便に目に見える血液痕跡が見られる症例はほとんどなく、動物は DSS 投与の中止後 2 週間以内に完全に回復すると予想されます。

DSSは、分子量が36,000〜50,000 Daのポリマーです。DSS製造ではロット間のばらつきがあるため、製品の新しいバッチごとにDSS用量再校正実験を実行することが不可欠です。一貫性を維持するために、同じロットから購入する研究全体に必要なDSSの総量を見積もることが現実的です。さらに、このプロトコルは、CAC誘導中のマウスの実験コホート全体にわたって微生物叢組成を標準化し、潜在的なケージ効果を軽減して変動性を減らすための手順も説明しています。ケージへの影響を最小限に抑えるための追加の予防措置として、可能な限り異なる実験グループの動物を共同収容することをお勧めします。特定の実験目標と倫理的な動物使用ポリシーに応じて、これらの考慮事項をパイロット実験に反映する必要があります。微生物叢のドリフトは、飲料ボトルが漏れている濡れたケージ内の寝具の変更によっても促進される可能性があります。DSSの納品中およびその後5日間はケージの交換は控えたほうがよいでしょう。DSS水投与に50mLチューブを使用すると、漏れのリスクが軽減され、DSSの無駄が最小限に抑えられます。これらのロジスティクス上の考慮事項には、研究スタッフとケージ交換および飼育サービスを行う動物管理技術者との緊密な協力が必要になる場合があります。

このプロトコルでは、組織と細胞の採取、およびデータ収集のための基本的なワークフローも提供します。これには、潜血の存在の検査(図2C)と腫瘍のマッピング(図3A)が含まれます。AOM/DSSモデルは免疫担当マウスに適しており、異種移植アプローチとは対照的に、完全に無傷の免疫系38,39を備えているため、腫瘍免疫微小環境を探索するための理想的なシステムです。特に、細胞型特異的遺伝子ノックイン/アウトまたはレポーターカセットのための遺伝的Cre-Loxシステムを介して、または特定の細胞集団の生着または枯渇を介して、免疫系または間質成分の実験的摂動に適しています。一例として、AOM/DSSモデルと骨髄移植を組み合わせることにより、造血系の変異がCACの重症度と負担をどのように調節するかを以前に調査しました40。このような研究を支援するために、免疫表現型検査、機能アッセイ、単一細胞マルチオミクスなど、さらなる分析に適した生存腫瘍浸潤性白血球を単離するための優れた公開方法があります41。最後に、浸透度が高く、潜伏時間が一貫しているため、AOM/DSS モデルは、総腫瘍量を一次読み出しとして使用する前臨床治療研究に適しています。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、NIH 賞 R01 DK121831 (OAG) および R01 AI067846 (DA) によって部分的に資金提供されました。OAGは、エドワード・P・エヴァンス財団とオックスナード・ファミリー財団からも支援を受けました。DAはメリットソサエティ賞によってサポートされています。UFHCCはNCI指定のがんセンター(P30 CA247796)です。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アゾキシメタン粉末Sigma-AldrichCAS 25843-45-2、Cat# A4586結腸腫瘍を誘発する発がん性物質
卓上マイクロ遠心分離機NA NAサンプル準備用 
C57BL/6Jジャクソン研究所000664特定の研究ごとに適切な株と年齢
コニカルチューブ、50 mLフィッシャー14955239DSS水を投与するには
、デキストラン硫酸ナトリウム塩、MW 約40,000イマンケミカル 23250結腸炎症を誘発する 
エタノール、70%フィッシャー 43655223作業面や解剖ツールを消毒するため
ガラスビーズ、800 & マイクロを研削します。m VWR12621-148結腸/腫瘍組織の均質化を促進するため
HemoCue America Beckman Coulter Hemocult ICT 免疫化学的便潜血検査キットHemoCue America 395065Aカタログ番号 23280010糞便中の潜血検出用
インスリンシリンジ 27GX5/8 1CC BD 3294-12AOM 注射用
Lixit ブロッカーNANAマウスケージへの自動水供給をブロックする (動物施設から提供、無菌)、 
磁気撹拌バーと撹拌プレート NANADSS を溶解する;
マイクロチューブビーズホモジナイザー、BeadBlaster 24 ベンチマークD2400結腸/腫瘍
Lipocalin-2/NGAL DuoSet ELISAR& を均質化するD Systemsカタログ番号 DY1857からリポカリン-2 を検出するには
10%Thermo Fisher Scientific85124溶解腫瘍/結腸組織用
Pierce BCA タンパク質アッセイキットThermo Fisher ScientificA65453全組織溶解物中のタンパク質濃度を定量するため、またはその他の適切な方法
プロテアーゼおよびリン酸阻害剤のカクテル フィッシャー PI78440サイトカイン/タンパク質分析用のサンプルを調製する 
RLTplusバッファーQiagen1053393RNAを単離するため、またはその他の適切なRNA単離方法
RNAlaterThermo Fisher ScientificAM7021RNA単離前に組織サンプルを保存するため
RNeasy Microprep kit QIAGEN74004RNAを単離するため、または必要に応じて他のRNAの単離および精製方法
っ歯類のウォーターボトルノズル(30mm)ビジョンタイプEまたはDSS溶液の投与用
菌ハサミと鉗子NA組織解剖用
シリンジ針、長さ27G x 1/2インチ(ショート)BD 305109結腸スイスロール組織固定用 
シリンジ、ルアーロック、3 mLBD 309657解剖および病期分類の前に結腸を洗い流すため
TapeStationAgilentRNA 濃度および品質/完全性評価用
Teklad 2918Evigo BioproductsT.2918M.15標準げっ歯類食、18% タンパク質、照射
組織カセットVWR#87002-472包埋用サンプルの保存用
トップローディングラボ用天びん、0-220 gNANA動物の体重を量るため
Whatman Blotting PaperVWR InternationalCat# 28298-020肉眼的病理および腫瘍計数のための解剖結腸の病期分類用
マウス ケマウス 糞便サンプル NP-40 溶液、 げ水 滅NA

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